技术领域
本发明涉及一种干高型高类黄酮苹果酒及其制备方法。
背景技术
酒的度数，又称酒精度，指的是酒中乙醇所占的体积百分比，如无特殊说明，通常指的是20℃时酒中乙醇所占的体积百分比。酒精度一般用x％表示，有时也用x％(V/V)或x％vol或x°表示。酒精度为x％的意思是，20℃时，100单位体积的酒中含有x单位体积的乙醇。
低度果酒，例如干红葡萄酒、干白葡萄酒，由于含有类黄酮(花青苷)、人体必需的氨基酸及矿质元素等营养保健成分，近几年在中国的消费呈明显的上升态势。但是，低度果酒的酒精含量低、刺激作用小，不能有效满足习惯喝白酒的人群的需求。为了满足习惯喝白酒人群的需求，现有技术中通常通过向发酵液里加糖或食用酒精的方式来增加低度果酒的酒精度。
酒及酒文化，是中国饮食和社会文化的重要组成部分。白酒已渗透于整个中华五千年的文明史中，从文学艺术创作、文化娱乐到饮食烹饪、养生保健等各方面都占有重要的位置。客从远方来，无酒不足以表达深情厚意。良辰佳节，无酒不足以显示欢快惬意。春风得意，无酒不足以抒发豪情壮志。因此，尽管低度果酒在中国的消费呈明显的上升态势，具有一定酒度的白酒在未来仍有很大的发展空间。
“医食同源，吃营养，吃健康”已成为人们的共识。苹果果实含有较多的人体容易吸收的游离多酚或类黄酮，在抗氧化、预防心脑血管疾病及抗肿瘤等方面均具有较好的作用，而酚酸(Phenolicacids)是一类含有酚环的有机酸，具有醒脑提神、滋阴养颜、美白肌肤、清热解火的功效，“一天一苹果，医生远离我”，世界上相当多的国家都将苹果作为主要消费果品而大力推荐。但长期以来，由于对产量和外观的过分追求，而果实多酚等一些优良性状在历史的长河中逐渐被淘汰。为此，陈学森教授所在课题组率先提出了“功能型(高类黄酮)苹果”的概念及其育种思路，为完善新品种选育方案，提高育种效率，扩大高类黄酮苹果的应用范围，采取了四项措施：一是在对新疆红肉苹果与苹果品种杂种一代果实总酚含量等性状遗传变异研究的基础上，提出并实施了“三选两早一促”的苹果育种法(专利号ZL 2013 1 0205419.6)，育种效率显著提高；二是利用遗传背景复杂的‘嘎啦’等苹果品种与新疆红肉苹果(M.sieversiif.niedzwetzkyana)进行多亲本杂交与反复回交，旨在进行品质育种，目前已构建杂(回)交一、二代分离群体40个，定植杂种实生苗4万株，并申报了“果树多种源品质育种法”(专利申请号2015 10428448.8)及“易着色苹果品种培育法”(专利申请号201510890141.X)2个育种技术发明专利；三是及时地以性状基本稳定的后代株系为试材，进行品质性状评价及发育机理的研究，并已取得了诸多重要进展；四是按照“可移动、小型化、智能化、纯天然、无添加”的理念，研制了包括一种行程式高类黄酮苹果破碎打浆器、多功能酿酒分馏器、多效冷凝烤酒器及分离储酒器等高类黄酮苹果酒加工成套设备及加工工艺。目前，已创建了常规杂交与生物技术有机结合的苹果高效育种技术体系，创制了一批新品种及优异种质，研发了苹果新品种配套高效栽培与深加工技术体系。授权和申报发明专利30余项，育成新品种(系)16个；发表相关研究论文120篇，其中SCI论文20余篇，这些研究成果总体处在国际同类研究的领先水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种干高型高类黄酮苹果酒及其制备方法。
本发明提供了一种用于生产苹果酒的组合物，包括高度酒基和低度酒基；
所述高度酒基和所述低度酒基均以高类黄酮苹果的成熟果实为原料；
所述高度酒基的制备方法依次包括如下步骤：
(1)破碎打浆；
(2)灭菌；
(3)加入果胶酶；
(4)加入酿酒酵母并进行发酵，直至发酵体系的酒精度不再升高；
(5)蒸馏并收集85-95℃之间的馏出物，然后将馏出物再次蒸馏并收集85-95℃之间的馏出物，多次，直至得到酒精度为80％以上的馏出物，即为高度酒基；
所述低度酒基的制备方法依次包括如下步骤：
(1)破碎打浆；
(2)灭菌；
(3)加入果胶酶；
(4)加入酿酒酵母并进行发酵，直至发酵体系的酒精度不再升高；
(5)收集液相，即为低度酒基。
所述高度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为唯一原料。所述高度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为清洗后的果实。所述高度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为用自来水清洗后的果实。所述高度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为用自来水彻底清洗去杂后的果实。
所述低度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为唯一原料。所述低度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为清洗后的果实。所述低度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为用自来水清洗后的果实。所述低度酒基的制备方法中，所述高类黄酮苹果的成熟果实为用自来水彻底清洗去杂后的果实。
所述高类黄酮苹果为每千克鲜重成熟果实的类黄酮含量为5000mg以上的苹果种质。所述高类黄酮苹果为每千克鲜重成熟果实的类黄酮含量为7000mg以上的苹果种质。所述高类黄酮苹果为每千克鲜重成熟果实的类黄酮含量为10000mg以上的苹果种质。所述高类黄酮苹果具体可为‘CSR6R6-888’、‘CSR6R6-666’或‘CSR6R6-777’。
所述高度酒基的制备方法的所述步骤(1)中，破碎打浆至果浆粒度为1mm以下。
所述低度酒基的制备方法的所述步骤(1)中，破碎打浆至果浆粒度为1mm以下。
所述高度酒基的制备方法的所述步骤(2)中，所述灭菌的条件为：80-100℃灭菌5-12小时。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(2)中，所述灭菌的条件具体可为：100℃、5小时。
所述低度酒基的制备方法的所述步骤(2)中，所述灭菌的条件为：80-100℃灭菌5-12小时。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(2)中，所述灭菌的条件具体可为：100℃、5小时。
所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆温度为45-55℃时，加入果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆自然冷却至温度为45-55℃时，加入果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆温度为45-50℃时，加入果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆自然冷却至温度为45-50℃时，加入果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆温度为45℃时，加入果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆自然冷却至温度为45℃时，加入果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u以上的果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u-150万u以上的果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u-150万u的果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u-150万u的果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入2-3g果胶酶。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入2-3g果胶酶。
所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆温度为45-55℃时，加入果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆自然冷却至温度为45-55℃时，加入果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆温度为45-50℃时，加入果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆自然冷却至温度为45-50℃时，加入果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆温度为45℃时，加入果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，当果浆自然冷却至温度为45℃时，加入果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u以上的果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u-150万u以上的果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u-150万u的果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入100万u-150万u的果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入2-3g果胶酶。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(3)中，所述果胶酶的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入2-3g果胶酶。
所述高度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆温度为25-35℃时，加入酿酒酵母。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆自然冷却至温度为25-35℃时，加入酿酒酵母。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆温度为30℃时，加入酿酒酵母。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆自然冷却至温度为30℃时，加入酿酒酵母。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，所述酿酒酵母的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入1010cfu酿酒酵母。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，所述酿酒酵母的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入1010cfu酿酒酵母。所述发酵的过程中，从加入酿酒酵母24小时后开始持续监测发酵体系的温度，控制温度为15-20℃。所述“直至发酵体系的酒精度不再升高”时，发酵体系的酒精度为9％-12％。所述酿酒酵母具体可为高类黄酮苹果酒酵母一号。
所述低度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆温度为25-35℃时，加入酿酒酵母。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆自然冷却至温度为25-35℃时，加入酿酒酵母。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆温度为30℃时，加入酿酒酵母。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，当果浆自然冷却至温度为30℃时，加入酿酒酵母。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，所述酿酒酵母的加入量为：每千克高类黄酮苹果的成熟果实相应加入1010cfu酿酒酵母。所述低度酒基的制备方法的所述步骤(4)中，所述酿酒酵母的加入量为：每千克鲜重的高类黄酮苹果的成熟果实相应加入1010cfu酿酒酵母。所述发酵的过程中，从加入酿酒酵母24小时后开始持续监测发酵体系的温度，控制温度为15-20℃。所述“直至发酵体系的酒精度不再升高”时，发酵体系的酒精度为9％-12％。所述酿酒酵母具体可为高类黄酮苹果酒酵母一号。
所述高度酒基的制备方法的所述步骤(5)中，所述“直至得到酒精度为80％以上的馏出物”，具体可为得到酒精度为80％-85％的馏出物。所述高度酒基的制备方法的所述步骤(5)中，所述“直至得到酒精度为80％以上的馏出物”，具体可为得到酒精度为80％的馏出物。
所述低度酒基的制备方法的所述步骤(5)中，所述“收集液相”具体可为“过600目筛，收集液相”。
所述组合物中，所述高度酒基和所述低度酒基分别独立包装。
所述组合物中，所述高度酒基和所述低度酒基的体积配比为1：0.8-1.2。
所述组合物中，所述高度酒基和所述低度酒基的体积配比为1：1。
以上任一所述组合物在制备苹果酒中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种苹果酒(干高型高类黄酮苹果酒)的制备方法，包括如下步骤：
①将1体积份所述高度酒基与0.8-1.2体积份所述低度酒基混合，先25～45℃静置24～72小时，再0～4℃静置24～72小时，收集液相，即为初酒；
②取步骤①得到的初酒，进行高低温交替熟化，得到成品酒。
所述步骤①中，将1体积份高度酒基与1体积份低度酒基混合，先30℃静置24小时，再0℃静置48小时，收集液相，即为初酒。所述步骤①中，所述“收集液相”具体可为“过600目筛，收集液相”。
所述步骤②中，所述高低温交替熟化为：先25～45℃静置24～72小时、再-18℃～-12℃静置24～72小时，重复进行15次以上。所述步骤②中，所述高低温交替熟化为：先30℃静置24小时、再-15℃静置48小时，重复进行15次。
所述方法制备得到的苹果酒(干高型高类黄酮苹果酒)也属于本发明的保护范围。所述苹果酒的度数为42％-48％，具体可为45％。
‘CSR6R6-888’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-888，已于2017年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.14295。
‘CSR6R6-666’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-666，已于2017年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.13783。
‘CSR6R6-777’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-777，已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.12468。
高类黄酮苹果酒酵母一号，全称为酵母菌(Saccharomyces sp.)高类黄酮苹果酒酵母一号，已于2017年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.14250。
有效利用高类黄酮苹果优异种质及高类黄酮苹果酒加工成套设备，研制既具有苹果特有的功能成分、果香浓郁，又具有较强的刺激性和白酒口感、可以满足不同消费人群需求的系列高类黄酮苹果酒，对于拉长苹果产业链、丰富酒品市场多样性、提高企业产品质量与效益、满足市场和消费需求具有重要意义。本发明提供的干高型高类黄酮苹果酒，既含有类黄酮、酚酸及矿质元素等苹果特有的功能保健成分，又具有较强的刺激性和白酒口感，酒香协调，入口纯正，浓醇，回味绵长，适合喝高度白酒的人群饮用，具有重大的应用推广价值以及庞大的市场前景。
附图说明
图1为‘CSR6R6-888’干高型高类黄酮苹果酒的照片。
图2为‘CSR6R6-888’干高型高类黄酮苹果酒的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
提及‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果的参考文献：陈学森，辛培刚等，元帅和金帅在苹果新品种选育中的作用，山东农业大学学报，1994，25(2)：236—248。
0.5％盐酸甲醇溶液的制备方法：将0.5体积份35％浓盐酸与99.5体积份甲醇混合。
实施例中所用的果胶酶均为购自宁夏和氏璧生物技术有限公司的果胶酶，相关参数为：固体粉末，酶活≥50万u/g,建议使用条件为“pH3.2-5.0，10-50℃”。50.0℃、pH3.5条件下，1min催化果胶水解生成1μg半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位(1u)。
实施例1、苹果优异种质‘CSR6R6-888’的获得和鉴定
鉴定苹果植株为R1R1基因型、R6R6基因型还是R6R1基因型的方法如下：从待测苹果植株上取苹果，提取苹果果肉的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，然后按如下标准判读基因型：如果PCR扩增产物为一条带且为497bp，待测苹果植株为R6R6基因型；如果PCR扩增产物为一条带且为386bp，待测苹果植株为R1R1基因型；如果PCR扩增产物为两条带且分别为497bp和386bp，待测苹果植株为R6R1基因型。
F3(序列1)：5’-GGTGGTCAAAGATGTGTGTTGT-3’；
R3(序列2)：5’-TTTGCCTGCTACCCACTTCA-3’。
经检测，‘红富士’苹果和‘嘎啦’苹果均为R1R1基因型。
一、‘CSR6R6-888’的获得
新疆红肉苹果作为亲本，与‘红富士’等白肉栽培苹果品种杂交。按照孟德尔遗传定律，新疆红肉苹果(R6R1基因型)与‘红富士’(R1R1基因型)等白肉栽培苹果品种杂交,其后代群体应为红肉表型(R6R1基因型):白肉表型(R1R1基因型)＝1:1。但是，在杂交F1代群体中发现了R6R6基因型的单株。
将一株R6R6基因型的单株命名为‘CSR6R6-888’。
‘CSR6R6-888’具有如下表型：茎、叶、花、果皮和果肉等各部分及各个发育阶段均为深紫红色。
‘CSR6R6-888’的果实鲜食品质：酸甜适口，酥脆多汁，鲜食品质优良。
通过嫁接枝条或组培的方式，将‘CSR6R6-888’扩繁。
二、‘CSR6R6-888’的保藏
‘CSR6R6-888’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-888，已于2017年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.14295。
三、‘CSR6R6-666’的保藏
‘CSR6R6-666’是发明人所在的实验室前期选育出来的另一株R6R6基因型的单株。
‘CSR6R6-666’具有如下表型：茎、叶、花、果皮和果肉等各部分及各个发育阶段均为紫红色。
‘CSR6R6-666’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-666，已于2017年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.13783。
四、‘CSR6R6-777’的保藏
‘CSR6R6-777’是发明人所在的实验室前期选育出来的另一株R6R6基因型的单株。
‘CSR6R6-777’，又称苹果(Malus domestica)CSR6R6-777，已于2016年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.12468。
五、类黄酮组分含量分析
分别将‘CSR6R6-888’、‘CSR6R6-666’和‘CSR6R6-777’作为待测植株。
1、取待测植株上的成熟苹果，取苹果果肉。
2、取步骤1得到的果肉，在液氮中研磨得到粉末。
3、称取2g步骤2得到的粉末，加入5mL 0.5％盐酸甲醇溶液，4℃静置提取2h，然后8000rpm离心20min，分别收集上清液和残渣。
4、取步骤3得到的残渣，加入5mL 0.5％盐酸甲醇溶液，4℃静置提取1h，然后8000rpm离心20min，收集上清液。
5、将步骤3得到的上清液和步骤4得到的上清液混合，得到混合液。
6、取步骤5得到的混合液，37℃旋蒸除去甲醇，残留物用2-3ml甲醇溶解，然后8000rpm离心20min，收集上清液。
7、取步骤6得到的上清液，用甲醇定容至5ml，然后用0.45μm滤膜过滤，收集滤液。
8、将步骤7得到的滤液进行HPLC-MS分析。
液相色谱条件：
采用WATERS ACQUITY UPLC色谱仪，色谱柱为BEH C18柱(100mm×2.1mm)，填料粒径1.7μm；柱温45℃；进样体积1μL；
流动相为A液和B液的混合液，流速为0.3mL/min；A液为乙腈，B液为含0.2％(体积分数)甲酸的水溶液；0-0.1min，A液占流动相的体积分数为5％；0.1-20min，A液占流动相的体积分数由5％线性上升至20％；20-22min，A液占流动相的体积分数由20％线性上升至80％；22-22.1min，A液占流动相的体积分数由80％线性下降至5％；22.1-25min，A液占流动相的体积分数为5％。
质谱条件：
质谱仪为WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，ESI电离源，电喷雾离子化正离子采集模式(ESI+)；扫描范围100-1500m/z；毛细管电压3.5kV，锥孔电压30V；源温度100℃，脱溶温度300℃；脱溶剂气流量500L/h。
9种特定黄酮醇物质的含量见表1。表1中的9种特有物质的检测方法均属于类黄酮组分及含量检测方法，参考文献(陈学森,张晶,刘大亮,等.新疆红肉苹果杂种一代的遗传变异及功能型苹果优株评价[J].中国农业科学,2014,47(11):2193-2204.。
表1
以上结果表明，‘CSR6R6-888’、‘CSR6R6-666’和‘CSR6R6-777’均具有很强的类黄酮合成能力，果肉富含类黄酮，并且含有特殊的黄酮醇类组分，为高类黄酮苹果品种的优异种质。‘CSR6R6-888’优于‘CSR6R6-666’，‘CSR6R6-666’优于‘CSR6R6-777’。
六、类黄酮含量测定
分别将‘CSR6R6-888’、‘CSR6R6-666’和‘CSR6R6-777’作为待测植株。
(1)取待测植株上的成熟苹果果实，取苹果果肉。
(2)取1g果肉，液氮研磨，然后加入10ml 4℃预冷的65％(体积百分含量)乙醇水溶液并混匀，4℃避光静置提取4h，然后12000g离心20min，收集上清液。
(3)取试管，加入0.5ml步骤(2)得到的上清液，然后依次加入1mL 5g/100ml NaNO2水溶液、1ml 10g/100ml AL(NO3)3水溶液、4mL 2M NaOH水溶液，混匀后静置15min，8000rpm离心10min，取上清，然后在510nm下测定吸光值。
以芦丁(rutin,Sigma chemical,ST,Loiuis,USA)为标样做标准曲线。
‘CSR6R6-888’的苹果果实的类黄酮含量为11358.7mg/kg鲜重。
‘CSR6R6-666’的苹果果实的类黄酮含量为9134.6mg/kg鲜重。
‘CSR6R6-777’的苹果果实的类黄酮含量为7555.1mg/kg鲜重。
实施例2、酵母菌株的获得
一、天然酵母的驯化和分离
‘CSR6R6-888’植株上生长的苹果成熟时，在果园中选择优良的苹果带回无菌室，将果皮切成小块放入已杀过菌的装有果汁的试管中，塞好棉塞置于25～28℃恒温培养箱中培养5～8d。采用平板划线分离法分离酵母菌株，每个发酵醪液做3个平板，28℃恒温箱中培养3d。对菌落进行形态观察,从平板上挑取分离良好、具有典型性的单菌落，分别接种于试管斜面和经灭菌的大试管苹果汁中，每个发酵醪液的3个平板上只挑选3个单菌落，并编号标记,以示菌株来源。试管斜面置于28℃培养3d,检查菌苔是否单纯,菌苔单纯的好菌株置冰箱中贮存。
二、酵母筛选
1、杜氏管发酵筛选。
采用杜氏管发酵法，在相同的培养条件下，测定酵母菌株产气泡的快慢及在规定时间内产气泡的多少，初步比较各株酵母菌的起酵能力和发酵能力，筛选出发酵性能优良的酵母菌株。试验平行重复3次。菌株活化条件：25℃于10°Brix的苹果汁中恒温培养24h。发酵条件：20℃于15°Brix的苹果汁中静止发酵48h。
2、酵母菌发酵力测试(CO2失重法)。
3、酵母菌凝聚性比较(酵母数比较法)。
4、酵母菌的耐乙醇、耐SO2试验。
采用杜氏管发酵法,将酵母菌分别接入不同乙醇浓度(6％、8％、10％、12％,V/V)和不同SO2浓度(50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L)的苹果汁中，在相同条件下进行培养，观察杜氏管中的气泡产生情况，比较各酵母菌株对乙醇、SO2的耐受程度，进一步确定适合苹果酒酿造的菌株。试验平行重复3次。菌株活化条件：25℃于10°Brix的苹果汁中恒温培养24h。发酵条件：20℃于15°Brix的苹果汁中静止发酵96h(由于乙醇或SO2的存在，对酵母菌的发酵在不同程度上会产生抑制作用，故产气观察时间延长为96h)。接种量：(6～8)×107个/ml。
5、酵母菌酿制苹果酒发酵试验。
取500ml三角瓶,加入400ml苹果汁(糖度20°Brix)，按20ml/L的接种量接入菌浓度为(3～3.6)×106个/ml的酵母菌种子液，20℃发酵。发酵至第15d进行倒罐，去除酒脚，再陈酿10d后，测定苹果酒的理化指标并进行感官分析。
通过酵母发酵力比较、凝聚力比较、耐SO2、耐乙醇能力比较和对其发酵所得苹果酒的理化指标分析及感官品质评价，筛选出三株最佳苹果酒酿酒酵母，分别命名为高类黄酮苹果酒酵母一号、高类黄酮苹果酒酵母二号、高类黄酮苹果酒酵母三号。
三、比较步骤二得到的三株酵母菌生产苹果酒的性能
待测酵母分别为：高类黄酮苹果酒酵母一号、高类黄酮苹果酒酵母二号或高类黄酮苹果酒酵母三号。
1、取‘CSR6R6-888’无腐烂的成熟果实，用自来水彻底清洗。
2、完成步骤1后，取果实，进行破碎打浆，直至果浆粒度为1mm以下。
3、完成步骤2后，将果浆进行灭菌(80℃，12小时)。
4、完成步骤3后，自然冷却，当果浆温度为50℃时加入果胶酶(每1000g鲜重的果实，加入2-3g果胶酶)。
5、完成步骤4后，继续自然冷却，当果浆温度为30℃时，加入待测酵母(每1000g鲜重的果实，加入1010cfu的待测酵母)，进行发酵。发酵过程中持续监测发酵体系的酒精度，当酒精度不再升高时停止发酵(此时体系的酒精度为9％-12％)。发酵过程中，从加入待测酵母24小时后开始持续监测发酵体系的温度，控制温度为15-20℃。
对得到的苹果酒进行理化指标分析及感官品质评价，高类黄酮苹果酒酵母一号的各项指标最理想，可耐12％的乙醇,其发酵的原酒酒精度达11.9％，酒体澄清透明,具有苹果酒的典型风味。
四、高类黄酮苹果酒酵母一号的鉴定
形态特征：呈椭圆球形，有明显的细胞核和大小不等的液泡。
生理生化特征：可以利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖发酵产气，可以同化葡萄糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、纤维二糖、柠檬酸，不能产酸及类淀粉化合物，可以产酯香味物质。
生长特征：最适生长pH5.5-6.5,最适生长温度29-31℃。
五、高类黄酮苹果酒酵母一号的保藏
高类黄酮苹果酒酵母一号，全称为酵母菌(Saccharomyces sp.)高类黄酮苹果酒酵母一号，已于2017年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.14250。
采用高类黄酮苹果酒酵母一号作为酿酒酵母进行实施例3和实施例4。
实施例3、高度酒基的制备
分别采用‘CSR6R6-888’上的苹果、‘CSR6R6-666’上的苹果和‘CSR6R6-777’上的苹果果实制备高度酒基。
1、取无腐烂的成熟苹果果实，用自来水彻底清洗去杂。
2、完成步骤1后，取果实，进行破碎打浆，直至果浆粒度为1mm以下。
3、完成步骤2后，将果浆进行灭菌(100℃、5小时；实际应用中可采用80-100℃灭菌5-12小时，当温度较低时采用较长的灭菌时间，当温度较高时采用较短的灭菌时间，例如当80℃时采用10-12小时的灭菌时间，当100℃时采用5小时的灭菌时间)。
4、完成步骤3后，自然冷却，当果浆温度为45℃(实际应用中，可采用45-55℃，具体可采用45-50℃)时，加入果胶酶(每1000g鲜重的果实，加入2-3g果胶酶；2-3g果胶酶的酶活为100万u-150万u以上)。
5、完成步骤4后，继续自然冷却，当果浆温度为30℃(实际应用中，可采用25-35℃)时，加入酿酒酵母(每1000g鲜重的果实，加入1010cfu酿酒酵母)，进行发酵。发酵过程中持续监测发酵体系的酒精度，当酒精度不再升高时停止发酵(此时体系的酒精度为9％-12％)。发酵过程中，从加入酿酒酵母24小时后开始持续监测发酵体系的温度，控制温度为15-20℃。
6、完成步骤5后，进行蒸馏，收集85-95℃之间的馏出物。该馏出物的酒精度约为20％。
7、取步骤6得到的馏出物，进行多次蒸馏，每次均收集收集85-95℃之间的馏出物，直至得到酒精度为80％以上的馏出物，即为高度酒基。
‘CSR6R6-888’得到的高度酒基命名为‘CSR6R6-888’高度酒基。本实施例得到的‘CSR6R6-888’高度酒基的酒精度为80％。
‘CSR6R6-666’得到的高度酒基命名为‘CSR6R6-666’高度酒基。本实施例得到的‘CSR6R6-666’高度酒基的酒精度为80％。
‘CSR6R6-777’得到的高度酒基命名为‘CSR6R6-777’高度酒基。本实施例得到的‘CSR6R6-777’高度酒基的酒精度为80％。
实施例4、低度酒基的制备
分别采用‘CSR6R6-888’上的苹果、‘CSR6R6-666’上的苹果和‘CSR6R6-777’上的苹果果实制备低度酒基。
1、取无腐烂的成熟苹果果实，用自来水彻底清洗去杂。
2、完成步骤1后，取果实，进行破碎打浆，直至果浆粒度为1mm以下。
3、完成步骤2后，将果浆进行灭菌(100℃、5小时；实际应用中可采用80-100℃灭菌5-12小时，当温度较低时采用较长的灭菌时间，当温度较高时采用较短的灭菌时间，例如当80℃时采用10-12小时的灭菌时间，当100℃时采用5小时的灭菌时间)。
4、完成步骤3后，自然冷却，当果浆温度为45℃(实际应用中，可采用45-55℃，具体可采用45-50℃)时，加入果胶酶(每1000g鲜重的果实，加入2-3g果胶酶；2-3g果胶酶的酶活为100万u-150万u以上)。
5、完成步骤4后，继续自然冷却，当果浆温度为30℃(实际应用中，可采用25-35℃)时，加入酿酒酵母(每1000g鲜重的果实，加入1010cfu酿酒酵母)，进行发酵。发酵过程中持续监测发酵体系的酒精度，当酒精度不再升高时停止发酵(此时体系的酒精度为9％-12％)。发酵过程中，从加入酿酒酵母24小时后开始持续监测发酵体系的温度，控制温度为15-20℃。
6、完成步骤5后，过600目筛，收集液相，即为低度酒基。
‘CSR6R6-888’得到的低度酒基命名为‘CSR6R6-888’低度酒基。本实施例得到的‘CSR6R6-888’低度酒基的酒精度为10％。
‘CSR6R6-666’得到的低度酒基命名为‘CSR6R6-666’低度酒基。本实施例得到的‘CSR6R6-666’低度酒基的酒精度为10％。
‘CSR6R6-777’得到的低度酒基命名为‘CSR6R6-777’低度酒基。本实施例得到的‘CSR6R6-777’低度酒基的酒精度为10％。
实施例5、干高型高类黄酮苹果酒的制备
1、将1体积份高度酒基与1体积份低度酒基混合，先30℃静置24小时，再0℃静置48小时，然后过600目筛，收集液相，即为初酒。实际应用中，可先25至45℃静置24至72小时，再0至4℃静置24至72小时。
2、取步骤1得到的初酒，进行高低温交替熟化(先30℃静置24小时、再-15℃静置48小时，重复进行15次)，得到成品酒。实际应用中，可先25至45℃静置24至72小时、再-18℃至-12℃静置24至72小时，重复进行15次以上。
采用实施例3制备的‘CSR6R6-888’高度酒基和实施例4制备的‘CSR6R6-888’低度酒基制备得到的成品酒命名为‘CSR6R6-888’干高型高类黄酮苹果酒。‘CSR6R6-888’干高型高类黄酮苹果酒的照片见图1和图2。
采用实施例3制备的‘CSR6R6-666’高度酒基和实施例4制备的‘CSR6R6-666’低度酒基制备得到的成品酒命名为‘CSR6R6-666’干高型高类黄酮苹果酒。
采用实施例3制备的‘CSR6R6-777’高度酒基和实施例4制备的‘CSR6R6-777’低度酒基制备得到的成品酒命名为‘CSR6R6-777’干高型高类黄酮苹果酒。
实施例6、酒精度检测和感官描述
取实施例5制备的三种干高型高类黄酮苹果酒，检测酒精度和感官指标。
结果见表2。酒精度为45％的干高型高类黄酮苹果酒，外观为橙红色、澄清透明，酒香浓厚、果香绵长，入口纯正，浓醇，回味绵长。
表2
实施例7、食品安全国家标准相关指标检测
取实施例5制备的三种干高型高类黄酮苹果酒，根据食品安全国家标准GB2757-2012和GB2760-2014检测甲醇和重金属含量。
结果表明，实施例5制备的三种干高型高类黄酮苹果酒中的甲醇含量符合食品安全指标的国家标准，实施例5制备的三种干高型高类黄酮苹果酒中的铝、锰等重金属含量均符合食品安全指标的国家标准。
实施例8、营养保健成分检测
以山东泰安酒厂生产的酒精度为42％的泰山五岳独尊白酒为对照。分别检测实施例5制备的三种干高型高类黄酮苹果酒和对照酒的类黄酮含量、酚酸含量和矿质元素含量。
一、提取
1、取20mL待测酒，用1mol/L NaOH调pH值至7，用乙酸乙酯萃取3次(每次加入20mL乙酸乙酯，充分混合后静置分层，然后收集有机相),将三次萃取收集的有机相混合，然后40℃旋转蒸发溶剂，此时得到的残留物即为类黄酮(中性酚)，加入2mL甲醇溶解残留物，然后用0.22μm滤膜过滤，然后进行HPLC测定。
2、取步骤1中3次萃取后剩余的酒液，用2mol/L HCl调pH值至2，用乙酸乙酯萃取3次(每次加入20mL乙酸乙酯，充分混合后静置分层，然后收集有机相),将三次萃取收集的有机相混合，然后40℃旋转蒸发溶剂，此时得到的残留物即为酚酸(酸性酚)，加入2mL甲醇溶解残留物，然后用0.22μm滤膜过滤，然后进行HPLC测定。
二、HPLC检测
1、HPLC检测类黄酮的相关参数
高效液相色谱装置型号为2695(Waters，Milford，MA，USA)，二极管阵列检测器(PDA 2998Waters，Milford，MA，USA)，季泵和自动采样器；分离柱为对称C 18(4.6×150毫米，3.5μm)柱(Waters，Milford，MA，USA)，柱温20℃。
进样量为10μL。
流动相由溶剂A(含体积比为2.5％的乙酸的水溶液)和溶剂B(乙腈)组成，或者，流动相为溶剂B。洗脱过程(流速1mL/min)：0-5min，溶剂B占流动相的体积分数由3％线性上升至9％；6-15min，溶剂B占流动相的体积分数由9％线性上升至16％；16-33min，溶剂B占流动相的体积分数由16％线性上升至36.4％；34-38min溶剂B占流动相的体积分数保持100％；最后柱子修复10分钟(溶剂B占流动相的体积分数为3％)。
黄烷醇和二氢查尔酮的检测波长为280nm，黄酮醇的检测波长为360nm。黄烷醇包括儿茶素、表儿茶素、原花青素B2。二氢查耳酮包括根皮苷。黄酮醇包括山奈酚、芦丁、异槲皮苷(槲皮素-3-葡萄糖苷)、番石榴苷(槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷)、金丝桃苷(槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷)、槲皮素鼠李糖苷。
儿茶素标准品的出峰时间为12.52min。表儿茶素标准品的出峰时间为16.06min。原花青素B2标准品的出峰时间为13.83min。根皮苷标准品的出峰时间为27.76min。山奈酚标准品的出峰时间为36.86min。芦丁标准品的出峰时间为21.37min。异槲皮苷标准品的出峰时间为23.25min。番石榴苷标准品的出峰时间为24.39min。金丝桃苷标准品的出峰时间为22.64min。槲皮素鼠李糖苷标准品的出峰时间为25.35min。以上标准品均购自Sigma-Aldrich Co。
2、HPLC检测酚酸的相关参数
高效液相色谱装置型号为2695(Waters，Milford，MA，USA)，二极管阵列检测器(PDA 2998Waters，Milford，MA，USA)，季泵和自动采样器；分离柱为对称C 18(4.6×150毫米，3.5μm)柱(Waters，Milford，MA，USA)，柱温30℃。
进样量为10μL。
流动相由乙腈和0.6％(体积比)乙酸水溶液组成。洗脱过程(流速0.5mL/min)：0-35min，乙腈占流动相的体积分数由5％线性上升至35％；36-40min，乙腈占流动相的体积分数保持35％；41-42min，乙腈占流动相的体积分数由35％线性下降至5％。
检测波长280nm。
没食子酸标准品的出峰时间为6.51min。对羟基苯甲酸标准品的出峰时间为15.33min。儿茶酸标准品的出峰时间为15.55min。绿原酸标准品的出峰时间为15.60min。咖啡酸标准品的出峰时间为17.29min。丁香酸标准品的出峰时间为17.3min。香兰素标准品的出峰时间为21.66min。香豆酸标准品的出峰时间为22.35min。阿魏酸标准品的出峰时间为24.09min。苯甲酸标准品的出峰时间为28.35min。香豆素标准品的出峰时间为30.69min。肉桂酸标准品的出峰时间为37.21min。根皮素标准品的出峰时间为38.49min。以上标准品均购自Sigma-Aldrich Co。
三、矿质元素检测
仪器：电感藕合等离子质谱(ICP-MS，美国Thermo Fisher Scientific公司)；WX-8000微波消解仪(上海屹尧仪器科技发展有限公司)；Dura series超纯水处理系统；仪器的工作参数见表3。
表3
各个单元素标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心，1000μg/mL)。标准溶液的配制(采用5％HNO3水溶液为溶剂)：吸取单元素标准溶液，稀释为20mg/L的储备液，再稀释为200μg/L、400μg/L的储备液，再依次配制得到8μg/L、16μg/L、24μg/L、32μg/L、48μg/L、64μg/L的系列标准溶液，摇匀待用。采用5％HNO3水溶液作为0浓度标注溶液。将标准溶液进行质谱检测，制作标准曲线。
称取0.2-1g待测酒样品至聚四氟乙烯消解罐中(精确至0.1mg)，加入5mL浓硝酸(浓硝酸质量分数约为68％)，然后将消解罐放入微波消解仪中，消解程序见表4。然后自然冷却，待温度冷却至50℃以下后，取出消解罐放入通风橱中，打开消解罐，用超纯水润洗，然后将消解罐中的液相转移至50mL容量瓶中，用超纯水稀释定容至刻度，然后进行质谱检测。对照标准曲线计算待测酒样品中各个单元素的含量。
表4
步骤 温度(℃) 保温时间(min) 1 100 3 2 140 3 3 160 3 4 180 3 5 190 15
四、结果
三种干高型高类黄酮苹果酒以及对照酒中的类黄酮组分含量见表5。三种干高型高类黄酮苹果酒以及对照酒中的酚酸组分含量见表6。三种干高型高类黄酮苹果酒以及对照酒中的矿质元素含量见表7。以高类黄酮优异种质CSR6R6-666、CSR6R6-777和CSR6R6-888的成熟苹果果实为原料制成的3种干高型高类黄酮苹果酒的类黄酮组分含量、酚酸组分含量及矿质元素含量均显著高于类似度数的对照酒，其中CSR6R6-888的成熟苹果果实为原料制成的干高型高类黄酮苹果酒中类黄酮组分含量、酚酸组分含量及矿质元素含量最高。
表5类黄酮组分含量
表6酚酸组分含量
表7矿质元素含量
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 干高型高类黄酮苹果酒及其制备方法
<130> GNCYX171208
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtggtcaaa gatgtgtgtt gt 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttgcctgct acccacttca 20