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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610403772.9 (22)申请日 2016.06.08 (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街2699 号 (72)发明人 郭轶徐力沈娜李慧郝翠婷 (74)专利代理机构 长春吉大专利代理有限责任 公司 22201 代理人 刘世纯王恩远 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12N 9/08(2006.01) (54)发明名称 一种过氧化物纳米酶及其制备方法 (57)摘要 一种过氧化物纳米酶及其制备方法， 属于纳 。
2、米生物技术领域。 是以金纳米粒子为载体， 利用 生物活性五肽(URGDC)进行自组装， 五肽分子中 巯基与金纳米粒子配位共价偶联， 得到具有高 GPx活性的过氧化物纳米酶。 此方法简便易于操 作， 并且具有良好的稳定性。 生物活性五肽的氨 基酸序列为Sec-Arg-Gly-Asp-Cys(简称URGDC)。 其中Sec(U)中含有酶的活性中心； Arg-Gly-Asp (RGD)能促进纳米酶与底物的结合， Cys(C)侧链 中的巯基可以和金纳米粒子共价连接。 金纳米粒 子的应用是作为一种载体固定生物活性五肽， 促 进纳米酶与底物的充分接触， 提高谷胱甘肽过氧 化物酶的活力。 权利要求书1页 说。
3、明书3页 CN 106011125 A 2016.10.12 CN 106011125 A 1.一种过氧化物纳米酶的制备方法， 其步骤如下： (1)利用柠檬酸钠还原四氯金酸得到柠檬酸钠包覆的金纳米粒子溶胶， 然后将该金纳 米粒子溶液于800012000rpm离心2030min， 沉淀再以高纯水溶解并稀释得到金纳米粒 子溶液， 其最大等离子体共振吸收峰 max520nm处的吸光度值在0.81.0， 制备得到金溶 胶储备液， 储备液的浓度为1.261.57nM； (2)取1mL步骤(1)制备得到的金溶胶储备液， 用10mM磷酸缓冲液PBS调节其pH8.0 9.0， 然后向其中加入630 L、 10。
4、-3M的生物活性五肽URGDC， 摇匀后， 4静置2030小时， 即 得到具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的过氧化物纳米酶。 2.一种过氧化物纳米酶， 其特征在于： 是由权利要求1所述的方法制备得到。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106011125 A 2 一种过氧化物纳米酶及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于纳米生物技术领域， 具体涉及纳米技术与人工模拟酶领域的交叉与结 合， 通过纳米技术模拟谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的性质， 制备一种高GPx活性的过氧化物 纳米酶。 背景技术 0002 谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)具有独特的氧化还原特性， 是生物体内抗氧化酶的重 要成员之一。 G。
5、Px以谷胱甘肽(GSH)为还原剂， 分解体内的各类氢过氧化物。 它的主要生理机 能是保护血红细胞和线粒体不被活性氧损伤， 阻止体内脂类过氧化反应发生， 在生物体抗 氧化方面发挥着极其重要的作用。 0003 GPx能清除体内活性氧， 防止脂质过氧化， 因而具有治疗由活性氧失衡而引起的各 种疾病， 如白内障、 心脑血管病症、 各类炎症、 克山病等疾病的潜力， 具有十分重要的药用开 发前景。 由于天然GPx的来源有限、 稳定性差等原因， 致使它的药用开发过程非常缓慢。 因 此， 对GPx进行人工模拟， 开发治疗相关疾病的药物越来越受到关注。 Ebselen、 环糊精等小 分子， 以及半合成酶、 抗体。
6、酶、 生物印记酶等大分子模拟物已有研究， 用来模拟谷胱甘肽过 氧化物酶， 对设计和开发新的生物催化活性体系具有十分重要的意义， 在医药、 酶学方面具 有广阔的应用前景。 0004 纳米材料具有特殊的表面、 界面效应， 并且其尺寸与生物大分子的大小相当。 不仅 如此， 金纳米粒子还表现出良好的提高生物催化过程中电子的反转速度特性， 为利用纳米 材料在生物催化体系中的应用提供了重要的基础。 同时， 金纳米粒子所产生的表面等离子 体共振信号会随着金纳米粒子之间的距离发生改变而被用于生物传感器件的开发。 这些特 征， 为以金纳米粒子为基础构建纳米酶在生物传感器领域中的应用提供了保障。 0005 分子自。
7、组装过程作为一种纳米技术手段是构建纳米酶的一种有效方法， 其过程简 便、 易于操作。 发明内容 0006 本发明所述一种过氧化物纳米酶的构建过程是以金纳米粒子为载体， 利用生物活 性五肽(URGDC)进行自组装， 五肽分子中巯基与金纳米粒子配位共价偶联， 得到具有高GPx 活性的过氧化物纳米酶。 此方法简便易于操作， 并且具有良好的稳定性。 0007 具体步骤如下： 0008 (1)利用柠檬酸钠还原四氯金酸得到柠檬酸钠包覆的金纳米粒子溶胶(参考文献 J.Phys.Chem.C,2007,111,9172-9176)， 然后将该金纳米粒子溶液于800012000rpm离心 2030min， 沉淀。
8、再以高纯水溶解并稀释得到金纳米粒子溶液， 其最大等离子体共振吸收峰 (max520nm)处的吸光度值在0.81.0， 制备得到金溶胶储备液， 储备液的浓度为1.26 1.57nM。 0009 (2)取1mL步骤(1)制备得到的金溶胶储备液， 用10mM磷酸缓冲液PBS调节其pH 说明书 1/3 页 3 CN 106011125 A 3 8.09.0， 然后向其中加入630 L、 10-3M的生物活性五肽URGDC(购买于吉尔生化(上海)有 限公司， 纯度98)， 摇匀后， 4静置2030小时， 即得到具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的 过氧化物纳米酶。 0010 生物活性五肽的氨基酸序列为Sec-A。
9、rg-Gly-Asp-Cys(简称URGDC)。 其中Sec(U)中 含有酶的活性中心； Arg-Gly-Asp(RGD)能促进纳米酶与底物的结合， Cys(C)侧链中的巯基 可以和金纳米粒子共价连接。 0011 金纳米粒子的应用是作为一种载体固定生物活性五肽， 促进纳米酶与底物的充分 接触， 提高谷胱甘肽过氧化物酶的活力。 0012 本发明具有以下特点： 0013 (1)利用生物活性五肽(URGDC)修饰金属纳米材料表面进行新型过氧化物人工模 拟酶的研究是本发明的特色之处。 生物活性肽本身具有较低的GPx活性， 而通过金纳米粒子 的固定， 纳米酶较生物活性五肽的活力明显提高， 说明本发明中构。
10、建纳米酶的方法可行。 0014 (2)纳米酶的GPx活性是世界知名的小分子GPx模拟物Ebselen活性的5.1倍。 0015 (3)纳米酶构建过程简便、 易于操作。 纳米酶具有良好的水溶性， 且所制备的纳米 酶可以稳定保存。 0016 本发明通过分子自组装等纳米技术手段利用金纳米粒子成功的构建了具有谷胱 甘肽过氧化物酶活性的纳米酶。 所构建的纳米酶性质稳定， 并且该纳米酶的活性较生物活 性五肽的活力显著提高， 具有良好的应用前景。 具体实施方式 0017 实施例1： 金纳米粒子的合成 0018 利用柠檬酸钠还原四氯金酸得到柠檬酸钠包覆的金纳米粒子( 参考文献 J.Phys.Chem.C200。
11、7,111,9172-9176)。 具体步骤如下， 在100mL双口圆底烧瓶(中间的接口 用于连接回流冷凝管， 侧面的接口用于反应过程中添加试剂)中， 加入48.5mL高纯水和 1.3mL四氯金酸溶液(0.01M)， 在磁力搅拌下(转速800rpm)加热至沸腾、 回流。 通过侧面的接 口， 迅速加入0.2mL柠檬酸钠溶液(0.2M)， 继续加热10min， 停止加热并持续搅拌至自然冷 却， 其最大等离子体共振吸收峰在520nm。 然后将该金纳米粒子溶液于8,000rpm离心30min， 沉淀再以高纯水溶解并稀释至金纳米粒子溶液在520nm处的吸光度值为0.9， 制得金纳米粒 子储备液， 储备液。
12、的浓度为1.41nM。 0019 实施例2： 纳米酶的制备 0020 取2mL金纳米粒子储备液， 加入510 L磷酸缓冲液(10mM， pH8)， 摇匀后快速加入40 LURGDC溶液(0.15mM)(购买于吉尔生化(上海)有限公司， 纯度98)， 立即摇匀， 4静置 24小时， 即得到具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的过氧化物纳米酶， 在4保存。 0021 实施例3： 纳米酶的GPx活性 0022 根据Wilson方法(J.Am.Chem.Soc.1989,111,5936-5939)测量生物活性五肽和纳 米酶的GPx活力(反应方程式下式所示)， 酶活力定义为37下， 每分钟氧化1 moLNADP。
13、H所 需酶的量为一个活力单位(U)， 酶的比活力定义为1 moL的酶所具有的酶的活力单位数， 表 示为U/ moL。 反应在37、 pH7.0条件下， 测得纳米酶的GPx活力为5.05U/ moL和生物活性 五肽URGDC的GPx活力为0.36U/ moL。 经典商业化模拟物Ebselen的GPx活力为0.99U/ moL 说明书 2/3 页 4 CN 106011125 A 4 (参考文献Adv.Pharmacol.1997,38,2229-2246)。 因此， 所制备的纳米酶的活力高于生物活 性五肽和Ebselen酶模拟物的酶活力， 具有高GPx酶活性。 0023 0024 实施例4： 纳米酶的稳定性 0025 纳米酶具有很好的稳定性， 该酶在pH7.0、 5mM磷酸缓冲溶液中三个月活力保持 90以上。 说明书 3/3 页 5 CN 106011125 A 5 。