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1、(10)申请公布号 CN 102181428 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181428 A *CN102181428A* (21)申请号 201010622362.6 (22)申请日 2010.12.30 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 山东大正医疗器械股份有限公司 地址 264209 山东省威海市大连路 65 号 (72)发明人 张治洲 赵鹤翔 张会敏 吕志伟 王有志 (54) 发明名称 一种利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应扩增 效果的方法 (57) 摘要 一种利用异亮氨酸 (L-isoleucine) 提高聚 合酶链式反应 (PCR) 扩。
2、增效果的方法， 涉及生物 技术领域， 该方法是在原有的 PCR 扩增方法基础 上， 通过向体系中添加一定量的异亮氨酸来实现 的。本发明优化扩增的效果明显， 操作简便， 易于 掌握。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102181430 A1/1 页 2 1. 利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应扩增效果的方法， 其特征在于该方法包括如下步 骤 ： (1). 异亮氨酸溶液的配制 ： 10-20mg/mL 的异亮氨酸水溶液 ； (2). 异亮氨酸溶液的灭菌 ； (3).PCR 体系的配置 ； (4)。
3、.PCR 体系的优化 ： 在 PCR 反应体系中添加异亮氨酸溶液， 异亮氨酸终浓度为 5-15mg/mL ； (5).PCR 条件的设定与运行 ； (6).PCR 产物检测。 权 利 要 求 书 CN 102181428 A CN 102181430 A1/5 页 3 一种利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应扩增效果的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域的聚合酶链式反应 (PCR) 扩增的方法， 尤其是异亮氨酸 (L-isoleucine) 提高聚合酶链式反应 (PCR) 扩增效果的方法。 背景技术 0002 聚合酶链式反应 (PCR)， 又称体外酶促基因扩增， 是一种在体外模拟 DNA。
4、 体内复制 的基因扩增技术， 该技术由 K.Mullis 于 1985 年发明， 能在耐热 DNA 聚合酶的作用及特异性 引物的引导下， 在很短的时间里就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出 现的基因的大量复制， 一般来说， 在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。 0003 在过去的 20 多年的时间里， PCR 技术在不断进步和发展中逐渐成熟， 形成了一整 套完整的技术体系。常规 PCR 技术操作简便， 成功率很高， 因而其在遗传学、 微生物学、 乃至 整个生命科学领域的研究中都得到了广泛应用。但是 PCR 技术仍存在着不可避免的缺点， 如扩增的副反应多， 扩增产物的产量少， 。
5、保真度不高等。但对 PCR 反应影响最大的是扩增过 程中的副反应的发生， 这种情况轻则带来在 PCR 产物中出现少量非目的产物， 电泳图上表 现为明显的非目的带和少量拖尾现象的出现， 重则带来大量的非目的产物出现， 在电泳图 上表现为干扰很严重的拖尾和大量的弥散， 导致主带模糊或根本无主带， 整个扩增失效。 虽 然近年来一个又一个功能强大的引物设计软件被开发出来， 但高特异性引物只是提高 PCR 反应效率的一个方面， 对反应体系及反应条件进行优化组合则是解决这一问题的主要方 面。根据多年来各国科学家的研究成果我们发现， 通过向 PCR 反应体系中添加一定量的添 加剂可以在不同程度上减少或消除副。
6、反应的发生。这些添加剂包括 DMSO， Betain， BSA， 甘 油， Tween-20， NP-40， 甲酰胺等。但这些添加剂都有各自的局限性， 在各种不同的情况下效 果差异很大， 给应用带来不便。因此开发更多更新的 PCR 反应优化剂是发展 PCR 技术过程 中一项很重要的工作。 0004 鉴于 PCR 反应本身是一种模拟体内 DNA 复制的体外扩增方法， 因此在本发明的摸 索过程中， 试图从模拟细胞核内环境出发， 寻找参与酿酒酵母细胞代谢的核内， 并设计将这 些核内以接近核内浓度的条件下添加入PCR反应体系中， 以期获得更为有效的PCR添加剂。 异亮氨酸L-isoleucine就是通。
7、过这个思路被我们发现有明显增进PCR反应特异性的作用。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术中的不足， 提供了利用异亮氨酸 (L-isoleucine) 提高聚合酶链式反应 (PCR) 扩增效果的方法。该方法通过在 PCR 反应体系中添加异亮氨酸 达到对 DNA 片段的有效扩增。此方法明显提高了反应特异性， 应用成本低， 使用简便， 易于 掌握。 0006 本发明是通过以下技术方案来实现的 ： 0007 利用异亮氨酸提高聚合酶链式反应 (PCR) 扩增效果的优化方法是 ： 0008 (1). 异亮氨酸溶液的配制 ： 10-20mg/mL 的异亮氨酸水溶液 ； 说 明 书 CN 10。
8、2181428 A CN 102181430 A2/5 页 4 0009 (2). 异亮氨酸溶液的灭菌 ； 0010 (3).PCR 体系的配置 ； 0011 (4).PCR 体系的优化 ： 在 PCR 反应体系中添加异亮氨酸溶液， 异亮氨酸终浓度为 5-15mg/mL ； 0012 (5).PCR 条件的设定与运行 ； 0013 (6).PCR 产物检测。 0014 而且， 所述的 PCR 体系的优化是 ： 异亮氨酸终浓度的优选浓度为 6.0-6.5mg/mL。 0015 而且， 所述的异亮氨酸溶液是指 ： 异亮氨酸完全溶解于纯水、 10PCR 缓冲液或者 其它一切适用于 PCR 反应的液相。
9、中。 0016 本发明的优点和有益效果是 ： 0017 1. 本发明作为 PCR 增效剂的新成果， 与已有方法相比， 异亮氨酸优化扩增的效果 明显， 确实提高了 PCR 扩增的特异性， 且异亮氨酸较为低廉的价格使得其应用没有增加很 多成本。 0018 2. 本发明中使用的 PCR 优化试剂异亮氨酸， 添加到体系中基本不影响 PCR 反应后 的一般后续操作如电泳分离 DNA 产物。 0019 3. 该异亮氨酸提高聚合酶链式反应 (PCR) 扩增效果的优化方法易于掌握， 使用简 便。 附图说明 0020 图 1 为本发明中利用异亮氨酸优化扩增片段长度为 900bp 左右的非高 GC-DNA 片 段。
10、的结果电泳图与不添加异亮氨酸的反应结果电泳图的对比图 ； 0021 图 2 为本发明中利用异亮氨酸优化扩增片段长度为 750bp 左右的高 GC-DNA 片段 的结果电泳图与不添加异亮氨酸的反应结果电泳图的对比图 ； 具体实施方式 0022 本发明结合附图通过以下实施例进一步详述， 但不局限于下述实施例。 0023 本发明所涉及的 PCR 技术的优化方法是通过向 PCR 体系中添加异亮氨酸来实现 的， 其具体操作方法如下 ： 0024 1. 异亮氨酸 (L-isoleucine) 溶液的制备 ： 0025 所述的异亮氨酸分子是指 2- 氨基 -3- 甲基戊酸， 疏水性氨基酸， L- 异亮氨酸是。
11、组 成蛋白质的常见20种氨基酸之一。 化学式 ： CH3CH2CH(CH3)CH(NH2)COOH。 分子量 ： 131.17。 异亮氨酸固体粉末可以用市售产品， 属于现有技术， 不再详细叙述。 所述的异亮氨酸溶液的 浓度为 ： 可以根据需要配置不同浓度大小的溶液， 浓度的单位为质量体积比 (W/V)， 范围在 10-20mg/mL。一般推荐浓度为 10mg/mL。以配置浓度为 (W/V)10mg/mL 的异亮氨酸溶液为 例， 先精确称取10mg异亮氨酸粉末， 置于已灭菌的1.5mL的小离心管中， 用移液器缓慢加入 灭菌水， 使其溶解， 最后定容至 1mL。 0026 2. 异亮氨酸溶液的灭菌。
12、 ： 溶液均需用高温灭菌 (121， 40min)。 0027 3.PCR 体系的配置 ： 0028 PCR 体系根据现有的技术， 由待扩增 DNA 片断的不同而各不相同。具体表现在 说 明 书 CN 102181428 A CN 102181430 A3/5 页 5 dNTP、 模板、 Mg2+、 引物的添加量应根据不同的模板和不同的扩增片段长度来选择 ； PCR 反应 体系中的 H2O 为双蒸水及以上级别水， 体系中水的添加量应根据异亮氨酸溶液添加的体积 进行调整， 即应扣除相应添加的异亮氨酸溶液的体积。 0029 4.PCR 体系的优化 ： 0030 在上述 PCR 反应体系中加入一定体。
13、积的异亮氨酸溶液。 0031 5.PCR 条件的设定与运行 ： 0032 PCR 反应条件中的预变性， 变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板 和引物融解温度来选择 ； 其中的延伸温度根据所用聚合酶的合适温度来选择 ； 其中的延伸 时间根据所扩增片段的长度来选择 ； 其中的循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。 0033 6.PCR 产物的检测 ： 0034 一般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测， 琼脂糖凝胶的浓度及 PCR 产物的上样体积 需根据具体情况而定。所述的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如下 ： 0035 (1) 制备所需要浓度的琼脂糖凝胶， 具体浓度大小应根据扩增 DNA。
14、 片段的大小来 确定。 0036 (2) 吸取一定体积的 PCR 产物上电泳槽点样， 同时点上合适分子量标记作为参照。 0037 (3) 加上 3-4V/cm 的电压进行电泳。 0038 (4) 待指示剂到合适位置时， 取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。 0039 实施例 1 0040 异亮氨酸对一般 PCR( 非高 GC) 的增效作用 ； 0041 1) 异亮氨酸溶液配制 ： 10mg/ml 0042 2) 肌苷溶液灭菌 ： 高温灭菌 (121， 30min) 0043 3)PCR 反应体系的配置 ： 0044 按以下顺序和添加量配置体系于薄壁 PCR 管中。 0045 10 X PC。
15、R 缓冲液 1.2L 0046 dNTPs(25mM) 0.1L 0047 模板 (100ng/ul) 0.2L 0048 引物 1(2.0M) 0.75L 0049 引物 2(2.0M) 0.75L 0050 Mg2+(25mM) 1.2L 0051 Taq(5U/L) 0.2L 0052 异亮氨酸 (10mg/ml)or H2O 7.6L 0053 引物 1 引物 2 扩增长度 (nt) 1 AGCCAGCTGTTAACCTTGTTCAG GCCTGATTAAAACCACAGTCACC 963 2 AACCAGCCCAGCACTAATGTTTA ACACAAATTTAGCCGGACACAG。
16、T 941 3 CATAGGAGGGAATCTCCTGGTCT AGGAAAATGTCTTCAGGGTCTCC 996 说 明 书 CN 102181428 A CN 102181430 A4/5 页 6 4 AGGTAAAGGGGACTTTGTCTTGC CATTCTGCATGATGCGGTTATTA 861 5 TTTATGGTTGTTGCCCTCTCCTA AGAAGAAAAAGCCTGAGCTTGGT 881 0054 其中， 模板为人类 Genome DNA， 由本实验室自行提取。Taq 酶及 PCR 缓冲液购自北 京三博远志生物工程公司。共配置 PCR 体系 10 管， 使用 5 。
17、对引物， 编号分别为 1、 2、 3、 4、 5， 添加异亮氨酸的编号分别为 1 、 2 、 3 、 4 、 5 。其扩增的目的产物大小为 900bp 左右。 0055 4)PCR 体系优化 ： 在上述 12 微升 PCR 反应体系中包含加入 7.6 微升异亮氨酸 (10mg/ml)， 这样异亮氨酸的终浓度为 6.3mg/ml。 0056 5)PCR条件的设定与运行。 按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。 0057 预变性 94 4min 0058 0059 延伸 72 40s 0060 完全延伸 72 7min 0061 6) 对扩增完成后的 PCR 产物进行琼酯糖凝胶电泳检。
18、测。 0062 具体扩增结果如图1所示， 在图中标记M代表分子量标准带的位置， 此图中分子量 标准为 DL2000( 分别为 ： 100， 250， 500， 750， 1000， 2000bp， 其中 750bp 条带浓度加亮 )。从 图 1 中可以看出， 与未加任何优化剂的 PCR 体系扩增的结果相比， 加入异亮氨酸后， PCR 的 总体特异性有明显提高。 0063 实施例 2 0064 异亮氨酸对高 GC 序列 PCR 的增效作用 ； 0065 1) 异亮氨酸溶液配制 ： 10mg/ml 0066 2) 异亮氨酸溶液灭菌 ： 高温灭菌 (121， 30min) 0067 3)PCR 反应。
19、体系的配置 ： 0068 按以下顺序和添加量配置体系于薄壁 PCR 管中。 0069 10 X PCR 缓冲液 1.2L 0070 dNTPs(25mM) 0.1L 0071 模板 (100ng/ul) 0.2L 0072 引物 1(2.0M) 0.8L 0073 引物 2(2.0M) 0.8L 0074 Mg2+(25mM) 1.2L 0075 Taq(5U/L) 0.2L 0076 异亮氨酸 (10mg/ml)or H2O 7.5L 0077 说 明 书 CN 102181428 A CN 102181430 A5/5 页 7 0078 其中， 模板为人类 Genome DNA， 由本实验。
20、室自行提取。Taq 酶及 PCR 缓冲液购自北 京三博远志生物工程公司。共配置 PCR 体系 12 管， 使用 6 对引物， 编号分别为 1、 2、 3、 4、 5、 6 ； 添加异亮氨酸的编号分别为 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 。扩增的目的产物大小为 750bp 左右， 且 GC 含量较高 (63-71 )。 0079 4)PCR 体系优化 ： 在上述 12 微升 PCR 反应体系中包含加入 7.5 微升异亮氨酸 (10mg/ml) 溶液， 这样异亮氨酸的终浓度为 6.2mg/ml。 0080 5)PCR条件的设定与运行。 按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。。
21、 0081 预变性 94 4min 0082 0083 完全延伸 72 7min 0084 6) 对扩增完成后的 PCR 产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。 0085 具体扩增结果如图2所示， 在图中标记M代表分子量标准带的位置， 此图中分子量 标准为 DL2000( 分别为 ： 100， 250， 500， 750， 1000， 2000bp， 其中 750bp 条带浓度加亮 )。 0086 从图2中可以看出， 与未加任何优化剂的PCR体系扩增的结果相比， 异亮氨酸能总 体上明显改善 PCR 扩增特异性。 说 明 书 CN 102181428 A CN 102181430 A1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102181428 A 。