一种疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102220419 B (45)授权公告日 2013.06.12 CN 102220419 B *CN102220419B* (21)申请号 201110105572.2 (22)申请日 2011.04.26 C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (73)专利权人 广东出入境检验检疫局检验检疫 技术中心 地址 510623 广东省广州市珠江新城花城大 道 66 号 (72)发明人 师永霞 黄吉城 李小波 幸芦琴 苏锦坤 刘静宇 郑夔 洪烨 郭波旋 钟玉清 相大鹏 陈永红 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 。

2、代理人 刘孟斌 WO 2010/080616 A1,2010.07.15, A. Calderaro 等 .Genetic Polymorphisms Influence Plasmodium ovale PCR Detection Accuracy.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY .2007, 第 45 卷 ( 第 5 期 ),1624-1627. Sandra E. Shokoples 等 .Multiplexed Real-Time PCR Assay for Discrimination of Plasmodium Species with Impro。

3、ved Sensitivity for Mixed Infections.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY .2009, 第 47 卷 ( 第 4 期 ),975-980. Abdulsalam MQ Al-Mekhlafi1等.Molecular epidemiology of Plasmodium species prevalent in Yemen based on 18 s rRNA. Parasites & Vectors .2010, 第 3 卷 110. 师永霞等.疟疾的实时荧光PCR 快速检测方 法 .中国卫生检验杂志 .2011, 第 21 卷。

4、 ( 第 3 期 ),625-627. (54) 发明名称 一种疟疾通用型及其分型的巢式 PCR 检测及 荧光 PCR 检测试剂盒 (57) 摘要 本发明提供了一种疟疾通用型及其分型的巢 式PCR及荧光PCR检测试剂盒， 包括PCR缓冲液和 Taq DNA聚合酶混合物， 还包括如SEQ ID NO ： 1-26 所示的引物及探针。该试剂盒能检测疟原虫属特 异性和恶性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟等四种疟 原虫分型， 用该试剂盒检测还发现了一例国内罕 见的输入性卵形疟疾病例。该试剂盒能应用于临 床、 口岸中疟疾的检验。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丽华 权利要求书 1 。

5、页 说明书 14 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书14页 附图5页 (10)授权公告号 CN 102220419 B CN 102220419 B *CN102220419B* 1/1 页 2 1. 一种疟疾通用型及其分型的巢式 PCR 检测及荧光 PCR 检测试剂盒， 包括 PCR 缓冲液 和 Taq DNA 聚合酶混合物， 其特征在于， 还包括核酸序列如 SEQ ID NO:1-26 所示的引物及 探针， 其中， W 代表碱基 A 或 T， Y 代表碱基 C 或 T， M 代表碱基 A 或 C， R 代表碱基 A 或 G ； 。

6、所述分型包括 ： 恶性疟、 间日疟、 卵形疟和三日疟四种型别 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:1-3 所示的引物及探针用于疟疾通用型荧光 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:4-6 所示的引物及探针用于恶性疟的荧光 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:7-9 所示的引物及探针用于间日疟的荧光 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:10-11 所示的引物用于卵形疟的荧光 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:12-14 所示的引物及探针用于三日疟的荧光 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:15-18 所。

7、示的引物用于疟疾通用型巢式 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:15-16 及 19-20 所示的引物用于恶性疟巢式 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:15-16 及 21-22 所示的引物用于间日疟巢式 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:15-16 及 23-24 所示的引物用于卵形疟巢式 PCR 检测 ； 所述核酸序列如 SEQ ID NO:15-16 及 25-26 所示的引物用于三日疟巢式 PCR 检测。 权 利 要 求 书 CN 102220419 B 2 1/14 页 3 一种疟疾通用型及其分型的巢式 PCR 检测及荧光 P。

8、CR 检测 试剂盒 技术领域 0001 本发明属于分子生物学检测领域， 特别涉及一种疟疾通用型及其分型的巢式 PCR 检测及荧光 PCR 检测试剂盒， 该试剂盒可检测疟原虫属特异性和恶性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟等四种疟原虫种特异性。 背景技术 0002 疟疾诊断金标准是镜检， 它不但需要操作者具有丰富的经验， 而且当原虫密度较 低时， 镜检容易出现漏诊 ； 即使是有经验的专业镜检员检测原虫低密度样本， 镜检的敏感性 和特异性也会显著下降。对于国内少见的卵形疟和三日疟， 容易发生错判。传统镜检法的 局限性以及熟练镜检人员的缺乏导致疟疾病例的确诊与鉴别诊断困难， 成为疟疾监测中新 的挑战。。

9、而且发生疟原虫混合感染时， 镜检不易将恶性疟的环状体或早期滋养体与间日疟 的环状体区分开， 特别是用药后虫体形态发生变化， 虫种鉴别较难， 容易出现误诊， 这样影 响了疟原虫感染后的治疗。因此， 使用传统的镜检法作 “金” 标准已难于评价效率较高的诊 断方法。 0003 近年来国内外将巢式 PCR 和实时荧光 PCR 技术应用于疟疾的快速检测和分型， 它 能准确判断疑似病例是否感染疟疾或携带疟原虫， 以便及时发现和采取必要的防控措施， 防止该传染病在国境口岸的传入和传出。但是， 目前还缺乏可以检测疟原虫属特异性和恶 性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟等四种疟原虫分型的方法和试剂盒。 发明内容 。

10、0004 本发明提供了一种疟疾通用型及其分型的巢式 PCR 及荧光 PCR 检测试剂盒， 该试 剂盒能检测疟原虫属特异性和恶性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟等四种疟原虫分型， 用该试 剂盒检测还发现了一例国内罕见的输入性卵形疟疾病例。 0005 本发明采用如下的技术方案 ： 0006 本发明的疟疾通用型及其分型的巢式 PCR 检测及荧光 PCR 检测试剂盒， 包括 PCR 缓冲液和 Taq DNA 聚合酶混合物， 还包括如表 1 所列的引物及探针 ( 如 SEQ ID NO ： 1-26 所 示 )， 其中， W 代表 A 或 T， Y 代表 C 或 T， M 代表碱基 A 或 C， R 代。

11、表碱基 A 或 G。所述分型包 括 ： 恶性疟、 间日疟、 卵形疟和三日疟四种型别。所述核酸序列如 SEQ ID NO ： 1-3 所示的引 物及探针用于疟疾通用型荧光 PCR 检测。所述核酸序列如 SEQ ID NO ： 4-6 所示的引物及探 针用于恶性疟的荧光 PCR 检测， 所述核酸序列如 SEQ ID NO ： 7-9 所示的引物及探针用于间 日疟的荧光PCR检测， 所述核酸序列如SEQ ID NO ： 10-11所示的引物用于卵形疟的荧光PCR 检测， 所述核酸序列如 SEQ IDNO ： 12-14 所示的引物及探针用于三日疟的荧光 PCR 检测。所 述核酸序列如 SEQ ID 。

12、NO ： 15-18 所示的引物用于疟疾通用型巢式 PCR 检测， 所述核酸序列 如 SEQ ID NO ： 15-16 及 19-20 所示的引物用于恶性疟巢式 PCR 检测， 所述核酸序列如 SEQ ID NO ： 15-16 及 21-22 所示的引物用于间日疟巢式 PCR 检测， 所述核酸序列如 SEQ ID NO ： 说 明 书 CN 102220419 B 3 2/14 页 4 15-16 及 23-24 所示的引物用于卵形疟巢式 PCR 检测， 所述核酸序列如 SEQ IDNO ： 15-16 及 25-26 所示的引物用于三日疟巢式 PCR 检测。 0007 通用型巢式 PCR。

13、 检测用 rPLUout-FP、 rPLUout-RP、 rPLUin-FP、 rPLUin-RP 引物 ； 分 型巢式 PCR 检测用 rPLUout-FP、 rPLUout-RP 及检测恶性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟的特异 性引物 ； 荧光 PCR 检测分别用通用型或恶性疟、 间日疟、 三日疟特异性的引物及荧光标记探 针 ； 卵形疟荧光检测用 OVA-FP 和 OVA-RP 引物。各引物探针序列 ( 为 5 -3 ) 如下表 1 所 示， 表 1 是疟原虫巢式 PCR 及荧光 PCR 检测的引物和探针。 0008 表 1 0009 0010 使用了如下的软件进行上述引物探针的设计 ：。

14、 使用 Lasergene 软件包的 EditSeq 和 MegAlign 工具进行 DNA 序列分析和同源性比较。用 Primer Express3.0 软件设计实时 荧光 RT-PCR 检测所需的特异性引物和 FAM 荧光探针， 用 Primer Premier 5.0 软件设计一 般的 PCR 引物。 0011 上述试剂盒的使用方法 ： 说 明 书 CN 102220419 B 4 3/14 页 5 0012 (1) 通用型巢式 PCR 检测用 rPLUout-FP、 rPLUout-RP、 rPLUin-FP、 rPLUin-RP 引 物 ； 0013 进行巢式 PCR 第一次扩增时，。

15、 使用 rPLUout-FP、 rPLUout-RP 进行 PCR 反应， PCR 反 应程序为 ： 94 2min ； 94 1min， 52 1min， 72 2min， 35 个循环 ； 72 10min ； 4。 0014 进行巢式 PCR 第二次扩增时， 使用 rPLUin-FP、 rPLUin-RP 引物， PCR 反应程序为 ： 94 2min ； 94 1min， 58 1min， 72 1min， 35 个循环 ； 72 10min ； 4。 0015 (2)分型巢式PCR检测用rPLUout-FP、 rPLUout-RP及检测恶性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟的特异性引物。

16、 ； 0016 进行巢式 PCR 第一次扩增时， 使用 rPLUout-FP、 rPLUout-RP 进行 PCR 反应， PCR 反 应程序为 ： 94 2min ； 94 1min， 52 1min， 72 2min， 35 个循环 ； 72 10min ； 4。 0017 进行巢式 PCR 第二次扩增时， 使用恶性疟、 间日疟、 卵形疟和三日疟特异性引物， PCR 反应程序为 ： 94 2min ； 94 1min， 58 1min， 72 1min， 35 个循环 ； 72 10min ； 4。 0018 (3) 荧光 PCR 检测分别用通用型或恶性疟、 间日疟、 三日疟特异性的引物及。

17、荧光标 记探针 ； 0019 使用Fast Universal PCR Master Mix 进行体系配置， 反应总体积 20l， 包括主反应混合液 10l、 10M 正向引物 1l、 10M 反向引物 1l、 5M 探针 1l、 DNA 7l， 同时分别以 DEPCH2O 和 DNA 阳性模板作为阴性和阳性对照。扩增和检测在 ABI 7900HTFast 荧光定量 PCR 仪器上进行， 反应程序为 ： 95 20s ； 95 1s， 58 20s， 40 个 循环， 在 58收集荧光。 0020 (4) 卵形疟荧光检测用 OVA-FP 和 OVA-RP 引物 0021 进行卵形疟的实时荧光 。

18、PCR 检测时 ： 采用染料掺入法进行卵形疟的实时荧光 PCR 检测。反应引物为 OVA-FP 和 OVA-RP， 实时荧光 PCR 反应程序为 ： 95 15min ； 94 15s， 50 30s， 72 30s( 收集荧光 )， 40 个循环 ； 最后对 PCR 产物进行熔解曲线分析。 0022 上述试剂盒可以应用在临床、 口岸检验中。 0023 本发明的试剂盒能检测疟原虫属特异性和恶性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟等四种 疟原虫分型， 而且还能发现一例国内罕见的输入性卵形疟疾病例。 该试剂盒能应用于临床、 口岸中疟疾的检验。 附图说明 0024 图 1 为疟原虫通用型巢式 PCR 检。

19、测的一个优选实施例的结果图 ； 0025 图 2 为疟原虫的特异性巢式 PCR 检测的一个优选实施例的结果图 ； 0026 图 3 为疟原虫的镜检与荧光 PCR 比较检测的一个优选实施例的结果图 ； 0027 图 3-1 为 40 份镜检阳性的样本的荧光 PCR 检测结果图 ； 0028 图 3-2 为 20 份镜检阴性的样本的荧光 PCR 检测结果图 ； 0029 图 4 为疟原虫的荧光 PCR 分型检测结果图 ； 0030 图 4-1 为三日疟的引物探针的荧光 PCR 检测结果图 ； 0031 图 4-2 为恶性疟的荧光 PCR 检测结果图 ； 0032 图 4-3 为间日疟的荧光 PCR。

20、 检测结果图 ； 0033 图 4-4 为输入性卵形疟的荧光 PCR 检测结果图 ； 说 明 书 CN 102220419 B 5 4/14 页 6 0034 图 4-5 为输入性卵形疟的熔解曲线分析图。 具体实施方式 0035 为使本发明更加容易理解， 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 0036 本发明所用的样本、 试剂及疟原虫 DNA 的提取方法等说明如下 ： 0037 样本来源 0038 30 份疟疾镜检阳性血样由云南省寄生虫病防治所提供， 10 份疟疾镜检阳性血样 和 20 份疟疾镜检阴性血样为国境口岸入境发热患者。

21、的抗凝血， 由发明人实验室保存。样本 采集均为静脉取血， 2 EDTA-Na2抗疑， -20低温保存。 0039 试剂 0040 全血DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Extraction Minikit)和染料掺入法荧 光 PCR 试剂 (QuantiTect SYBR Green PCR Kit) 购自 Qiagen 公司， 探针法荧光 PCR 试剂 (Fast Universal PCRMaster Mix) 购自 ABI 公司， Taq DNA 聚合酶购自 Roche 公司， 100bpDNA Ladder Marker、 DL2000DNA Marker 和琼脂糖购。

22、自 TaKaRa 公司。 0041 疟原虫 DNA 提取 0042 参照全血DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood ExtractionMinikit)说明书进行， 提取的总 DNA 于 -20低温保存。 0043 (1) 在 1.5ml 离心管底加入 20l 蛋白酶 K。 0044 (2) 加 200l 血样至离心管中， 如果样本不足 200l， 用 PBS 补齐。 0045 (3) 加 200l 缓冲液 AL 至离心管中， 脉冲振荡 15s 混匀。 0046 (4)56孵育 10min。 0047 (5) 短暂离心。 0048 (6) 加入 200l 无水乙醇， 脉冲振荡 15。

23、s 混匀。短暂离心。 0049 (7)将第六步的混合液吸至过滤柱上， 6000g离心1min。 将过滤柱置于干净的收集 管上。 0050 (8) 打开过滤柱盖子， 加入 500l 洗液 AW1， 盖上盖子， 6000g 离心 1min。将过滤 柱置于干净的收集管上。 0051 (9) 打开过滤柱盖子， 加入 500l 洗液 AW2， 盖上盖子， 20000g 离心 3min。将过滤 柱置于干净的收集管上。 0052 (10)20000g 离心 1min. 0053 (11)将过滤柱置于1.5ml离心管上， 打开盖子， 加入200l缓冲液AE或无菌双蒸 水， 室温放置 1min， 6000g 离。

24、心 1min。 0054 (12) 洗脱下来的液体即为疟疾的 DNA。 0055 扩增产物电泳分析 0056 取 5l 扩增产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳， GelGreen 染色， 凝胶成像系统观察结 果并拍照。 0057 DNA 序列测定 0058 扩增的 PCR 片段由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定， 再对碱基组成进行 说 明 书 CN 102220419 B 6 5/14 页 7 BLAST 比较分析。 0059 实施例 1 ： 本发明的试剂盒及在疟疾通用型巢式 PCR 检测中应用的一个优选实施 例 0060 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个。

25、优 选实施例， 包括 PCR 缓冲液和 Taq DNA 聚合酶混合物， 还包括如表 1 所列的引物及探针 ( 如 SEQ ID NO ： 1-26 所示 )， 其中， W 代表 A 或 T， Y 代表 C 或 T， M 代表碱基 A 或 C， R 代表碱基 A 或 G。 0061 疟疾通用型巢式 PCR 检测中， 可用外引物和疟疾的通用型内引物， 引物序列 ( 为 5 -3 ) 如下 ： 0062 外引物 ： 0063 rPLUout-FP TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA 0064 rPLUout-RP CCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC 0065 检测疟疾的通用型。

26、内引物 ： 0066 rPLUin-FP AAGGATAACTACGGAAAAGCTGT 0067 rPLUin-RP TACCCGTCATAGCCATGTTAGGCCAATACC。 0068 实施例 2 ： 本发明的试剂盒及在疟疾通用型巢式 PCR 检测中应用的一个优选实施 例 0069 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个优 选实施例， 包括 PCR 缓冲液和 Taq DNA 聚合酶混合物， 还包括如表 1 所列的引物及探针 ( 如 SEQ ID NO ： 1-26 所示 )， 其中， W 代表 A 或 T， Y 代表 C 或 T， M 代表碱基 A 或。

27、 C， R 代表碱基 A 或 G。 0070 疟疾通用型巢式 PCR 检测中， 可用外引物和检测恶性疟、 间日疟、 卵形疟、 三日疟 的特异性引物， 引物序列 ( 为 5 -3 ) 如下 ： 0071 外引物 ： 0072 rPLUout-FP TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA 0073 rPLUout-RP CCTGTTGTTGCCTTAAACTTCC 0074 检测恶性疟的引物 ： 0075 rFAL-FP TTAAACTGGTTTGGGAAAAC 0076 rFAL-RP ACAATGAACTCAATCATGACTACC 0077 检测间日疟的引物 ： 0078 rVIV。

28、-FP CTTCTAGCTTAATCCACATAACTG 0079 rVIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC 0080 检测卵形疟的引物 ： 0081 rOVA-FP CGGGGAAATTTCTTAGATTGC 0082 rOVA-RP GAGAAACAGCATGAATTGCG 0083 检测三日疟的引物 ： 0084 rMAL-FP AACAWAGTTGTACRTTAAGAATAAACGC 0085 rMAL-RP AATTCCCATGCATAAAAAATTAYACAAA。 0086 M 代表碱基 A 或 C， R 代表碱基 A 或 G， W 代表 A 或 T，。

29、 Y 代表 C 或 T。 说 明 书 CN 102220419 B 7 6/14 页 8 0087 实施例 3 ： 本发明的试剂盒及在卵形疟实时荧光 PCR 检测中应用的一个优选实施 例 0088 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个优 选实施例， 包括 PCR 缓冲液和 Taq DNA 聚合酶混合物， 还包括如表 1 所列的引物及探针 ( 如 SEQ ID NO ： 1-26 所示 )， 其中， W 代表 A 或 T， Y 代表 C 或 T， M 代表碱基 A 或 C， R 代表碱基 A 或 G。 0089 卵形疟实时荧光 PCR 检测中， 可用卵形疟实时。

30、荧光 PCR 检测的引物， 引物序列 ( 为 5 -3 ) 如下 ： 0090 卵形疟实时荧光 PCR 检测的引物 ： 0091 OVA-FP ATTAATGTGTCCTTTTCCCTATTCT 0092 OVA-RP GCTTTACAATCAAACGAATACATTC。 0093 实施例 4 ： 本发明的试剂盒及在荧光 PCR 通用型及分型检测疟疾中应用的一个优 选实施例 0094 本发明的的疟疾通用型及其分型的巢式PCR检测及荧光PCR检测试剂盒的一个优 选实施例， 包括 PCR 缓冲液和 Taq DNA 聚合酶混合物， 还包括如表 1 所列的引物及探针 ( 如 SEQ ID NO ： 1。

31、-26 所示 )， 其中， W 代表 A 或 T， Y 代表 C 或 T， M 代表碱基 A 或 C， R 代表碱基 A 或 G。 0095 卵形疟实时荧光 PCR 检测中， 可用通用型引物探针或恶性疟、 间日疟、 三日疟特异 性的引物及荧光标记探针。引物探针序列 ( 为 5 -3 ) 如下 ： 0096 通用型的荧光检测引物及探针如下 ： 0097 Plas-FP AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA 0098 Plas-RP TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTAT 0099 Plas-Pro FAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB 0100 M 代表。

32、碱基 A 或 C， R 代表碱基 A 或 G。 0101 恶性疟的荧光检测引物及探针如下 ： 0102 FAL-FP CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA 0103 FAL-RP TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA 0104 FAL-Pro ： 0105 FAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1 0106 间日疟的荧光检测引物及探针如下 ： 0107 VIV-FP ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT 0108 VIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC 010。

33、9 VIV-Pro FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQ1 0110 R 代表碱基 A 或 G。 0111 三日疟的荧光检测引物及探针如下 ： 0112 MAL-FP CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAA 0113 MAL-RP AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA 0114 MAL-Pro FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGB。 0115 实施例 5 ： 疟原虫通用型巢式 PCR 检测的应用 说 明 书 CN 102220419 B 8 7/14 页 9 0116 巢式 PCR 两次扩增的体系和条件略。

34、有不同。第一次扩增时， PCR 缓冲液 2.5l， 10mM dNTP 0.5l， 10mM rPLUout-FP 和 rPLUout-RP 引 物 各 0.5l， Taq DNA 聚 合 酶 0.25l， 双蒸水 15.75l， DNA 模板 5l， 总体系 25l， 混匀后进行 PCR 反应。PCR 反应 程序为 ： 94 2min ； 94 1min， 52 1min， 72 2min， 35 个循环 ； 72 10min ； 4。进行第 二次扩增时， 取2l的第一次PCR产物作为模板， 上下游引物换为rPLUin-FP和rPLUin-RP 的上下游引物， 双蒸水增加至18.75l， 其。

35、余同第一次PCR扩增 ； PCR反应程序也略有不同 ： 94 2min ； 94 1min， 58 1min， 72 1min， 35 个循环 ； 72 10min ； 4。 0117 疟原虫通用型巢式 PCR 扩增结果如图 1 所示， 泳道 1 为 100bpDNA 标志物 ； 泳道 2 为疟疾阳性血样 PCR 结果 ； 泳道 3 为 PCR 阳性对照 ； 泳道 4 为 PCR 阴性对照， 阴性对照使用 无菌水， 阳性对照使用合成的疟疾 DNA 片段。60 份血样经通用型巢式 PCR 检测， 有 40 份血 样扩增出了预期大小的 240bp 特异性扩增条带， 为疟原虫阳性 ； 20 份样本没。

36、有预期大小的 扩增条带， 为疟原虫阴性。 0118 实施例 6 ： 疟原虫的分型巢式 PCR 检测的应用 0119 巢式 PCR 两次扩增的体系和条件略有不同。第一次扩增时， PCR 缓冲液 2.5l， 10mM dNTP 0.5l， 10mM rPLUout-FP 和 rPLUout-RP 引 物 各 0.5l， Taq DNA 聚 合 酶 0.25l， 双蒸水 15.75l， DNA 模板 5l， 总体系 25l， 混匀后进行 PCR 反应。PCR 反应程 序为 ： 942min ； 941min， 521min， 722min， 35个循环 ； 7210min ； 4。 进行第二次 扩增。

37、时， 取2l的第一次PCR产物作为模板， 上下游引物为检测分型的上下游引物， 双蒸水 增加至18.75l， 其余同第一次PCR扩增 ； PCR反应程序也略有不同 ： 942min ； 941min， 58 1min， 72 1min， 35 个循环 ； 72 10min ； 4。 0120 使用种特异性引物对疟原虫阳性的血样进行巢式PCR扩增结果见图2， 图2为疟原 虫的特异性巢式PCR检测结果图， 泳道1 ： 100bpDNA标志物 ； 泳道2 ： 阳性血样恶性疟PCR扩 增 ； 泳道 3 ： 阴性对照恶性疟 PCR 扩增 ； 泳道 4 ： 阳性对照恶性疟 PCR 扩增 ； 泳道 5 ： 阴。

38、性对照 间日疟PCR扩增 ； 泳道6 ： 阳性血样间日疟PCR扩增 ； 泳道7 ： 阳性对照间日疟PCR扩增 ； 泳道 8 ： 阴性对照三日疟 PCR 扩增 ； 泳道 9 ： 阳性对照三日疟 PCR 扩增 ； 泳道 10. 阳性血样卵形疟 PCR 扩增 ； 泳道 11 ： 阳性对照卵形疟 PCR 扩增 ； 泳道 12 ： 阴性对照卵形疟 PCR 扩增。恶性疟、 间日疟、 卵形疟和三日疟阳性血样的预计扩增条带分别为204bp、 119bp、 456bp和141bp。 结 果有 22 份为恶性疟感染， 13 份为间日疟感染， 1 份为卵形疟感染 ； 3 份为恶性疟 / 间日疟混 合感染。阴性对照使。

39、用无菌水， 阳性对照使用合成的疟疾 DNA 片段。 0121 实施例 7 ： 荧光 PCR 通用型检测的应用 0122 使用Fast Universal PCR Master Mix 进行体系配置， 反应总体积 20l， 包括 Master Mix 10l、 10M 正向引物 1l、 10M 反向引物 1l、 5M 探针 1l、 DNA 7l， 同时分别以 DEPC H2O 和 DNA 阳性模板作为阴性和阳性对照。扩增和检测 在 ABI 7900HT Fast 荧光定量 PCR 仪器上进行， 反应程序为 ： 95 20s ； 95 1s， 58 20s， 40 个循环， 在 58收集荧光。 0。

40、123 通用型的荧光检测引物及探针如下 ： 0124 Plas-FP AGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGA 0125 Plas-RP TCATCCAAMRCCTAGTCGGCATAGTTTAT 0126 Plas-Pro FAM-ACCGTCGTAATCTT-MGB。 说 明 书 CN 102220419 B 9 8/14 页 10 0127 M 代表碱基 A 或 C， R 代表碱基 A 或 G。 0128 将 60 份样本进行疟疾通用型实时荧光 PCR 检测， 检测时间约需 20min。图 3 为疟 原虫的镜检与荧光 PCR 比较检测的一个优选实施例的结果图， 其中， 图 3-。

41、1 为 40 份镜检阳 性的样本的荧光 PCR 检测结果， 结果显示 39 份镜检阳性样本的荧光 PCR 检测均为阳性 ； 图 3-2 为 20 份镜检阴性的样本的荧光 PCR 检测结果 ； 泳道 1 ： 阳性对照 ； 泳道 2、 3 和 4 分别为 55、 45 和 58 号样本荧光 PCR 检测结果 ； 在 20 份镜检阴性的样本中， 有 3 份样本为实时荧光 PCR 阳性， 其余 17 份样本为实时荧光 PCR 阴性。 0129 实施例 8 ： 荧光 PCR 分型检测的应用 0130 使用Fast Universal PCR Master Mix 进行体系配置， 反应总体积 20l， 包。

42、括 Master Mix 10l、 10M 正向引物 1l、 10M 反向引物 1l、 5M 探针 1l、 DNA 7l， 同时分别以 DEPC H2O 和 DNA 阳性模板作为阴性和阳性对照。扩增和检测 在 ABI 7900HT Fast 荧光定量 PCR 仪器上进行， 反应程序为 ： 95 20s ； 95 1s， 58 20s， 40 个循环， 在 58收集荧光。 0131 特异性的引物及荧光标记探针。引物探针序列分别 ( 为 5 -3 ) 如下 ： 0132 恶性疟的荧光检测引物及探针如下 ： 0133 FAL-FP CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA 0134。

43、 FAL-RP TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA 0135 FAL-Pro ： 0136 FAM-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA-BHQ1 0137 间日疟的荧光检测引物及探针如下 ： 0138 VIV-FP ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT 0139 VIV-RP ACTTCCAAGCCRAAGCAAAGAAAGTCC 0140 VIV-Pro FAM-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC-BHQ1 0141 三日疟的荧光检测引物及探针如下 ： 0142 MAL-FP CCGACTAGGTG。

44、TTGGATGATAGAGTAAA 0143 MAL-RP AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA 0144 MAL-Pro FAM-CTATCTAAAAGAAACACTCAT-MGB。 0145 采用染料掺入法进行卵形疟的实时荧光PCR检测。 反应体系为25l， 包括2PCR 缓冲液12.5l、 10mM上下游引物OVA-FP和OVA-RP各0.75l、 无菌双蒸水9l以及疟原 虫模板 DNA 2l。实时荧光 PCR 反应程序为 ： 95 15min ； 94 15s， 50 30s， 72 30s( 收 集荧光 )， 40 个循环 ； 最后对 PCR 产物进行熔解曲线分析， 。

45、程序为 94 15s， 60 60s， 95 15s。 0146 图4为疟原虫的荧光PCR分型检测结果图 ； 图4-1为三日疟的引物探针的荧光PCR 检测结果图， 泳道 1 和 2 分别为恶性疟和三日疟体系的荧光 PCR 检测 ； 泳道 3 和 4 分别为恶 性疟和三日疟阴性对照。图 4-2 为恶性疟的荧光 PCR 检测结果图， 图 4-3 为间日疟的荧光 PCR 检测结果图， 图 4-4 为输入性卵形疟的荧光 PCR 检测结果图， 图 4-5 为输入性卵形疟的 熔解曲线分析图。结果发现 24 份恶性疟 ( 图 4-2)、 11 份间日疟 ( 图 4-3)、 1 份恶性疟 / 间 日疟混合感染。

46、、 1 份卵形疟感染 ( 图 4-4)、 3 份未能分型。 0147 通过血样的巢式 PCR 检测和荧光 PCR 检测， 发现了一例输入性卵形疟病例。其巢 说 明 书 CN 102220419 B 10 9/14 页 11 式 PCR 扩增大小约为 450bp ； 图 4-4 为输入性卵形疟的荧光 PCR 检测结果图 ； 荧光 PCR 扩增 为明显的 S 形曲线， 泳道 1 ： 58 号血样的卵形疟荧光 PCR 检测 ； 泳道 2 ： 阳性对照荧光 PCR 检 测 ； 泳道 3 ： 阴性对照荧光 PCR 检测。图 4-5 为输入性卵形疟的熔解曲线分析， 泳道 1 ： 58 号 血样扩增片段的熔。

47、解曲线 ； 泳道 2 ： 阳性对照扩增片段的熔解曲线 ； 泳道 3 ： 阴性对照扩增 片段的熔解曲线 ； 由图可见， 扩增片段的熔解曲线 Tm 值为 72.5 ； 将输入性卵形疟的巢式 PCR 扩增片段送去测序， 序列分析表明， 扩增片段长度为 434bp， 序列的碱基组成如下 ： 0148 CGGGGAAATTTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGA GTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGAC TCAAC。

48、ACGGGGAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTGACAGATTAATAGCTCTTTCTTGATTTCTTGGATG GTGATGCATGGCCGTTTTTAGTTCGTGAATATGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGATCTTAACCTGCT AATTAGCGGCGAATACGTTATATTCCTACTTGAAATTGAATATAGCTGAATTTGCTTATTTTGAAGAATATATTAGG ATGCATTATAGTGTCCTTTTCCCTTTTCTACTTAATTCGCAATTCATGCTGTTTCTC 0149 下划线碱基为扩增。

49、的上下游引物部位。将该序列递交到 GenBank 上， GenBank 登 录号为 JF505386。 0150 实施例 9 ： 疟原虫镜检和巢式 PCR 扩增方法的比较 0151 将疟原虫镜检和巢式 PCR 扩增方法进行比较 ( 表 2)， 18 份恶性疟、 11 份间日疟和 17份阴性血样的两种检测结果一致， 2份镜检为间日疟和2份镜检为阴性的样本经巢式PCR 扩增显示为恶性疟， 2 份镜检为恶性疟的样本经巢式 PCR 扩增显示为间日疟， 1 份镜检为阴 性的样本经巢式PCR扩增显示为卵形疟， 2份镜检为恶性疟和1份镜检为间日疟的样本经巢 式 PCR 扩增显示为恶性疟 / 间日疟混合感染， 1 份镜检间日疟阳性血样经巢式 PCR 未能分 型， 2 份镜检为恶性疟和 1 份镜检为间日疟的样本经巢式 PCR 扩增显示为阴性。 0152 表 2 血样的疟原虫巢式 PCR 和镜检结果比较 0153 0154 将与镜检结果不一致的血样的特异性巢式 PCR 扩增条带进行序列测定， 将测序结 果进行 NCBI 数据库的 blast 分析， 结果发现序列均为扩增的相应疟原虫的 SSU rDNA 基因 序列， 证实巢式 PCR 扩增结果是正确的。 0155 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发。