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1、(10)申请公布号 CN 102433327 A (43)申请公布日 2012.05.02 CN 102433327 A *CN102433327A* (21)申请号 201110241521.2 (22)申请日 2011.08.22 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市钟灵街 50 号 (72)发明人 蔡士宾 蒋彦婕 高海东 吴纪中 张巧凤 颜伟 朱芳芳 吴小有 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 张素卿 (54) 发明名称 与小麦 Tabasco。
2、 抗白粉病基因紧密连锁的分 子标记 (57) 摘要 本发明公开了一个与小麦 Tabasco 抗白粉病 基因紧密连锁的分子标记， 属于农业生物技术范 畴。以抗病小麦 Tabasco 和感病小麦宁糯麦 1 号 杂交构建 F1、 F2及 F2:3家系群体， 通过抗病性鉴定 结果和分子标记技术将该抗性基因定位到染色体 5DS上， 为了寻找更逼近Tabasco抗白粉病未知基 因新的分子标记， 用已定位在5DS的EST序列开发 出了一个 STS 标记 Xmp510， 距离目的基因 1.3cM。 该标记作为 Tabasco 中抗白粉病基因的新的分子 标记， 比以前筛选到的相关标记更有优势应用于 小麦白粉病抗。
3、病品种的辅助选择育种， 从而克服 常规育种的不足， 简化选择方法和提高育种效率， 进而加快抗病品种的育种进程。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 2 页 CN 102433331 A1/1 页 2 1. 与小麦 Tabasco 抗白粉病基因紧密连锁的分子标记引物， 其特征在于， 该引物是与小麦 Tabasco 白粉病抗性基因紧密连锁的 STS 标记Xmp510的引物， 标记 Xmp510与目标基因连锁且遗传距离为 1.3cM， 引物序列如下 ： 左引物 ： 5 -CATCCAAACATC。
4、CAATGC-3 ； 右引物 ： 5 -ACACTACCACCATCACCGC-3 。 2. 权利要求 1 所述分子标记引物的应用， 其特征在于， 以 Tabasco 或其衍生品种为对象， 用权利要求1所述与小麦Tabasco白粉病抗性基因紧密连锁的STS标记Xmp510的引物PCR 扩增小麦植株DNA， 如果出现Xmp510标记的570bp和600bp两条带型， 则表示该植株中小麦 白粉病的抗性基因存在。 3. 根据权利要求 1 所述分子标记引物的应用， 其特征在于， PCR 反应体系 10l ： 内含模板 1020ng、 左右引物各 2pmol、 MgCl2 15nmol、 0.1U Ta。
5、q DNA 聚合酶与 1PCR 缓冲液 ； 反应循环程序如下 ： 94预变性 3min， 然后按 “94， 30s ； 58， 30s ； 72， 1min” 进行 34 个循环扩增， 最后 72延伸 10min ； PCR 产物用质量比 8% 的非变性聚丙烯酰胺胶进行电泳分离， 并用银染法显色读取 分离条带。 权 利 要 求 书 CN 102433327 A CN 102433331 A1/8 页 3 与小麦 Tabasco 抗白粉病基因紧密连锁的分子标记 一、 技术领域 0001 本发明涉及与小麦 Tabasco 抗白粉病基因紧密连锁的分子标记， 可应用于分子标 记辅助育种， 属于农业生物。
6、技术领域。 二、 背景技术 0002 小麦白粉病是由专性寄生真菌小麦白粉病菌 (Erysiphe graminis f.sp. tritici) 引起的一种严重的叶部病害。在小麦苗期至成株期均可产生危害， 严重时也可危 害叶鞘、 茎秆和穗部。白粉病菌除掠夺小麦植株的养分外， 菌丝层覆盖麦株表面， 使麦株呼 吸作用增高， 蒸腾作用加强， 光合作用效能降低， 碳水化合物积累和输送减少。小麦白粉病 过去仅在具有充沛雨量的海洋性和半大陆性气候环境的小麦种植区流行并造成严重的产 量损失(Bennett， 1984， Resistance to powdery mildew in wheat ： a re。
7、view of its use in agriculture and breeding programmes， Plant Pathology33， 279 300)。20 世纪 60 年代以来， 随着小麦矮秆、 半矮秆品种的推广， 氮肥施用量的增加， 白粉病的发生和危害 日趋严重， 在世界主要麦区由次要病害上升为主要病害， 成为影响和限制小麦稳产和高产 的一大障碍 ( 王心宇等， 2000， 小麦抗白粉病基因 Pm6 的 RAPD 标记， 遗传学报 27， 1072 1079)。据统计， 小麦白粉病引起的产量损失一般为 5 10， 严重发生时可高达 50， 甚 至绝产。1990 年和 199。
8、1 年在我国全国大流行， 两年的发生面积均超过 1200 万 hm2( 全国农 业技术推广服务中心 2008 年数据 )。1990 年白粉病造成小麦产量损失 14.39 亿 kg( 金善 宝， 1996， 中国小麦学， 北京 ： 中国农业出版社 )。引起这两次大流行的主要原因是携带 Pm8 的1B/1R易位系小麦品种丧失抗性(施爱农等， 1998， 抗白粉病小麦新品系的选育及其抗性 基因分析， 植物病理学报 25， 218 222)。因此， 对小麦白粉病的防治仍然十分重要。 0003 培育和推广抗病品种被公认为是防治小麦白粉病最经济、 有效、 安全的途径 (Qiu 等， 2005， Micro。
9、satellite mapping of a Triticum urartu Tum.derived powdery mildew resistance gene transferred to common wheat(Triticum aestivum L)， Theoretical and Applied Genetics 111， 15241531)。 其一方面可以减少农药的使用， 避免污染环境， 另一方面可以降低生产成本。选育抗病品种的关键是对小麦抗白粉病基因的挖掘、 研究和 合理利用 ( 杨作民等， 1994， 小麦抗病育种的战略问题小麦对锈病、 白粉病第二线抗源 的建立和应用， 作。
10、物学报20， 385394)。 目前， 所发掘鉴定的小麦抗白粉病基因较多， 其中 质量抗性占大部分。 但由于小麦白粉病菌具有群体大、 适应范围广、 生理小种多且毒力变异 快等特点， 加之大面积推广单一的抗病品种， 使得大部分抗性基因已被新的生理小种所克 服而丧失抗性。 为此， 寻找抗病新种质， 发掘新基因， 培育含有新的抗病基因的新品种， 则可 以应对生产上毒性较强而普遍流行的小种。 此外， 合理布局抗病基因和抗病品种， 将多个抗 病基因聚合到一个品种中去， 拓宽抗谱和提高耐持久性， 也是延缓品种抗性丧失， 防治病害 大面积流行的重要方法。 0004 小麦白粉病抗性表现为质量抗性 (quali。
11、tative resistance) 和数量抗性 (quantitative resistance) 两 种 形 式 (Friebe 等， 1994， Cytogenetically monitored 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433331 A2/8 页 4 transfer of powdery mildew resistance from rye into wheat， Crop Science 34， 621 625)。质量抗性由单基因或寡基因控制， 植株与病原菌的互作符合 Flor 的 “基因对基因假 说” ， 小种专化性较强， 一般在苗期表达(Benne。
12、tt， 1984， Resistance to powdery mildew in wheat a review ofits use inagricuture and breeding programmes， Plant Pathology 33， 279 300)。小麦白粉病质量抗性基因的研究与利用较为深入， 技术也较为成熟。目 前， 已报道的小麦抗白粉病基因中大多数为质量抗性， 即大多数抗性是由单基因控制的小 种专化抗性。数量抗性由多基因控制， 无小种专化性， 表现为连续性变异。数量抗性可存在 于苗期、 成株期或整个生育期。这种抗性主要延缓病原菌的侵染、 发育和繁殖， 也被称为部 分抗性 。
13、(Hautea 等， 1987， Inheritance of partial resistance to powdery mildew in spring wheat， Theoretical and Applied Genetics 73， 609 615)， 成株抗性 (Griffey 等， 1993， Effectiveness of adult-plant resistance in reducing grain yield loss to powdery mildew in winter wheat， Plant Disease 77， 618 622) 或慢抗病性 (Robert。
14、s and Caldwell， 1970， General resistance(slow mildewing)to Erysiphe graminis f.sp. tritici in Knox wheat， Phytopathology 60， 1310)。目前， 在已报道的 60 多个小麦主 效抗白粉病基因中正式命名的定位于不同位点的有 43 个， 分别是 Pm1 Pm43(McIntosh 等， 2008， Catalogue of gene symbols for wheat， In Appels R， Eastwood R， Lagudah E et al(eds)， Procee。
15、dings of l lth international wheat genet symposium， Sydney University Press， Sydney， Australia ； Luo等， 2009， Characterization and chromosomal location of Pm40 in common wheat ： a new gene for resistance to powdery mildew derived from Elytrigia intermedium， Theoretical and Applied Genetics 118， 1059 。
16、1064 ； Li 等， 2008， Molecular characterization of a new powdery mildew resistance gene Pm41 on chromosome 3BL derived from wild emmer(Triticum turgidum var. dicoccoides)， Theoretical and Applied Genetics 119， 531 539 ； Hua 等， 2009， Identification and genetic mapping of pm42， a new recessive wheat pow。
17、dery mildew resistance gene derived from wild emmer(Triticum turgidum var.dicoccoides)， Theoretical and Applied Genetics 119， 223 230 ； He 等， 2009， Inheritance and mapping of powdery mildew resistance gene Pm43 introgressed from Thinopyrum intermedium into wheat， Theoretical and Applied Genetics 118。
18、， 1173 1180)。在 这些抗病基因中， 除 Pm5、 Pm9、 Pm26、 pm42、 mlRD30、 pmY212、 PmLK906 和 pm2026 等为隐性基 因外， 大部分为显性遗传。 虽然已定名的抗白粉病主效基因比较多， 但由于小麦白粉菌生理 小种多， 毒力变异快， 致使含有单一抗性的品种一般在生产上应用 3 5 年便失去抗性。此 外， 由于有些抗病基因与一些不良性状连锁而较难在育种中利用。 因此， 真正能应用于生产 的数量有限。 0005 在我国， 应用到生产中的抗白粉病基因有 Pm2、 Pm4a、 Pm4b、 Pm5、 Pm6、 Pm8、 Pm21、 Pm23 和 Pm2。
19、4 等。向齐君等 ( 向齐君等， 1996， 小麦白粉病抗源材料的有效抗基因分析， 作 物学报， 22， 741 744) 通过测定抗性基因对白粉菌群体的抗性程度发现 Pm1、 Pm3a、 Pm3b、 Pm3c、 Pm3f、 Pm5、 Pm7、 Pm8 抗病的效能在我国已经很差， 在生产上已无实用价值 ； Pm2、 Pm4a、 Pm4b 在西南地区抗性较低， 但在我国其它地区仍然有效 ； Pm2+Mld、 Pm2+Pm6、 Pm21 及我国农 家品种小白冬麦(XBD基因)的抗性表现很好。 Pm21是目前抗性最强的基因， 其载体品种无 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433。
20、331 A3/8 页 5 明显的不良性状， 且在不同小麦遗传背景下抗病性均表现稳定， 现已转育到生产品种中， 并 在生产上得到了应用。Pm8 在我国乃至世界小麦抗白粉病育种中是一个较为典型的例子。 自 20 世纪 70 年代以来育种单位大多采用来自黑麦血统的抗源， 诸如 “牛朱特” 、“高加索” 、 “阿芙乐尔” 和 “洛夫林” 等 1B/1R 易位或代换系的衍生种， 其所含的抗白粉病基因多为 Pm8。 由于推广品种抗源的单一性， 20 世纪 80 年代中期开始， Pm8 抗白粉基因相继在世界范围内 丧失了抗病性， 造成了近10年来小麦白粉病的大流行， 从而最终导致20世纪末我国小麦生 产中白。
21、粉病多次大流行。 0006 所以， 为了防止 Pm21 由于抗原单一再次造成类似于 Pm8 的抗性丧失现象， 必须大 力挖掘和利用新抗原， 培育含有新的抗病基因的品种， 有效控制白粉病的流行。同时， 合理 布局抗病基因和抗病品种， 将多个抗病基因聚合到一个品种中去， 拓宽抗谱和提高耐持久 性， 也是延缓品种抗性丧失， 防治病害大面积流行的重要方法。 抗病品种的传统选育方法是 通过接种鉴定后选择抗病植株， 使用这种方法有时会因为接种不充分或发病条件不适宜而 影响选择效率。随着分子标记技术的产生和不断发展完善， 可以利用分子标记进行抗病基 因的鉴定选择， 从而发展了分子标记辅助选择 (Marker。
22、-assisted selection， MAS) 方法。 用分子标记进行抗病基因的检测， 在早代就可以进行选择， 提高选择的准确性， 缩小育种群 体， 并且不受环境、 生长季节的限制， 结合加代技术能大大缩短育种年限、 提高育种效率。 因 此分子标记技术已成为辅助育种的重要手段。 0007 抗白粉病新种质 Tabasco 是本实验室 ( 江苏省农业科学院 ) 从德国引进的硬质红 粒冬小麦， 属六倍体， 该种质在德国和我国南京地区均表现出高抗小麦白粉病混合菌种， 是 一个理想的白粉病新抗源材料。感白粉病材料宁糯麦 1 号是本实验室培育的全国第一个糯 小麦品种， 具有优良的栽培特性和口感， 该品。
23、种感白粉病， 系谱推导不含任何有效抗白粉病 基因。 以这两个材料作为亲本， 有利于抗白粉病新基因的发掘， 同时可以直接创造出应用于 育种的抗病新种质。 0008 三、 技术方案 0009 技术问题 0010 本发明针对上述研究背景， 以强抗白粉病小麦品种 Tabasco 为抗病材料筛选和寻 找新的而且稳定存在与白粉病抗性基因紧密连锁的分子标记及其方法， 用于小麦白粉病辅 助选择育种， 能够克服常规遗传育种周期长等缺点。由于研究所用材料为对南京当地流行 的混合菌种具有广谱抗性的材料， 因此有望发掘新的白粉病抗性基因。 0011 技术方案 0012 与小麦 Tabasco 抗白粉病基因紧密连锁的分。
24、子标记引物， 其特征在于， 该引物是 与小麦 Tabasco 白粉病抗性基因紧密连锁的 STS 标记 Xmp510 的引物， 标记 Xmp510 与目标 基因连锁且遗传距离为 1.3cM， 引物序列如下 ： 0013 左引物 ： 5 -CATCCAAACATCCAATGC-3 ； 0014 右引物 ： 5 -ACACTACCACCATCACCGC-3 。 0015 所述分子标记引物的应用， 其特征在于， 以 Tabasco 或其衍生品种与品系为对象， 用所述与小麦 Tabasco 白粉病抗性基因紧密连锁的 STS 标记 Xmp510 的引物 PCR 扩增小麦 植株DNA， 如果出现Xmp510。
25、标记的大概570bp和600bp两条带型， 则表示该植株中小麦白粉 病的抗性基因存在。 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433331 A4/8 页 6 0016 PCR 反应体系 10l ： 0017 内含模板 10 20ng、 左右引物各 2pmol、 MgCl215nmol、 0.1U Taq DNA 聚合酶与 1PCR 缓冲液 ； 0018 反应循环程序如下 ： 94预变性 3min， 然后按 “94， 30s ； 58， 30s ； 72， 1min” 进行 34 个循环扩增， 最后 72延伸 10min ； 0019 PCR 产物用质量比 8的非变性聚丙烯酰胺胶。
26、进行电泳分离， 并用银染法显色读 取分离条带。 0020 有益效果 0021 白粉病是影响小麦生产的一种严重病害， 本发明利用分子标记方法开发出一个新 的与白粉病抗性基因紧密连锁的 STS 标记， 在小麦育种实践和抗病理论研究上都有很重要 的价值。其优点具体归纳为以下三点 ： 0022 (1) 本发明中与小麦抗白粉病基因紧密连锁的 STS 标记， 是在对德国引进的小麦 品种Tabasco及其抗性稳定的杂交后代单株中获得的新标记， 对15个不同白粉病生理小种 均有抗性， 而且稳定存在， 可以用于小麦白粉病品种鉴定和小麦抗病后代的辅助选择育种。 0023 (2) 本研究所用材料 Tabasco 是。
27、新的白粉病抗源材料， 对南京地区流行的 15 个混 合白粉病菌均免疫， 具有白粉病广谱抗性。 因此， 根据该分子标记有望发掘出新的白粉病抗 性基因。 0024 (3)该标记为稳定的STS标记， 并且与抗白粉病基因紧密连锁， 遗传距离为1.3cM。 可直接用于小麦抗白粉病分子标记的辅助选择育种， 加快育种进程。同时为克隆小麦抗白 粉病新基因及其功能研究奠定了良好的基础。 四、 附图说明 0025 通过下面的详细描述并结合附图， 将更清楚的理解本发明的上述和其他目的、 特 征和其他优点， 其中 ： 0026 图 1 为 5DS 上 Xgwm205 标记在亲本及 F2群体中的分离， 泳道 M 为分子。
28、量 Marker， 泳道1、 2、 3和4分别为Tabasco、 宁糯麦1号、 抗池和感池， 箭头处所示为该标记扩增的多态 带型。 0027 图 2 为 5DS 上 Xcfd81 标记在中国春及其缺体、 四体系上的扩增带型。 0028 图 3 为 STS 标记 Xmp510 在亲本及抗感池中的分离。泳道 M 为分子量 Marker， 泳道 1、 2、 3 和 4 分别为 Tabasco、 宁糯麦 1 号、 抗池和感池。 0029 图 4 为 Tabasco 抗白粉病基因 (PmTa) 的遗传连锁图， 其中 Xmp510 与 PmTa 遗传距 离为 1.3cM。 0030 图 5 为 STS 标。
29、记 Xmp510 在以 Tabasco 为亲本的杂交组合后代中的表现。泳道 M 为分子量 Marker， 泳道 1、 2、 3 和 4 分别为 Tabasco、 宁糯麦 1 号、 抗池和感池。泳道 5-22 为 以 Tabasco 为亲本之一的杂交后代 F3扩增带型， 与抗性表型完全一致。 五、 具体实施方式 0031 下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 0032 实施例 1、 Tabasco 的白粉病抗性鉴定与遗传分析 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433331 A5/8 页 7 0033 1、 供试材料 0034 植物材料 ： 以抗病品种 Tabasco。
30、(Beschreibende Sortenliste 2009-Getreide， Mais，Leguminosen und Hackfrchte auer Kartoffeln， P.124， ISSN 0948-4167) 和感病品种宁糯麦 1 号 ( 苏审麦 200803) 杂交， 构建 F2定位群体， 成熟时 收获 F2:3家系种子用于苗期抗性鉴定。中国春及相应的缺体 - 四体系 (CS， N5A-T5D， N5D-T5B， N7B-T7D， N4D-T4B)(Sears， 1954， The aneuploids of common wheat， Missouri Agricultu。
31、ral Experiment Station Research Bulletin 572， 1 58) 用于染色体定位 ； Ulka/8*cc( 中国作物种质信息网 统一编号 MY008575) 为含 Pm2 的近等基因系， 用于抗谱分析 ； 苏麦 3 号 ( 中国作物种质信息网 http:/icgr.caas. 统一编号 ZM010242) 作为感病对照。 0035 菌种材料 ： 小麦白粉病菌种 Bgt(Blumeria graminis f.sp.tritici) 从南京当地 流行的混合菌种中分离得到 ( 许红星， 2008， 博士学位论文， 一粒小麦抗白粉病新基因的鉴 定和标记辅助转移)。
32、， 苗期鉴定采用Bgt19(Ma等， 2011， Identification and mapping of a new powdery mildew resistance gene on chromosome 6D of common wheat， Theoretical and Applied Genetics， DOI 10.1007/s00122-011-1651-3) 进行接种鉴定。 0036 2、 抗性鉴定 0037 (1) 鉴定标准 0038 病情记录按盛宝钦 ( 盛宝钦， 1988， 用反应型记载小麦苗期白粉病， 植物保护 1， 49) 的 6 级标准 ： 0 级 ： 免疫， 。
33、植株无病斑 ； 0 ； 级 ： 坏死反应， 叶片有枯死斑 ； 1 级 ： 高抗， 病斑 小 ( 一般直径小于 1mm) 菌丝层稀薄可见绿色叶面， 偶见较大病斑， 但仍透绿， 产抱量极少 ； 2 级 ： 中抗， 叶片病斑直径小于 1mm， 但菌丝层较厚， 不透绿， 能产生一定量孢子 ； 3 级 ： 中感， 叶片病斑多， 一般直径大于 1mm， 菌丝层厚， 产孢量大， 但病斑不连片 ； 4 级 ： 高感， 叶片病斑 直径一般大于 1mm， 菌丝层厚， 产孢量多， 病斑连片。 0039 (2) 群体鉴定 0040 Tabasco与宁糯麦1号杂交获得的F1和抗感双亲均播种于江苏省农科院试验田设 立的小。
34、麦白粉病鉴定圃进行抗性鉴定。小区行长 1.35m， 行距 0.25m， 两边垂直种植感病品 种苏麦 3 号 ( 生产用种 ) 做诱发行。鉴定所用菌种 Bgt 为南京当地田间采集的混合菌株经 越夏保存繁殖而来。 于小麦拔节前在诱发行间移栽大量病株， 让其不断感染诱发行， 保证病 圃早期菌源充足。 0041 F2在苗期于人工气候箱内用生理小种 Bgt19 接种鉴定。将待鉴定材料种植于 44cm272 的长方形穴盘中， 于无白粉菌污染的温室中待小麦生长至第一片叶完全展开 时通过抖撒分生孢子的方式进行接种。穴盘中随机种植苏麦 3 号作为接种均匀性对照， 以 感病亲本作为感病对照， 抗病亲本作为抗病对照。
35、。 接种后保持室内相对湿度在80以上， 每 天光照 14 小时， 昼夜温度分别为 22和 18。7 14 天后， 当感病对照表现出明显病症时 进行抗性调查， 2 天后进行复查。 0042 对所有收获到种子的 F2:3家系取 25 粒进行发苗鉴定， 接种和鉴定方式同上， 结果 以纯合抗病 (RR)、 抗性分离 (Rr) 和纯合感病 (rr) 家系记录。 0043 3、 遗传分析 0044 F1群体及抗感亲本经大田自然发病鉴定显示 ： Tabasco 苗期和成株期均高抗小麦 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433331 A6/8 页 8 白粉病菌 (IT 0 0 ； ) ； 。
36、宁糯麦 1 号， 苗期至成株期均高感小麦白粉病菌 (IT4) ； F1苗期至 成株期均高抗小麦白粉病菌 (IT 0 0 ； )。用小麦白粉菌生理小种 Bgt19 对 Tabasco、 宁糯 麦 1 号、 F2及 F2:3家系进行温室内苗期鉴定。结果表明 ： Tabasco 高抗白粉病 (IT 0 0 ； )， 宁糯麦 1 号高感白粉病 (IT 4)， F2代 472 株个体中 359 株抗病 (IT 0 2)， 113 株感病 (IT 3 4)。经 x2检验， 符合 3 1 的分离比例 (x23 1 0.23， P 0.63) ( 表 1)。对所有 得到的 F2:3家系每系选取 25 粒种子进。
37、行苗期白粉病抗性鉴定， 结果显示 ： 有 101 个 F2:3家 系表现纯合抗病 ； 238 个 F2:3家系出现抗感分离 ； 97 个 F2:3代家系均表现纯合感病。其抗性 分离比例符合 1 2 1 的分离比例 (x21 2 1 3.58， P 0.17)( 表 1)。结合 F1、 F2和 F2:3代的鉴定结果， 可推断 Tabasco 对白粉菌种 Bgt19 的抗性受 1 对显性主效基因控制。 0045 表 1 Tabasco 与宁糯麦 1 号的 F2和 F2:3分离群体对小麦白粉菌 Bgt19 小种的反应 0046 0047 RR ： 纯合抗病家系 ； Rr ： 杂合抗病家系 ； rr 。
38、： 纯合感病家系。x20.05， 13.84， x20.05， 2 5.99 0048 实施例 2、 与 Tabasco 小麦抗白粉病基因连锁的分子标记的获得 0049 1、 DNA 提取及抗感池建立 0050 基 因 组 DNA 提 取 参 照 Ma 等 (Ma 等， 1994， RFLP markers linked to powdery mildew resistance genes Pm1， Pm2， Pm3， and Pm4 in wheat， Genome 3 7， 871 875) 描 述的SDS方法进行。 具体步骤如下 ： 取小麦幼苗组织在液氮中研磨后加入适量的DNA提取液 (。
39、0.1M Tris pH8.0， 0.05MEDTApH8.0， 1.25 SDS， 0.5MNaCl， 3.8g/L NaBisufite)， 65处 理 30min， 其间颠倒混匀 4 5 次。氯仿 / 异戊醇 (24 1) 抽提， 离心取上清液。用 -20 预冷的无水酒精沉淀DNA， 并在-20下放置1h或过夜。 用70酒精进行洗涤， 最后加适量 TE 溶解， 于 4或 -20贮藏待用。 0051 采 用 分 离 体 分 组 混 合 分 析 法 (Bulk segregant analysis， BSA) 进 行 基 因 连 锁 标 记 的 筛 选 (Michelmore 等， 1991。
40、， Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis ： a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations， Proceedings of the National Academy of Sciences 88， 9828 9832)。选取 F2代 0 0 ； 的抗病单株 6 株的 DNA 等量混合成抗病池 (BR)， 4 级感病。
41、单株 6 株的 DNA 等量混合成感 病池 (BS)。 0052 2、 SSR 分析 0053 从小麦全基因组中以 10 20cM 的遗传距离为单位挑选 barc， gwm， wmc， 和 cfp 等 系列的覆盖全基因组的 SSR 引物 244 对， 进行全基因组多态性检测。以抗感亲本、 抗病池和 感病池的DNA为模板进行PCR扩增， 寻找亲本与抗感池之间有一致多态性的引物， 并对F2分 离群体进行分析验证， 检测 SSR 标记与抗病基因的连锁程度。 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433331 A7/8 页 9 0054 PCR 反应在 SensoQuest Labcy。
42、cler(Germany) 上进行， 反应体系 10l ： 内含模板 1020ng、 左右引物各2pmol、 MgCl2 15nmol、 0.1U Taq DNA聚合酶与1PCR缓冲液。 反应 循环程序如下 ： 94预变性 3min， 然后按 “94， 30s ； 50 60 ( 视引物而定 )， 30s ； 72， 1min” 进行 34 个循环扩增， 最后 72延伸 10min。PCR 产物用 8的非变性聚丙烯酰胺胶 进行电泳分离， 并用银染法显色读取分离条带 (Santos 等， 1993， Genetic and population study of a Y-linked tetra。
43、nucleotide repeat DNA polymorphism with a simple non-isotopic technique， Human genetics 90， 655 656)。 0055 结果发现位于 5DS 上的 SSR 标记 Xgwm205 在抗感亲本和抗感池之间有一致的多态 性 ( 图 1)， 用 96 个 F2单株 DNA 的小群体对该标记进行验证， 发现 Xgwm205 与该抗病基因 连锁， 进一步筛选位于 5DS 及 5DL 着丝粒附近区域的其他 SSR 标记， 发现 Xcfd81， Xgpw302， Xcfd67 和 Xwmc608 在亲本间均具多态性，。
44、 经 F2小群体检测它们都与目标基因连锁。将该白 粉病抗性基因初步定为在 5DS 染色体上。 0056 3、 Tabasco 抗白粉病基因的物理定位 0057 运用中国春及相应的缺体 - 四体系， 对与目标基因连锁的标记进行物理定位。由 于距离目的基因最近的标记 Xcfd81 在 4D 和 7B 上也有扩增位点 (http:/wheat.pw.usda. gov/GG2/index.shtml)， 此选用中国春 (CS) 及相应的第四、 第五和第七同源群的缺体 - 四 体系对目的基因进行物理定位。以上提到的 5 个标记在 CS 和 CS N5A-T5D 均能扩增出相应 的条带， 而在 CS N。
45、5D-T5B 上不能扩增出来。此外 Xcfd81 在 CS N4D-T4B 和 CS N7B-T7D 都 能扩出相应的条带， 但在 CS N5D-T5B 上不能扩增出来 ( 图 2)。由此证明， 该抗病基因位于 小麦 5D 染色体的短臂上。 0058 4、 EST-S 0059 TS 标记的开发与连锁图谱的构建 0060 为了寻找与该抗病基因更紧密连锁的标记， 以期为分子标记辅助育种 (MAS) 提 供更可靠的检测手段， 根据 GrainGenes 的数据库 (http:/wheat.pw.usda.gov/wEST/ binmaps/wheat5_rice.html)， 对小麦5DS上的ES。
46、T序列以每个Deletion bin为单位初步选 取 2 3 个， 进行相应的 STS 标记的开发。引物设计采用软件 MACVECTOR V10.0(Accelrys， UK)。STS 标记多态性检测方法与 SSR 标记分析相似。当目标 STS 标记在亲本间没有检测到 多态时， 对 PCR 产物选择性地用限制性内切酶进行消化。酶切反应依据相应说明书进行， 产 物用 8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。 0061 共开发了 14 对 STS 标记， 其中 Xmp510 引物在抗感亲本间差异明显 ( 图 3)， 用 F2 群体检测， 发现与目标基因连锁且遗传距离为 1.3cM( 图 4)。STS 标记。
47、 Xmp510 是根据 EST BE498794 的序列所设计， 引物序列如下 ： 0062 左引物 ： 5 -CATCCAAACATCCAATGC-3 ； 0063 右引物 ： 5 -ACACTACCACCATCACCGC-3 。 0064 实施例3、 与小麦Tabasco白粉病抗性基因连锁的分子标记在以Tabasco为亲本的 杂交组合后代中的应用 0065 对 Tabasco 与宁糯麦 1 号 F3家系单株进行扩增， Xmp510 扩增结果如图 5 所示， 标 记分析结果预测抗感情况与实际接病检测结果完全吻合(表2)， 证明标记Xmp510可以应用 于白粉病的抗性筛选， 以及含有 Taba。
48、sco 抗白粉病基因的选择育种。 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433331 A8/8 页 10 0066 表 2 图 5 中 F3株系对应白粉病抗性表型鉴定结果 0067 0068 0069 上述实施不以任何形式限定本发明。 说 明 书 CN 102433327 A CN 102433331 A1/2 页 11 SEQUENCE LISTING 江苏省农业科学院 与小麦 Tabasco 抗白粉病基因紧密连锁的分子标记 000 2 PatentIn version 3.1 1 18 DNA 人工 左引物 (1).(18) 1 catccaaaca tccaatgc 18 2 19 DNA 序 列 表 CN 102433327 A CN 102433331 A2/2 页 12 人工 右引物 (1).(19) 2 acactaccac catcaccgc 19 序 列 表 CN 102433327 A CN 102433331 A1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102433327 A CN 102433331 A2/2 页 14 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102433327 A 。