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1、(10)授权公告号 CN 103342689 B (45)授权公告日 2015.02.18 CN 103342689 B (21)申请号 201310241917.6 (22)申请日 2013.06.18 C07D 311/30(2006.01) (73)专利权人 山东中医药大学 地址 250300 山东省济南市长清区大学路 4655 号 专利权人 上海第一生化药业有限公司 聊城大学 (72)发明人 李爱峰 孙爱玲 柳仁民 张永清 黄臻辉 (54) 发明名称 从瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香 叶木素的方法 (57) 摘要 本发明涉及从瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香叶木素的方法，。
2、 是以瓜蒌皮为原料， 经 过下述步骤 ：（1） 瓜蒌皮粗提物的制备 ；（3） 聚酰 胺柱粗分离 ；（4） 半制备型高效液相色谱分离纯 化。 该工艺过程绿色环保， 对环境无严重危害,综 合成本低。 (51)Int.Cl. 审查员 李洪雪 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103342689 B CN 103342689 B 1/1 页 2 1. 从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香叶木素的方法， 其特征是， 步骤为 ： (1) 瓜蒌皮粗提物的制备 ： 取。
3、粉碎好的瓜蒌皮药材， 用乙醇 - 水溶液加热回流提取， 加 热回流提取时间为1-3小时， 提取次数为2-6次， 提取液经减压回收至无醇后得到瓜蒌皮粗 提物， 加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为 50 -95 ； (2) 萃取 ： 将瓜蒌皮粗提物分散于水中， 先后用等体积的石油醚、 乙酸乙酯萃取， 石油 醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩， 得石油醚部位和乙酸乙酯部位 ； (3) 聚酰胺柱粗分离 ： 将瓜蒌皮乙酸乙酯部位分散于水中， 上聚酰胺柱进行层析， 先用 水进行洗脱， 再用浓度为 50的乙醇 - 水溶液进行洗脱， 最后用浓度为 80的乙醇 - 水溶 液进行洗脱， 收集 80的乙醇 - 水洗脱液， 。
4、减压浓缩， 得瓜蒌皮总黄酮苷元 ； (4) 半制备型高效液相色谱分离纯化 ： 将瓜蒌皮总黄酮苷元用半制备型高效液相色谱 进行分离纯化， 色谱柱为YMC ODS-AQ柱， 流动相为甲醇-水， 检测波长为350nm， 收集目标组 分馏分， 将得到的馏分减压浓缩， 即得到所要分离的单体化合物 ； 洗脱方式有 70甲醇 - 水 等度洗脱、 65甲醇 - 水等度洗脱、 60甲醇 - 水等度洗脱或甲醇 - 水梯度洗脱， 控制甲 醇 - 水洗脱液的流速为 2.5-4.5mL/min。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是， 步骤 (1) 加热回流提取时提取时间为 1.5-2.5 小时。 3. 根据。
5、权利要求 1 所述的方法， 其特征是， 步骤 (1) 加热回流提取时提取时间为 2 小 时。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是， 步骤 (1) 提取次数为 3-5 次。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征是， 步骤 (1) 提取次数为 4 次。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征是， 步骤(1)加热回流提取时所用乙醇的质量浓 度为 60 -80。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征是， 步骤(1)加热回流提取时所用乙醇的质量浓 度为 70。 8. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是， 控制甲醇 - 水洗脱液的流速为 3.5mL/min。 权 利 要 求 书。
6、 CN 103342689 B 2 1/4 页 3 从瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香叶木素的方法 技术领域 0001 本发明属于化工领域， 具体是涉及一种从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜 素和香叶木素的方法。 背景技术 0002 瓜蒌皮为葫芦科栝楼属植物栝楼 （Trichosanthes kirilowii Marim.） 或双边栝 楼 （Trichosanthes rosthornii Harms.） 的干燥成熟果皮， 属于常用中药， 具有润肺化痰、 利气宽胸等功效， 临床上广泛用于治疗痰热咳嗽、 痰浊黄稠、 咽痛、 胸痛、 吐血、 衄血、 便秘、 痈疮肿毒等症。 现代药理实验。
7、及临床实践表明瓜蒌皮具有扩张冠状动脉、 增加冠脉血流量、 提高心肌耐缺氧能力、 降低血清胆固醇、 抗菌、 抗癌等多种药理作用， 尤其是对心血管疾病 具有很好的治疗作用。 0003 现已有文献报道从瓜蒌皮中提取纯化黄酮类成分的方法。刘岱琳 瓜蒌的抗血 小板凝集活性成分研究， 中草药， 2004 年 12 期 对瓜蒌皮的正丁醇部位的化学成分进行 了分离， 先用 Sephadex LH-20 柱色谱分离， 再用反复硅胶柱色谱分离， 氯仿 - 甲醇为洗脱 剂， 最终得到 7 种成分， 其中包括 1 种黄酮类物质香叶木素 -7-O- 葡萄糖苷。范雪梅 瓜蒌化学成分的分离与鉴定， 沈阳药科大学学报， 20。
8、11 年 12 期 对瓜蒌皮的正丁醇部位 的化学成分进行了分离， 先后利用了硅胶、 反相中低压、 凝胶 Sephadex LH-20 柱色谱以及 制备型高效液相色谱等分离手段， 最终得到 4 种成分， 其中包括 1 种黄酮类物质柯伊利 素 -7-O- 葡萄糖苷。 0004 上述方法主要是对瓜蒌皮的正丁醇部位的化学成分进行系统的分离， 得到的黄酮 类物质的种类少， 分离过程步骤较为繁琐， 有时需要使用氯仿为萃取剂或洗脱剂， 对人体和 环境均有严重危害， 而且生产周期较长， 生产成本较高。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种操作简便、 绿色环保、 综合成本 低、 生。
9、产周期短的快速从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香叶木素的方法。 0006 本发明的方案如下 ： 0007 从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香叶木素的方法 , 步骤为 ： 0008 （1） 瓜蒌皮粗提物的制备 ： 取粉碎好的瓜蒌皮药材， 用乙醇 - 水溶液加热回流提 取， 提取液经减压回收至无醇后得到瓜蒌皮粗提物 ； 0009 （2） 萃取 ： 将瓜蒌皮粗提物分散于水中， 先后用等体积的石油醚、 乙酸乙酯萃取， 石 油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩， 得石油醚部位和乙酸乙酯部位 ； 0010 （3） 聚酰胺柱粗分离 ： 将瓜蒌皮乙酸乙酯部位分散于水中， 上聚酰胺柱进行层析， 先用。
10、水进行洗脱， 再用浓度为 50% 左右的乙醇 - 水溶液进行洗脱， 最后用浓度为 80% 左右的 乙醇 - 水溶液进行洗脱， 收集 80% 左右的乙醇 - 水洗脱液， 减压浓缩， 得瓜蒌皮总黄酮苷元 ； 0011 （4） 半制备型高效液相色谱分离纯化 ： 将瓜蒌皮总黄酮苷元用半制备型高效液相 说 明 书 CN 103342689 B 3 2/4 页 4 色谱进行分离纯化,色谱柱为YMC ODS-AQ柱 （250 mm10 mm I. D., 10 m， 大连江申分 离科技有限公司） ， 流动相为甲醇 - 水， 检测波长为 350 nm， 收集目标组分馏分， 将得到的馏 分减压浓缩， 即得到所要。
11、分离的单体化合物。 0012 前面所述的方法， 优选的方案是， 步骤 （1） 加热回流提取时提取时间为 1-3 小时 （优选为 1.5-2.5 小时， 更加优选提取时间为 2 小时） 。 0013 前面所述的方法， 优选的方案是， 步骤 （1） 提取次数为 2-6 次 （优选提取次数为 3-5 次， 更加优选 4 次） 。 0014 前面所述的方法， 优选的方案是， 步骤 （1） 加热回流提取时所用乙醇的质量浓度为 50%-95%（优选 60%-80%， 更优选 70%） 。 0015 前面所述的方法， 优选的方案是， 步骤 （3） 洗脱液为60%-95%的乙醇-水洗脱液 （优 选 70%-9。
12、0%， 更优选 80%） 。 0016 前面所述的方法， 优选的方案是， 步骤 （4） 用甲醇 - 水洗脱液进行洗脱时， 洗脱方 式有 70% 甲醇 - 水等度洗脱、 65% 甲醇 - 水等度洗脱、 60% 甲醇 - 水等度洗脱或甲醇 - 水梯 度洗脱。优选的是， 控制甲醇 - 水洗脱液的流速为 2.5-4.5 mL/min（优选 3.5 mL/min） 。 0017 本发明从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香叶木素的方法， 首先采用 聚酰胺柱粗分离， 再用半制备型高效液相色谱法进行分离纯化， 所得目标化合物纯度高， 杂 质含量极低。除此之外， 还具有如下优势 ： 0018 （1） 提。
13、取物经过聚酰胺柱粗分离后可以除去大部分的杂质， 使混合物的组成得到 简化， 可以为后续的分离工作降低难度， 并且可以保护半制备型高效液相色谱柱不被污染， 有效地延长了色谱柱的使用寿命。 0019 （2） 使用半制备型高效液相色谱法一次分离纯化就可以同时得到木犀草素、 芹菜 素和香叶木素 3 种高纯度单体化合物， 方法操作简单， 效率高， 工艺周期短， 节省试剂， 降低 了生产成本。 0020 （3） 纯化过程中不使用对环境和人体危害大的氯仿等有机溶剂， 聚酰胺经再生后 可以重复使用多次， 绿色环保。 0021 （3） 优化了层析方法的条件 （洗脱液的组成和流速） ， 使化合物的纯度和效率都大 。
14、为提高。 附图说明 0022 图 1 是瓜蒌皮总黄酮苷元的高效液相色谱图。 0023 图 2 是瓜蒌皮总黄酮苷元的半制备型高效液相色谱图。 具体实施方式 0024 下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案， 但保护范围不被此限制。实 施例中所用设备或原料皆可从市场获得。所用试剂均购自济南试剂总厂， 所用水为去离子 水。 0025 实施例 ： 从中药瓜蒌皮中分离纯化木犀草素、 芹菜素和香叶木素的方法 , 其步骤 为 ： 0026 （1） 瓜蒌皮粗提物的制备 ： 瓜蒌皮药材经粉碎后， 以 70% 乙醇为溶剂加热回流提取 说 明 书 CN 103342689 B 4 3/4 页 5 4 次， 提。
15、取时间为 2 小时， 合并提取液， 减压浓缩得粗提物。 0027 （2） 萃取 ： 将瓜蒌皮粗提物分散于水中 , 先后用等体积的石油醚和乙酸乙酯萃取 , 石油醚和乙酸乙酯层分别减压浓缩， 得石油醚部位和乙酸乙酯部位。 0028 （3） 聚酰胺柱粗分离 ： 将瓜蒌皮乙酸乙酯部位分散于水中， 上聚酰胺柱进行层析， 先用水进行洗脱,再用浓度为50%左右的乙醇-水溶液进行洗脱， 最后用浓度为80%左右的 乙醇 - 水溶液进行洗脱， 收集 80% 左右的乙醇 - 水洗脱液， 减压浓缩得瓜蒌皮总黄酮苷元。 0029 （4） 半制备型高效液相色谱分离纯化 ： 将瓜蒌皮总黄酮苷元用半制备型高效液相 色谱进行分。
16、离纯化， 色谱柱为 YMC ODS-AQ 柱 （250 mm10 mm I. D., 10 m， 大连江申分 离科技有限公司） ， 流动相为甲醇 - 水， 流出液由紫外检测器在 350 nm 检测， 收集目标组分 馏分， 将得到的馏分减压浓缩， 即得到所要分离的单体化合物。 0030 发明人通过使用不同浓度的甲醇作流动相， 采用不同的洗脱方式， 控制甲醇 - 水 洗脱液的流速为 3.5 mL/min， 优选出了实现本发明目的的纯化条件， 有关实验结果如下 ： 0031 表一 半制备型高效液相色谱洗脱条件 洗脱液条件 实施例 1 70% 甲醇 - 水等度洗脱 实施例 2 65% 甲醇 - 水等度。
17、洗脱 实施例 3 60% 甲醇 - 水等度洗脱 实施例 4 甲醇 - 水梯度洗脱 0032 在实施例 1 中， 采用 70% 甲醇 - 水为洗脱液等度洗脱， 各成分洗脱时间较短， 但相 互之间分离效果不够理想， 所得成分纯度较低。实施例 2 中采用 65% 甲醇 - 水为洗脱液等 度洗脱， 各成分之间分离良好， 分离时间也较为适宜。实施例 3 中采用 60% 甲醇 - 水为洗脱 液等度洗脱， 各成分分离良好， 但分离时间太长。实施例 4 采用甲醇 - 水梯度洗脱， 各成分 分离良好， 分离时间也可以， 但洗脱液由于浓度变化导致回收再利用存在较大困难。 0033 图 2 是当选用实施例 2 体系。
18、时的色谱图， 由图 2 可见， 各成分分离良好， 分离时间 也较为适宜。根据色谱图收集各峰组分， 回收溶剂后， 即可得到相应高纯度化合物。经高效 液相色谱面积归一化法分析测试， 实施例 2 所得到的各个组分的纯度很高， 均在 98% 以上。 根据核磁共振氢谱和碳谱的测试， 对所得峰组分进行鉴定， 得到了木犀草素、 芹菜素和香叶 木素。 0034 经现代波谱数据证实所提取纯化得到的木犀草素、 芹菜素和香叶木素的化学结构 式如下 ： 0035 说 明 书 CN 103342689 B 5 4/4 页 6 0036 0037 3 种化合物的鉴定结果如下 ： 0038 化合物 I（木犀草素） ： 1H。
19、-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm: 12.99 (1H, s, 5-OH), 9.5-11.0 (2H, br s, 3 -OH, 4 -OH), 7.41 (2H, m, 6 -H, 2 -H), 6.89 (1H, d, J=8.0 Hz, 5 -H), 6.67 (1H, s, 3-H), 6.44 (1H, s, 8-H), 6.18 (1H, s, 6-H) ； 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm: 181.5 (4-C), 164.4 (7-C), 163.8 (2-C), 161.4 (9-C), 157.2 (5-C), 149.。
20、8 (4 -C), 145.7 (3 -C), 121.2 (6 -C), 118.8 (1 -C), 115.9 (5 -C), 113.2 (2 -C), 103.5 (10-C), 102.7 (3-C), 98.8 (6-C), 93.8 (8-C)。 0039 化合物II （芹菜素） ： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm: 12.97 (1H, s, 5-OH), 10.2-11.2 (2H, br s, 7, 4 -OH), 7.93 (2H, d, J=8.8 Hz, 2 -H, 6 -H), 6.93 (2H, d, J=8.8 Hz, 3 -H, 5。
21、 -H), 6.79 (1H, s, H-3), 6.47 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.18 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6) ； 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) ppm: 181.7 (4-C), 163.9 (7-C), 162.4 (2-C), 161.5 (9-C), 161.2 (4 -C), 157.3 (5-C), 128.4 (6 -C), 128.5 (2 -C), 121.1 (1 -C), 116.1 (3 -C), 116.0 (5 -C), 103.6 (10-C), 102.8 (3-C), 98.9 (6-。
22、C), 94.0 (8-C)。 0040 化合物 III（香叶木素） ： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) ppm: 12.98 (1H, s, 5-OH), 10.80 (1H, br s, 7-OH), 10.00 (1H, br s, 3 -OH), 7.57 (2H, m, 6 -H, 2 -H), 6.94 (1H, d, J=8.8 Hz, 5 -H), 6.92 (1H, s, 3-H), 6.51 (1H, d, J=1.6 Hz, 8-H), 6.20 (1H, d, J=2.0 Hz, 6-H), 3.89 (3H, s, 4 -OCH3) ； 13C-N。
23、MR (100 MHz, DMSO-d6) ppm: 181.6 (4-C), 164.0 (7-C), 163.6 (2-C), 161.3 (9-C), 157.2 (5-C), 150.7 (4 -C), 147.9 (3 -C), 121.4 (6 -C), 120.3 (1 -C), 115.7 (2 -C), 110.2 (5 -C), 103.6 (10-C), 103.1 (3-C), 98.7 (6-C), 93.9 (8-C), 55.9 (4 -OCH3)。 0041 应当指出的是， 具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子， 显然本发明的技 术方案不限于上述实施例。还可以有很多变形。本领域的普通技术人员， 从此文件中所公 开提到或是联想到的， 均应认为是本专利所要保护的范围。 说 明 书 CN 103342689 B 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103342689 B 7 。