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1、(10)授权公告号 CN 102424822 B (45)授权公告日 2013.01.09 CN 102424822 B *CN102424822B* (21)申请号 201110453531.2 (22)申请日 2011.12.30 C12N 15/10(2006.01) (73)专利权人 中国科学院武汉植物园 地址 430074 湖北省武汉市武昌磨山 (72)发明人 彭俊华 张玲玲 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 黄瑞棠 (54) 发明名称 油桐幼叶基因组 DNA 提取方法 (57) 摘要 本发明公开了一种油桐幼叶基因组 DNA 提取 方法， 涉及分子生物学实。
2、验中植物基因组 DNA 分 离提取技术。 本方法主要包括预处理叶片组织样、 细胞的破碎、 非DNA成分的抽提、 DNA的析出、 离子 的去除和组织样品的循环提取。本发明使用洗液 预处理油桐幼叶组织样 3 次， 能有效地去除叶片 内富含的蛋白、 多酚、 多糖等次生代谢产物 ； 本发 明对油桐幼叶组织样进行循环提取， 该步骤在传 统基因组DNA提取方法中是不存在的， 本方法1份 组织样可进行 4 次基因组 DNA 提取， 使基因组 DNA 产量显著提高 ； 本发明能从长期低温储存的幼叶 中， 以及不同生长温度下采集的新鲜幼叶中提取 到高产量和高质量的基因组 DNA。本发明适用于 油桐幼叶基因组 D。
3、NA 的提取。 (51)Int.Cl. 审查员 张锦广 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种油桐幼叶基因组 DNA 提取方法， 其特征在于包括下列步骤 ： 将鲜叶或干样的幼叶组织样品在液氮速冻下磨成细粉后， 取 0.3g 鲜叶细粉或 0.1g 干样细粉转入 2mL 离心管中 ； 加入 1.5mL 洗液， 充分混匀后， 冰中静止 15min， 12000rpm 离心弃上清液 ； 重复步骤两次后， 加入 500l 预热的 3%CTAB 提取液， 充分混匀。
4、， 65水浴 40min ； 12000rpm 常温离心 15min， 转移上清液到新的 1.5mL 离心管中， 加入 100l 的 24:1 的氯仿 - 异戊醇， 充分混匀后， 常温 12000rpm 离心 15min， 抽提 1 2 次， 抽提后的上清 液转入新的离心管中， 加入两倍体积的提前预冷到 -20的 100% 酒精 ； 放置于 -20冰柜 30min， 让 DNA 沉淀充分析出， 将析出的 DNA 沉淀转移到含有 1mL 70% 酒精的 1.5mL 离心管 中， 漂洗 1 2 次， 每次 30min， 倒干酒精， 待 DNA 沉淀干燥后， 用 100l 的 T0.1E 充分溶解，。
5、 并用 1l 浓度为 10g/mLRNA 酶 37消化 30min， 该过程得到的 DNA 样品， 称为 1stDNA ； 对步骤中转移上清液后离心管底部的组织样品， 继续加入 500l 的 3%CTAB 提取 液进行提取， 该组织样共循环提取4次， 依此又得到3批次DNA样品， 分别称为2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA ； 所述的洗液的成分为 ： 50mM Tris-HCl， 5mM EDTA， 350mM山梨醇， 2%PVP， 0.5%-巯基乙 醇， pH 值为 8.0 ； 所述的 3%CTAB 提取液成分为 ： 3%CTAB， 100mM Tris-HCl， 20mM ED。
6、TA,1.4MNaCl， 2%PVP， 0.5%- 巯基乙醇， pH 值为 8.0 ； 所述的 T0.1E 成分为 ： 10mM Tris-HCl， 0.1mM EDTA， pH 8.0。 权 利 要 求 书 CN 102424822 B 2 1/5 页 3 油桐幼叶基因组 DNA 提取方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学实验中植物基因组 DNA 分离提取技术， 尤其涉及一种油桐 幼叶基因组 DNA 提取方法。 背景技术 0002 基因组 DNA 的提取是分子生物学实验很重要的一个环节。基因组 DNA 的质量和产 量， 直接影响分子生物实验中与 DNA 有关的后续实验的进行。药用植物。
7、、 芳香族植物及木本 植物富含次生代谢产物 ； 对这一类富含次生代谢产物的植物， 传统的 DNA 提取方法不易提 到高质量的基因组DNA。 这类植物叶片内次生代谢产物的种类极其复杂， 且不同物种间甚至 同一物种间不同季节， 不同叶龄的叶片间次生代谢产物的异质性程度都较高 ； 因此， 一种植 物的基因组 DNA 提取方法往往不能很好地应用于另一种植物基因组 DNA 的提取。 0003 油桐原产于中国， 具有极高的工业价值。从油桐桐果中提取的桐油是我国传统的 大宗出口创汇物资。在我国， 桐油主要用于油墨和涂料的生产。现今， 能源危机不断加剧， 环境问题日益严重， 对可持续的新型清洁能源的需求迫在眉。
8、睫。 油桐被选为能源植物物种， 从油桐果实中提取的桐油可作为生产生物柴油的原料。 因此用先进的分子生物学手段深入 的研究油桐资源将对选育高产品种以及将桐油转化为生物柴油提供理论依据和技术支持。 目前油桐资源分子方面的研究还处于起步阶段， 提取高质量高产量的油桐基因组 DNA 是开 展一系列后续分子生物学实验的基础。油桐叶片富含多糖、 单宁、 蛋白及多酚类物质， 这些 次生代谢产物影响油桐基因组 DNA 的提取。而物种间次生代谢产物的异质性致使其它物种 基因组 DNA 的提取方法并不是油桐基因组 DNA 的最佳提取方法。研究发现油桐叶片的叶龄 影响油桐基因组 DNA 的提取。 0004 经检索，。
9、 到目前为止， 现有技术中还没有专门针对油桐幼叶基因组 DNA 提取方法 的报道。 发明内容 0005 本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足， 针对油桐幼叶富含多糖、 单宁、 多酚及蛋白的特点， 提出了一种油桐幼叶基因组 DNA 提取方法 ( 简称方法 )。 0006 本发明的目的是这样实现的 ： 0007 1、 本方法包括下列步骤 ： 0008 将幼叶组织样品在液氮速冻下磨成细粉后， 取 0.3g 鲜叶或 0.1g 干样转入 2mL 离心管中 ； 0009 加入 1.5mL 洗液， 充分混匀后， 冰中静止 15min， 12000rpm 离心弃上清液 ； 0010 重复步骤两次后，。
10、 加入 500l 预热的 3 CTAB 提取液， 充分混匀， 65水浴 40min ； 0011 12000rpm 常温离心 15min， 转移上清液到新的 1.5mL 离心管中， 加入 100l 的 24 1 的氯仿 - 异戊醇， 充分混匀后， 常温 12000rpm 离心 15min， 抽提 1 2 次， 抽提后的 说 明 书 CN 102424822 B 3 2/5 页 4 上清液转入新的离心管中， 加入两倍体积的提前预冷到 -20的 100酒精 ； 放置于 -20 冰柜 30min， 让 DNA 沉淀充分析出， 将析出的 DNA 沉淀转移到含有 1mL 70酒精的 1.5mL 离 心管。
11、中， 漂洗 1 2 次， 每次 30min， 倒干酒精， 待 DNA 沉淀干燥后， 用 100l 的 T0.1E 充分溶 解， 并用1l浓度为10g/mLRNA酶37消化30min， 该过程得到的DNA样品， 称为1stDNA ； 0012 对步骤中转移上清液后离心管底部的组织样品， 继续加入500l的3CTAB 提取液进行提取， 该组织样共循环提取 4 次， 依此又得到 3 批次 DNA 样品， 分别称为 2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA。 0013 所述 100酒精是指纯的酒精溶液。 0014 所述 70酒精是指 70mL 纯酒精用无菌纯净水定容到 100mL 的酒精溶液。 。
12、0015 本发明所提取的多批次 DNA 样品中， 高生长温度下 (30-37 ) 采集的未低温储存 幼叶 1stDNA、 2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA 产量较高， 浓度大致为 300 800ng/l 之间。 0016 本发明所提取的多批次 DNA 样品中， 长久低温储存及低生长温度下采集的幼叶 1stDNA 产量低， 纯度差， 水浴后可弃掉离心产生的上清液， 直接进行后续的 3 次 DNA 的提取 ； 而 2ndDNA、 3rdDNA， 4thDNA 产量高， 浓度大致为 100 700ng/l 之间。 0017 本发明所使用的洗液的成分为 ： 50mM Tris-HCl， 。
13、5mM EDTA， 350mM山梨醇， 2PVP， 0.5 - 巯基乙醇， PH 值为 8.0。 0018 所述的 2是指 2g/100mL， 所述的 0.5是指 0.5mL/100mL。 0019 本发明所使用的 3 CTAB 提取液成分为 ： 3 CTAB， 100mM Tris-HCl， 20mM EDTA， 1.4M NaCl， 2 PVP， 0.5 - 巯基乙醇， pH 值为 8.0。 0020 所述的 3是指 3g/100mL， 所述的 2是指 2g/100mL， 0021 所述的 0.5是指 0.5mL/100mL。 0022 本发明所使用的 T0.1E 成分为 ： 10mM T。
14、ris-HCl， 0.1mM EDTA， pH 8.0。 0023 工作原理 ： 油桐幼叶中富含的次生代谢产物， 例如多糖、 单宁、 多酚等在 DNA 提取 过程中与 DNA 共分离或抑制 DNA 的提取等。在用 3 CTAB 提取液裂解细胞前， 先用洗液反 复预处理液氮研磨的叶片组织样， 前后共处理3次， 可大量除去干扰DNA分离的次生代谢产 物。预处理后的幼叶组织样加入 3 CTAB 提取液在 65下裂解细胞， 离心转移的上清再经 过氯仿 ： 异戊醇的萃取、 酒精的沉淀， 得到絮状的 DNA 沉淀， 最后利用 70乙醇洗涤 DNA 沉 淀， 得到第 1 次 DNA 沉淀， 即 1stDNA。
15、。而离心转移上清后位于离心管底部的组织样可继续加 3 CTAB 提取液， 进行新一轮的 DNA 提取， 依此组织样共循环提取 4 次， 又得到 3 批次 DNA 样本。本发明可分离到高质量 ( 少多糖、 少多酚、 少色素和蛋白质等 )、 高产量 (1 份组织样 得到 4 批次 DNA 沉淀 ) 的油桐基因组 DNA， 满足分子生物学实验对 DNA 浓度和质量的要求。 0024 2、 油桐基因组 DNA 的鉴定 0025 本方法提取的油桐基因组 DNA 样品， 可经 0.8的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光 度计检测其浓度和质量。 0026 3、 本方法的用途 0027 本方法可以从油桐幼叶鲜样和干样。
16、中提取高产量高质量的基因组 DNA。长久低温 储存状况下(-70)的油桐幼叶和低的生长温度下(15-25)采集的油桐幼叶， 叶内化 学成分发生质的改变， 致使本方法四次循环提取中第 1 次提取得到的基因组 DNA 产量非常 低 ( 琼脂糖凝胶检测不到 )， 纯度也差 (260/280 1.8)， 而后续三次得到的基因组 DNA 产 说 明 书 CN 102424822 B 4 3/5 页 5 量较高， 纯度好， 故组织样只提取 1 次的传统方法较难从长久低温储存的油桐幼叶和低的 生长温度下采集的油桐幼叶中提取到高产量和高质量的基因组 DNA ； 但本方法可克服这种 长久低温储存和低的生长温度对。
17、幼叶 DNA 提取的影响， 后 3 次提取能较好地得到高产量高 质量的基因组 DNA， 满足分子生物学后续实验对 DNA 浓度和质量的要求。 0028 本发明具有下列优点和积极效果 ： 0029 本方法中的洗液， 先后处理油桐幼叶组织样 3 次， 能有效地去除叶片内富含的 多酚、 多糖、 单宁等次生代谢产物 ； 0030 本方法中循环提取的步骤是传统基因组 DNA 提取方法中所没有的， 1 份组织样 可进行 4 次基因组 DNA 提取， 得到 4 次基因组 DNA 样本， 使基因组 DNA 产量显著提高 ； 0031 本方法能从长期低温 (-70 ) 储存的幼叶和低的生长温度下 (15 -25。
18、 ) 采 集的油桐幼叶中提取到高质量高产量的基因组 DNA。 0032 本发明适用于油桐幼叶基因组 DNA 的提取。 附图说明 0033 图 1 是用本方法提取的低温生长的油桐幼叶混合样鲜样基因组 DNA 的电泳图片 (11 月份， 气温 20左右， 10 个基因型的混合样 ) ； 0034 图中 ： 1、 2、 3、 4 分别为 1st、 2nd、 3rd、 4thDNA 的电泳图片， 设置 2 个重复。 0035 图 2 是图一所述叶片硅胶干燥处理的情况， 设置 3 个重复。 0036 图 3 是用本方法提取的高生长温度下采集的油桐 6 个基因型幼叶鲜样基因组 DNA 的电泳图片 (7 月。
19、份， 气温 37左右 ) ； 0037 图中 ： 1、 2、 3、 4 分别为 1st、 2nd、 3rd、 4thDNA 的电泳图片， 设置 2 个重复， A、 B、 C、 D、 E、 F 代表 6 个基因型。 0038 图 4 是用本方法提取的低温储存 1 年的高生长温度下采集的幼叶混合样基因组 DNA 的电泳图片 (7 月份， 气温 37左右， 10 个基因型的混合样 ) ； 0039 图中 ： 1、 2、 3、 4 分别为 1st、 2nd、 3rd、 4thDNA 的电泳图片， 设置 2 个重复。 0040 英译汉 ： 0041 1、 CTAB ： Cetyltrimethyl Am。
20、monium Bromide， 十六烷基三甲基溴化铵 ； 0042 2、 EDTA ： Ethylene Diamine Tetraacetic Acid， 乙二胺四乙酸 ； 0043 3、 PVP ： Polyvinyl Pyrrolidone， 聚乙烯吡咯烷酮 ； 0044 4、 -Mercaptoethanol ： 巯基乙醇。 具体实施方式 0045 下面结合附图和实施例详细说明 ： 0046 一、 提取方法 0047 选取生长温度 20左右 (11 月份 ) 采集的油桐幼叶混合样鲜样 2 份和干样 3 份， 以及气温37生长温度下采集的低温储存1年的油桐幼叶混合样2份和未经低温储存的油。
21、 桐 6 个基因型幼叶鲜样各两份， 使用本发明方法进行下述 19 次提取作业 ： 0048 在液氮中将叶片组织样品充分研磨成粉末， 迅速称取 0.3g 鲜叶， 或 0.1g 干样， 快速转移到 2mL 离心管中。放入 -70冰箱， 待用 ； 说 明 书 CN 102424822 B 5 4/5 页 6 0049 加入 1.5mL 洗液， 充分混匀后， 冰中静止 15min， 12000rpm 离心弃上清液 ； 0050 重复步骤两次后， 加入 500l 预热的 3 CTAB 提取液， 充分混匀， 65水浴 40min ； 0051 12000rpm 常温离心 15min， 转移上清液到新的 1。
22、.5mL 离心管中， 加入 100l 的 24 1 的氯仿 - 异戊醇， 充分混匀后， 常温 12000rpm 离心 15min， 抽提 2 次， 抽提后的上清 液转入新的离心管中， 加入两倍体积的提前预冷到 -20的 100酒精 ； 放置于 -20冰柜 30min， 让 DNA 沉淀充分析出， 将析出的 DNA 沉淀转移到含有 1mL 70酒精的 1.5mL 离心管 中， 漂洗 2 次， 每次 30min， 倒干酒精， 待 DNA 沉淀干燥后， 用 100l 的 T0.1E 充分溶解， 并用 1l 浓度为 10g/mL RNA 酶 37消化 30min， 该过程得到的 DNA 样品， 称为 。
23、1stDNA ； 0052 对步骤中转移上清液后离心管下部的组织样品， 继续加预热的 CTAB 提取液， 充分混匀， 进行新一轮的 DNA 提取步骤， 这个过程中得到的 DNA 样品为 2ndDNA， 依此循环又 得到 3rdDNA 和 4thDNA。 0053 二、 琼脂糖凝胶电泳法检测本方法提取的油桐幼叶基因组 DNA 0054 如图 1， 本方法对 11 月份气温 20左右采集的油桐幼叶鲜样提取的 4 次 DNA， 1stDNA 在琼脂糖上没有检测到条带， 2nd、 3rd、 4thDNA 均检测到清晰且明亮的电泳条带。说明 本方法适合低温度下生长的油桐幼叶鲜叶基因组 DNA 的提取。 。
24、0055 如图 2， 本方法对 11 月份气温 20左右采集的油桐幼叶经硅胶干燥后提取的 4 次 DNA， 1stDNA 在琼脂糖上没有检测到条带， 2nd、 3rd、 4thDNA 均检测到清晰且明亮电泳条带。说 明本方法适合低温度下生长的油桐幼叶干样基因组 DNA 的提取。 0056 如图 3， 本方法对来自 7 月份的未经低温储存的油桐 6 个基因型幼叶鲜样提取的 4 次 DNA， 1st、 2nd、 3rd、 4thDNA 均检测到清晰且明亮电泳条带。和图 1、 图 2 相比， 不同点在于 6 个基因型的1stDNA均检测到清晰明亮的电泳条带。 说明油桐幼叶内次生代谢产物随生长温 度的。
25、降低表现出明显的异质性， 对基因组 DNA 的提取造成明显的影响。进一步说明本方法 适合不同温度下生长的油桐幼叶 DNA 的提取。 0057 如图4， 本方法对储存1年的7月份幼叶混合样提取的4批次基因组DNA， 1stDNA在 琼脂糖上没有检测到条带， 而 2ndDNA， 3rdDNA， 4thDNA 均检测到清晰且明亮电泳条带。和图 3 相比， 不同点在于来自 7 月份的油桐幼叶储存 1 年后， 1stDNA 在琼脂糖凝胶上没有检测到条 带。说明低温长时间储存可能导致油桐幼叶内次生代谢产物成分发生变化， 与未储存前表 现出明显的异质性， 对 DNA 的提取造成明显的影响。进一步说明本方法适。
26、合低温长时间储 存条件下的油桐幼叶基因组 DNA 的提取。 0058 图 1 至图 4， 综合分析， 可看到如果采用传统基因组 DNA 提取方法， 组织样只进行 1 次提取， 对长久储存的油桐幼叶、 生长温度较低采集的油桐幼叶提取基因组 DNA， 得到的基 因组 DNA 产量可能很低。而用本发明方法， 能够极大的提高油桐幼叶基因组 DNA 的产量， 还 可克服不同环境下油桐幼叶叶片间化学成分异质性对 DNA 提取的影响， 拓宽了用于油桐基 因组 DNA 提取的幼叶范围。 0059 三、 紫外分光光度计法检测本方法提取的油桐幼叶基因组 DNA 的质量和产量 0060 以本方法提取的低生长温度下采。
27、集的幼叶 4 批次基因组 DNA 为例， 用紫外分光光 度计 ( 型号为 Ultrospec 1100) 检测其质量和产量。分别测定 4 批次 DNA 在波长 260 纳米 和 280 纳米的吸光值， 并计算 A260/A280 比值， 结果见下表 ： 说 明 书 CN 102424822 B 6 5/5 页 7 0061 0062 通过本方法获得的油桐基因组 DNA 样本的 1stDNA A260/A280 比值为 1.61， 说明 1stDNA 含有较多的杂质， 而 2ndDNA、 3rdDNA 和 4thDNA 均在 1.8 1.9 范围之内， 说明获得的基 因组 DNA 样本中色素、 蛋白质等杂质较少， 基因组 DNA 纯度较高。除 1stDNA 外， 后 3 批次基 因组 DNA 的浓度范围在 300 750ng/l 之间， 得到的油桐基因组 DNA 产量较高。 说 明 书 CN 102424822 B 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102424822 B 8 2/2 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102424822 B 9 。