一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组、其LAMP检测试剂盒及其检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810544839.X (22)申请日 2018.05.30 (71)申请人 华南理工大学 地址 510000 广东省广州市天河区五山路 申请人 广州白云山医药集团股份有限公司 白云山制药总厂 (72)发明人 李杉王健松杨佳宁张瑞玲 张雷 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所(普通合伙) 11371 代理人 齐云 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) 。

2、C12N 15/11(2006.01) C12R 1/445(2006.01) (54)发明名称 一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组、 其 LAMP检测试剂盒及其检测方法 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体而言， 提供 一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其包括 有外引物对和内引物对， 其针对金黄色葡萄球菌 上的特定区域， 利用LAMP技术能够扩增金黄色葡 萄球菌上的靶基因， 实现金黄色葡萄球菌的快速 检测， 同时， 提升金黄色葡萄球菌检测结果的准 确率。 此外， 本发明还提供一种包括该LAMP检测 引物组的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒以 及其检测方法， 其能够实现金。

3、黄色葡萄球菌的快 速检测， 具有灵敏度高， 特异性好的优点。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 108570511 A 2018.09.25 CN 108570511 A 1.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其特征在于， 其包括有外引物对和内引物 对， 所述外引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物以及序列SEQ ID No.2所示的下 游引物， 所述内引物对包括序列如SEQ ID No.3的上游引物以及序列如SEQ ID No.4所示的 下游引物。 2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其特征在于， 还包括有环 引物对， 所。

4、述环引物对包括序列如SEQ ID No.5所示的上游引物以及序列如SEQ ID No.6所 示的下游引物。 3.如权利要求1或2所述的LAMP检测引物组在扩增或检测金黄色葡萄球菌中的应用。 4.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 其包括有如权利要求1或2所 述金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组。 5.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 其包括有以 下一种或多种成分： BstDNA聚合酶、 10反应缓冲液、 染料、 dNTPs、 标准阳性模板以及阴性 对照。 6.一种金黄色葡萄球菌的检测方法， 其特征在于， 其包括以下步骤： 利用外引物对和。

5、内 引物对在LAMP反应体系下， 扩增目的基因； 所述外引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物以及序列SEQ ID No.2所示的 下游引物； 所述内引物对包括序列如SEQ ID No.3的上游引物以及序列如SEQ ID No.4所示的下 游引物。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 该检测方法还包括使用环引物对在 LAMP反应体系下， 扩增目的基因； 所述环引物对包括序列如SEQ ID No.5所示的上游引物以及序列如SEQ ID No.6所示 的下游引物。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 在所述LAMP反应体系中， 所述外引物 与所述内引物的摩。

6、尔比为1： (45)； 所述外引物与所述环引物的摩尔比为1： (23)。 9.根据权利要求6或7所述的检测方法， 其特征在于， 在所述LAMP反应体系中， LAMP反应 温度为6067。 10.根据权利要求6或7所述的检测方法， 其特征在于， 在所述LAMP反应体系中， 包括有 镁离子， 所述镁离子的反应浓度为56mM。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108570511 A 2 一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组、 其LAMP检测试剂盒 及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体而言， 涉及一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物 组、 其LAMP检测试剂盒及其检测方。

7、法。 背景技术 0002 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属于微球菌科葡萄球菌属， 是一种革 兰氏阳性球菌， 广泛分布于自然界， 如空气、 水、 人和动物的排泄物中， 是人类化脓性感染和 细菌性中毒中最常见的病原体之一， 可引起局部化脓性感染， 也可引起肺炎、 伪膜性肠炎、 心包炎等， 甚至引起败血症、 脓毒症等全身感染。 近年来， 美国疾病控制中心报告， 由金黄色 葡萄球菌引起的感染占全球感染的第二位， 所以金黄色葡萄球菌所引起的疾病已成为全球 性的公共卫生问题， 严重危害人类安全和健康。 而对于金黄色葡萄球菌的感染的快速检验， 是指导临床感染治疗用药的关键。 0。

8、003 目前对于金黄色葡萄球菌包括耐药菌的检测方法主要是微生物培养及生化鉴定、 免疫检测和各种PCR检测等。 微生物培养及生化鉴定培养方法是检验金黄色葡萄球菌的经 典方法， 存在需要专业的实验室， 操作繁琐， 检测时间长等缺点。 目前， 多采用PCR技术测到 金黄色葡萄球菌， 但因技术对模板的数量和质量都有较高的要求， 需要热循环及凝胶电泳 等设备， 价格相对昂贵， 很难做到现场快速测定。 发明内容 0004 本发明的第一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其利用金黄 色葡萄球菌的特定区域， 进行LAMP， 能够快速、 简便且精准地实现金黄色葡萄球菌的扩增。 0005 本发明。

9、的第二目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒， 其利用上述 LAMP检测引物组进行LAMP， 能够有效缩短检测时间， 提高金黄色葡萄球菌检测的准确率。 0006 本发明的第三目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法， 其利用上述金黄色 葡萄球菌的LAMP检测引物组或其LAMP检测试剂盒进行金黄色葡萄球菌的快速检测， 其具有 灵敏度高， 特异性好的优点。 0007 本发明是这样实现的： 0008 一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其包括有外引物对和内引物对， 外引物 对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物以及序列SEQ ID No.2所示的下游引物， 内引物 对包括。

10、序列如SEQ ID No.3的上游引物以及序列如SEQ ID No.4所示的下游引物。 0009 根据上述的LAMP检测引物组在扩增或检测金黄色葡萄球菌中的应用。 0010 一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒， 其包括有如上述金黄色葡萄球菌的LAMP 检测引物组。 0011 一种金黄色葡萄球菌的检测方法， 其包括以下步骤： 利用外引物对、 内引物对和/ 或环引物对在LAMP反应体系下， 扩增目的基因； 说明书 1/8 页 3 CN 108570511 A 3 0012 外引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物以及序列SEQ ID No.2所示的 下游引物， 内引物对包括序列如。

11、SEQ ID No.3的上游引物以及序列如SEQ ID No.4所示的下 游引物； 环引物对包括序列如SEQ ID No.5所示的上游引物以及序列如SEQ ID No.6所示的 下游引物。 0013 本发明具有以下有益效果： 0014 本发明实施例提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其包括有外引物对和 内引物对， 其针对金黄色葡萄球菌上的特定区域， 利用LAMP技术能够扩增金黄色葡萄球菌 上的靶基因， 实现金黄色葡萄球菌的快速检测， 同时， 提升金黄色葡萄球菌检测结果的准确 率。 此外， 本发明还提供一种包括该LAMP检测引物组的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒 以及其检测方法， 。

12、其能够实现金黄色葡萄球菌的快速检测， 具有灵敏度高， 特异性好的优 点。 附图说明 0015 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当理解， 以下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对 范围的限定， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。 0016 图1为本发明第七实施例中的不同硫酸镁浓度下的LAMP反应颜色变化图； 0017 图2为本发明第七实施例中的不同硫酸镁浓度下的LAMP反应电泳图(其中， M: marker DL2000； C:阴性对照； 1:MgSO4。

13、浓度2mM； 2:3mM； 3:4mM； 4:5mM； 5:6mM； 6:7mM； 7:8mM)； 0018 图3为本发明第八实施例中的LAMP特异性实验结果图(其中， M:marker DL2000； C: 阴性对照； 1:金黄色葡萄球菌ATCC 29213； 2:金黄色葡萄球菌ATCC 25923； 3:金黄色葡萄球 菌ATCC 43300； 4:人葡萄球菌； 5:腐生葡萄球菌； 6:肺炎链球菌； 7:表面葡萄球菌； 8:铜绿假 单胞菌； 9:粪肠球菌)； 0019 图4为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌ATCC 29213灵敏度实验(1:1ng/ L； 2: 100pg/ L； 3:10。

14、pg/ L； 4:1pg/ L； 5:100fg/ L； 6:10fg/ L； 7:1fg/ L)； 0020 图5为为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌ATCC 29213灵敏度实验电泳图(M: marker DL2000； C:阴性对照； 1:1ng/ L； 2:100pg/ L； 3:10pg/ L； 4:1pg/ L； 5:100fg/ L； 6: 10fg/ L； 7:1f g/ L)； 0021 图6为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌ATCC 25923灵敏度实验(1:1ng/ L； 2: 100pg/ L； 3:10pg/ L； 4:1pg/ L； 5:100fg/ L； 6:10。

15、fg/ L； 7:1fg/ L)； 0022 图7为本发明第九实施例中金黄色葡萄球菌ATCC 25923灵敏度实验电泳图(M: marker DL2000； C:阴性对照； 1:1ng/ L； 2:100pg/ L； 3:10pg/ L； 4:1pg/ L； 5:100fg/ L； 6: 10fg/ L； 7:1f g/ L)。 具体实施方式 0023 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、 完整地描述。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建 议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规。

16、产 说明书 2/8 页 4 CN 108570511 A 4 品。 0024 下面对本发明实施例的一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组、 其LAMP检测试剂 盒及其检测方法进行具体说明。 0025 LAMP， Loop-mediated Isothermal amplification， 又称环介导等温扩增技术。 LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物， 利用链置换型DNA聚合酶在恒温 条件下进行扩增反应， 反应能产生大量的扩增产物， 即焦磷酸镁白色沉淀， 通过肉眼观察白 色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。 0026 本发明实施例采用环介导等温扩增(LAMP)技术， 并针对金黄。

17、色葡萄球菌的耐热核 酸酶基因(nuc)设计了LAMP检测引物组。 0027 本发明实施例提供的一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其包括有外引物对 和内引物对， 外引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物以及序列SEQ ID No.2所示 的下游引物， 内引物对包括序列如SEQ ID No.3的上游引物以及序列如SEQ ID No.4所示的 下游引物。 0028 进一步地， 在本发明的一些实施例中， 金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组还可以 包括有环引物对， 环引物对包括序列如SEQ ID No.5所示的上游引物以及序列如SEQ ID No.6所示的下游引物。 环引物对可以在。

18、外引物对以及内引物对的基础上增加LAMP扩增反应 的速率， 有效提高目的基因的扩增效率。 0029 本发明实施例提供上述金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组在扩增或检测金黄色 葡萄球菌中的应用。 具体地， 其包括将上述金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组进行PCR反应 或LAMP反应以扩增或检测金黄色葡萄球菌。 0030 本发明实施例还提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒， 其包括有上述金黄 色葡萄球菌的LAMP检测引物组。 0031 进一步地， 在本发明的一些实施例中， LAMP检测试剂盒包括有以下一种或多种成 分： BstDNA聚合酶、 10反应缓冲液、 染料、 dNTPs、 标准阳性模。

19、板以及阴性对照。 0032 进一步地， 在本发明的一些实施例中， 10反应缓冲液包括有以下一种或多种成 分： 10buffer缓冲液、 甜菜碱、 dNTPs以及硫酸镁。 0033 其中， 10buffer缓冲液可以包括有200mM Tris-HCl、 pH 8.8、 100mM(NH4)2SO4、 500mM KCl、 20mM MgSO4以及0.1Triton X-100； 染料为浓度3mM的羟基萘酚蓝染料HNB； 标 准阳性模板为金黄色葡萄球菌标准菌株基因组DNA； 阴性对照为灭菌超纯水。 0034 此外， 本发明实施例还提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法， 其包括有以下步骤： 利用外引物对。

20、和内引物对在LAMP反应体系下， 扩增目的基因； 0035 外引物对包括序列如SEQ ID No.1所示的上游引物nuc-F3以及序列SEQ ID No.2 所示的下游引物nuc-B3； 0036 内引物对包括序列如SEQ ID No.3的上游引物nuc-FIP以及序列如SEQ ID No.4所 示的下游引物nuc-BIP； 0037 进一步地， 在本发明的一些实施例中， 还包括使用环引物对在LAMP反应体系下， 扩 增目的基因； 0038 环引物对包括序列如SEQ ID No.5所示的上游引物以及序列如SEQ ID No.6所示 的下游引物。 说明书 3/8 页 5 CN 108570511。

21、 A 5 0039 进一步地， 在本发明的一些实施例中， 在上述LAMP反应体系中， 外引物与内引物的 摩尔比为1： (45)； 进一步地， 外引物与环引物的摩尔比为1： (23)。 该摩尔比能够增加目 的基因在LAMP扩增反应的速率和稳定性。 0040 进一步地， 在本发明的一些实施例中， 在上述LAMP反应体系中， LAMP的反应温度为 6067， 优选地， 反应温度为65。 在该反应温度下， 上述金黄色葡萄球菌的LAMP检测 引物组能够高效、 快速地扩增目的基因， 即在该反应温度下， 能够得到一个更加清晰的扩增 结果或实验结果。 0041 LAMP扩增反应： 0042 首先， 配制LAM。

22、P反应体系： BstDNA聚合酶、 10buffer缓冲液、 染料、 dNTPs、 甜菜 碱、 镁离子、 金黄色葡萄球菌引物组、 以及待测样品的基因组DNA， 用灭菌超纯水补至25 L， 同时设置阳性对照和阴性对照， 将配制好的溶液放置于反应管或检测管中， 混匀后置于60 67温度下反应30min， 并于80中断反应。 0043 然后， 将上述反应管置于比色卡中， 根据颜色变化来判断， 检测结果呈蓝色， 检测 结果判定为阳性， 即检测样品中含有金黄色葡萄球菌； 若检测结果呈紫色， 检测结果判定为 阴性， 即检测样品中不含有金黄色葡萄球菌。 0044 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的。

23、详细描述。 0045 第一实施例 0046 本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其包括有外引物对和内引 物对。 0047 外引物对包括有上游引物nuc-F3和下游引物nuc-B3， 序列如下: 0048 nuc-F3:5 -TCGAGTTTGACAAAGGTCA-3 ； 0049 nuc-B3:5 -GTTGTCTTCGCTCCAAAT-3 ； 0050 内引物对包括有上游引物nuc-FIP和下游引物nuc-BIP， 序列如下: 0051 nuc-FIP:5 -TGACGAACTAAAGCTTCGTTTACC-CTGATAAATATGGACGTGGC-3 ； 0052 nuc。

24、-BIP:5-GGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGT-TTTTTCGCTTGTGCTTCAC-3 ； 0053 进一步地， 在本实施例中， LAMP检测引物组还包括环引物对。 环引物对包括有上游 引物nuc-LF和下游引物nuc-LB， 序列如下: 0054 nuc-LF:5 -CCATCAGCATAAATATACGCT-3 ； 0055 nuc-LB:5 -CCTAACAATACACATGAACAAC-3 。 0056 第二实施例 0057 本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒。 0058 具体地， LAMP检测试剂盒包括有反应预混液和检测管。 反应预混液包括有BstD。

25、NA 聚合酶8U、 10Buffer缓冲液2.5 L(200mM Tris-HCl， pH 8.8， 100mM(NH4)2SO4， 500mM KCl， 20mM MgSO4， 0.1Triton X-100)、 HNB染料1 L、 dNTPs1.6mM、 甜菜碱0.8M、 硫酸镁6mM、 模板 DNA 1 L、 以及第一实施例提供的金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 在上述反应预混液中 加入灭菌超纯水制备成25 L检测溶液放入检测管中。 0059 第三实施例 0060 本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法。 0061 该检测方法包括以下步骤： 利用第一实施例提供的外引物对、 内引物对。

26、和环引物 说明书 4/8 页 6 CN 108570511 A 6 对在LAMP体系下， 扩增目的基因。 0062 具体如下： 0063 首先， 提取待测样品的DNA： 取待测样品1ml进行12000rpm离心3min， 并取沉淀， 向 沉淀中加入5075 L无菌水重悬， 然后放置95100中保温10min， 冷却后12000rpm离 心1min， 取上清液， 放置于4保存备用。 0064 然后， 利用第一实施例提供的检测引物组进行LAMP扩增， 在LAMP反应体系中， 外引 物和内引物的摩尔比为1： 4； 外引物与环引物的摩尔比为1： 2。 0065 LAMP反应体系中包括有： BstDNA。

27、聚合酶8U、 10Buffer缓冲液2.5 L(200mM Tris- HCl， pH 8.8， 100mM(NH4)2SO4， 500mM KCl， 20mM MgSO4， 0.1Triton X-100)、 HNB染料120 M、 dNTPs1.6mM、 甜菜碱0.8M、 硫酸镁6mM、 模板DNA 1 L、 以及第一实施例提供的金黄色葡萄 球菌的LAMP检测引物组(外引物对的上游引物0.4 M和下游引物0.4 M， 内引物对的上游引 物1.6 M和下游引物1.6 M， 环引物对的上游引物0.8 M和下游引物0.8 M)， 在上述反应预混 液中加入灭菌超纯水制备成25 L检测溶液放入检测管。

28、中。 0066 取1 L上述含有待测样品的DNA的上清液， 加入至检测管中， 65反应30min。 0067 最后， 将检测管在比色卡背景下观察反应液颜色， 蓝色则说明样品中含有金黄色 葡萄球菌， 紫色则说明样品中没有金黄色葡萄球菌。 0068 第四实施例 0069 本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法。 该检测方法与第三实施例提供的 检测方法大致相同， 区别在于： 在LAMP反应体系中， 第一实施例提供的LAMP检测引物组的外 引物和内引物的摩尔比为1:5； 外引物与环引物的摩尔比为1:2， 即外引物0.4 M、 内引物2.0 M以及环引物0.8 M； 0070 LAMP反应温度为66；。

29、 0071 镁离子(硫酸镁)的浓度为5mM。 0072 第五实施例 0073 本实施例提供一种金黄色葡萄球菌的检测方法。 该检测方法与第三实施例提供的 检测方法大致相同， 区别在于： 在LAMP反应体系中， 第一实施例提供的LAMP检测引物组的外 引物和内引物的摩尔比为1:4； 外引物与环引物的摩尔比为1:3， 即外引物0.4 M、 内引物1.6 M以及环引物1.2 M。 0074 LAMP反应温度为65； 0075 镁离子(硫酸镁)的浓度为6mM。 0076 第六实施例 0077 验证第三四实施例提供的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法中， LAMP检测引物组 的外引物、 内引物以及环引物的最。

30、优摩尔比。 0078 1.实验方法 0079 采用第三五实施例提供的的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法检测提取的含金 黄色葡萄球菌的待测样品DNA。 0080 具体地， 在25 L的LAMP体系中， 具体成分为10Buffer 2.5 L， dNTPs(10mM)4 l (终浓度1.6mM)， 甜菜碱(5M)4 L(终浓度0.8M)， MgSO4(50mM)3 L(终浓度6mM)， Bst DNA聚合 酶1 L， HNB染料(3mM)1 l(终浓度120 M)， DNA模板1 L， DEPC水补足体系。 外设置阴性对照， 说明书 5/8 页 7 CN 108570511 A 7 用1 L DE。

31、PC水代替DNA模板。 0081 设置15组引物比例， 其外引物： 环引物： 内引物比例分别为1:1:2、 1:1:3、 1:1:4、 1: 1:5、 1:1:6、 1:2:2、 1:2:3、 1:2:4、 1:2:5、 1:2:6、 1:3:2、 1:3:3、 1:3:4、 1:3:5、 1:3:6， 具体请 参照附图1。 外引物浓度为0.4 M， 环引物和内引物的浓度随比例相应变化。 0082 2.实验结果 0083 表1第六实施例的不同引物比例的LAMP反应结果 0084 引物比例1:1:21:1:31:1:41:1:51:1:6 LAMP结果- 引物比例1:2:21:2:31:2:41。

32、:2:51:2:6 LAMP结果-+- 引物比例1:3:21:3:31:3:41:3:51:3:6 LAMP结果-+- 0085 备注： ( “-” 表示反应成阴性，“+” 表示反应呈阳性) 0086 由表1可知， 当引物比例为1:2:4、 1:2:5和1:3:4、 1:3:5时， 能够产生LAMP扩增反 应， 其他引物比例均没有发生反应， 说明当外引物： 环引物： 内引物为1： (13)： (26)时， 能够进行LAMP反应。 0087 第七实施例 0088 验证第三五实施例提供的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法中， 硫酸镁的最优浓 度。 0089 MgSO4对于扩增反应的进行有重要作用， 。

33、太高或太低的浓度可能都会影响扩增反 应进行。 在使用HNB羟基萘酚蓝显色指示的LAMP体系中， MgSO4溶液浓度越大， 反应液的颜色 将会越偏紫红色， 浓度过低时， 反应液在反应前即呈蓝色， 失去反应指示作用。 同时dNTPs的 浓度也会影响反应液的颜色， dNTPs的浓度越高， 反应液颜色越偏蓝， 本LAMP体系保持dNTPs 的浓度不变， 对MgSO4的浓度进行了优化。 此处所指优化的MgSO4溶液浓度不包括10Buffer 中的MgSO4。 0090 1.实验方法 0091 采用第三、 四实施例提供的金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法检测。 0092 具体地， 在25 L的LAMP体系中。

34、， 具体成分为10Buffer 2.5 L， dNTPs(10mM)4 l (终浓度1.6mM)， 甜菜碱(5M)4 l(终浓度0.8M)， Pirmer mix 1 L， Bst DNA聚合酶1 L， HNB染 料(3mM)1 l(终浓度120 M)， DNA模板1 L。 MgSO4(50mM)终浓度分别为2mM、 3mM、 4mM、 5mM、 6mM、 7mM、 8mM(如表2)， 最后加入DEPC水补足体系。 另外设置阴性对照， 用1 L DEPC水代替 DNA模板， MgSO4浓度设为6mM。 0093 表2 LAMP反应不同的硫酸镁浓度 说明书 6/8 页 8 CN 10857051。

35、1 A 8 0094 0095 观察并记录反应前后反应液的颜色变化， 反应结束后进行1琼脂糖凝胶电泳鉴 定。 取5 L的LAMP产物与2 L10Loading buffer混合均匀后， 上样。 分析反应结果确定硫酸 镁最佳浓度， 实验结果如附图2所示。 0096 2.实验结果 0097 在反应前， 加入了HNB染料的反应液颜色因为硫酸镁的浓度变化而有所不同， 随着 硫酸镁浓度从2mM增加到8mM,颜色从蓝色逐渐偏向紫红色(由于要求附图不能有彩色， 这里 颜色变化无法在图中明显展现， 采取文字方法说明)。 0098 反应后， 根据电泳图， 请参照附图2， 当硫酸镁浓度为2mM和3mM时， 硫酸镁。

36、浓度浓度 过低而没有发生LAMP扩增反应， 电泳结果没有出现LAMP反应的典型梯状条带。 当硫酸镁浓 度达到4mM之后， 电泳开始出现梯形条带， 并且条带随浓度增大而越来越清晰， 说明硫酸镁 浓度在57mM时能够实现稳定高效的LAMP反应。 0099 但硫酸镁浓度越高， HNB染料的变色效应则会变弱(图1)， 因此综合LAMP反应和显 色反应的灵敏程度， 因此， 将硫酸镁浓度设为5mM6mM， 既能保证LAMP反应高效进行又有明 显的颜色差距， 又利于使用肉眼直接判断LAMP反应的发生。 0100 第八实施例 0101 验证第一实施例中金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组的特异性。 0102 1。

37、.实验方法 0103 本实验选取金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)， 金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)， 金黄 色葡萄球菌(ATCC 43300)， 肺炎链球菌(ATCC 49619)， 腐生葡萄球菌(ATCC 49453)， 表皮葡 萄球菌(ATCC 49134)， 人葡萄球菌(ATCC 27844)， 屎肠球菌(ATCC 19434)， 粪肠球菌(ATCC 19433)， 大肠埃希氏杆菌(ATCC 35150)， 铜绿假单胞菌(ATCC 15442)所提取的DNA用于LAMP 检测。 0104 采用第三四实施例提供的检测方法检测。 具体为， 在25 L的LAMP体系中， 具体成 。

38、分为10Buffer 2.5 L， dNTPs(10mM)4 l(终浓度1.6mM)， 甜菜碱(5M)4 L(终浓度0.8M)， MgSO4(50mM)3 L(终浓度6mM)， Pirmer mix 1 L， Bst DNA聚合酶1 L， HNB染料(3mM)1 l(终 浓度120 M)， DNA模板1 L， 最后加入DEPC水补足体系。 外设置阴性对照， 用1 L DEPC水代替 DNA模板。 0105 根据添加的HNB染料为依据， 发生LAMP反应则溶液变为蓝色， 未反应溶液和阴性对 照为紫色不变。 反应结束后进行1琼脂糖凝胶电泳鉴定， 结果请参照附图3， 电泳图中发生 LAMP反应的样品。

39、呈现梯形条带， 未反应样品没有梯形条带。 0106 2.实验结果 0107 由图3可知， 金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)， 金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)， 金黄 说明书 7/8 页 9 CN 108570511 A 9 色葡萄球菌(ATCC 43300)DNA出现了LAMP扩增反应， 电泳结果出现明显的梯状电泳带。 肺炎 链球菌(ATCC 49619)， 腐生葡萄球菌(ATCC 49453)， 表皮葡萄球菌(ATCC 49134)， 人葡萄球 菌(ATCC 27844)， 粪肠球菌(ATCC 19433)， 铜绿假单胞菌(ATCC 15442)所提取的DNA并没有 发生LAM。

40、P反应。 说明第一实施例提供的LAMP检测引物组具有特异性。 0108 第九实施例 0109 验证第一实施例中金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组或第二实施例提供的LAMP 检测试剂盒的灵敏性。 0110 1.实验方法 0111 使用试剂盒提取金黄色葡萄球菌ATCC 29213和ATCC 25923的DNA， 测定DNA溶液浓 度并稀释下列浓度： 1ng/ L、 100pg/ L、 10pg/ L、 1pg/ L、 100fg/ L、 10fg/ L、 1fg/ L。 采用 第三或四实施提供的检测方法进行LAMP检测。 0112 具体地， 在LAMP体系中， 具体成分为10Buffer 2.5 。

41、L， dNTPs(10mM)4 l(终浓度 1.6mM)， 甜菜碱(5M)4 L(终浓度0.8M)， MgSO4(50mM)3 L(终浓度6mM)， Pirmer mix 1 L， Bst DNA聚合酶1 L， HNB染料(3mM)1 l(终浓度120 M)， DNA模板1 L， 最后加入DEPC水补足体系。 外设置阴性对照， 用1 L DEPC水代替DNA模板。 0113 LAMP实验后， 将上述LAMP反应溶液进行电泳实验。 金黄色葡萄球菌ATCC 29213的 灵敏度实验如图4所示， 其电泳实验如图5所示。 金黄色葡萄球菌ATCC 25923的灵敏度实验 如图6所示， 其电泳实验如图7所。

42、示。 0114 根据添加的HNB染料为依据， 发生LAMP反应则溶液变为蓝色， 未反应溶液和阴性对 照为紫色不变。 电泳胶图中发生LAMP反应的样品呈现梯形条带， 未反应样品没有梯形条带。 0115 2.实验结果 0116 由反应液颜色变化和电泳图显示， 金黄色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923均在 DNA添加量为1ng/ L、 100pg/ L、 10pg/ L、 1pg/ L时发生扩增反应， 反应后颜色由紫变蓝， 电 泳胶图中出现梯形条带。 第三四实施例提供的LAMP检测方法中LAMP体系对于金黄色葡萄 球菌的DNA检出限为1pg/ L。 0117 综上所述， 本发明实施例提供。

43、一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组， 其包括有 一对外引物和一对内引物， 其针对金黄色葡萄球菌上的特定区域， 利用LAMP技术能够扩增 金黄色葡萄球菌上的靶基因， 实现金黄色葡萄球菌的快速检测， 同时， 提升金黄色葡萄球菌 检测结果的准确率。 此外， 本发明还提供一种包括该LAMP检测引物组的金黄色葡萄球菌的 LAMP检测试剂盒以及其检测方法， 其能够实现金黄色葡萄球菌的快速检测， 具有灵敏度高， 特异性好的优点。 0118 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改。

44、、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 8/8 页 10 CN 108570511 A 10 SEQUENCE LISTING 华南理工大学和广州白云山制药集团股份公司白云山制药总厂 一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组合物、 其LAMP检测试剂盒及其检测方 法 6 PatentIn version 3.5 1 19 DNA 人工序列 1 tcgagtttga caaaggtca 19 2 18 DNA 人工序列 2 gttgtcttcg ctccaaat 18 3 44 DNA 人工序列 3 tgacgaacta aagcttcgtt taccctgata aa。

45、tatggacg tggc 44 4 42 DNA 人工序列 4 ggcttggcta aagttgctta tgttttttcg cttgtgcttc ac 42 5 21 DNA 人工序列 5 ccatcagcat aaatatacgc t 21 6 22 序列表 1/2 页 11 CN 108570511 A 11 DNA 人工序列 6 cctaacaata cacatgaaca ac 22 序列表 2/2 页 12 CN 108570511 A 12 图1 图2 说明书附图 1/3 页 13 CN 108570511 A 13 图3 图4 图5 说明书附图 2/3 页 14 CN 108570511 A 14 图6 图7 说明书附图 3/3 页 15 CN 108570511 A 15 。