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1、(10)授权公告号 CN 102250792 B (45)授权公告日 2013.03.06 CN 102250792 B *CN102250792B* (21)申请号 201110163742.2 (22)申请日 2011.06.17 C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 四川农业大学 地址 625014 四川省雅安市雨城区新康路 46 号 (72)发明人 朱德康 程安春 汪铭书 陈孝跃 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 CN 101948781 A,。
2、2011.01.19, 权利要求 1-4， 说明书第 5 段 . CN 101870596 A,2010.10.27, 权利要求 7. KR 100834026 B1,2008.06.02, 全文 . TW 201028473 A,2010.08.01, 全文 . 刘巍申 .“基于神经网络和遗传算法的 鸭疫里默杆菌培养基优化” .黑龙江畜牧兽 医 .2009,( 第 12 期 ), 李玲 .“淋巴细胞转化试验在鸭体上的应 用” . 江苏农学院学报 .1987, 第 8 卷 ( 第 2 期 ), (54) 发明名称 鸭疫里默氏菌用培养基 (57) 摘要 本发明涉及微生物领域， 特别涉及鸭疫里默 。
3、氏菌用培养基， 所述培养基包括基础培养基和培 养基添加剂两部分， 所述基础培养基按千分比由 以下成分组成 ： 胰蛋白胨 1517， 大豆胨 47， 酵母提取物 46， NaCl56， 琼脂 1520及 余量的水 ； 所述的含有培养基添加剂的培养基在 分离或鉴定鸭疫里默氏菌中的应用 ； 由于本发明 的鸭疫里默氏菌培养基采用多种成分的基础培 养基和添加抗凝剂的鸭全血作为添加物， 可应用 于鸭疫里默氏菌的常规分离鉴定以及商业化的 BIOLOG 鉴定系统， 克服了配套专用培养基依赖于 进口的缺点， 同时在培养基制备过程中能减少杂 菌污染， 降低培养基成本。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审。
4、查员 董桂灵 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 含有培养基添加剂的培养基， 由基础培养基和培养基添加剂组成， 其特征在于 ： 所 述培养基中含有体积分数为 58% 的培养基添加剂， 所述培养基添加剂由非疫区健康鸭心 脏或颈动脉来源的血液和抗凝剂组成 ； 所述抗凝剂为浓度为 35 g/L 的柠檬酸钠或浓度为 80150 mg/L 的肝素钠。 2. 根据权利要求 1 所述的含有培养基添加剂的培养基， 其特征在于， 所述基础培养基 按重量千分比由以下成分组成。
5、 ： 胰蛋白胨 1517 大豆胨 47 酵母提取物 46 NaCl 56 琼脂 1520 余量为水， 所述基础培养基的 pH 值为 7.27.4。 3. 权利要求 1 所述的含有培养基添加剂的培养基在分离或鉴定鸭疫里默氏菌中的应 用。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述应用为所述的含有培养基添加剂的 培养基在 BIOLOG 微生物鉴定系统中制备分离或鉴定鸭疫里默氏菌培养基的应用。 权 利 要 求 书 CN 102250792 B 2 1/4 页 3 鸭疫里默氏菌用培养基 技术领域 0001 本发明涉及微生物领域， 特别涉及鸭疫里默氏菌用培养基。 背景技术 0002 鸭疫。
6、里默氏菌病 （Riemerella anatipestifer infection） 是家鸭、 火鸡和多种其 它禽类的一种接触传染性疾病， 也称为新鸭病、 鸭败血症、 鸭疫综合症、 鸭疫巴氏杆菌病和 鸭传染性浆膜炎。该病呈世界范围分布， 几乎已在所有的集约化养鸭生产的国家发现， 是 目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一。 鸭疫里默氏菌病呈急性或慢性败血症过 程， 病理变化主要是纤维素性心包炎、 肝周炎、 气囊炎。18 周龄鸭高度敏感， 恶劣的环境条 件或并发感染可促发该病。该病的发病率和死亡率都很高， 死亡率最高可达 75%100% ； 部 分感染鸭消瘦， 生长发育迟缓 ； 慢性耐过鸭有。
7、神经症状， 可导致残鸭和僵鸭， 淘汰率高， 给养 鸭业造成了巨大的经济损失。该病在我国已呈漫延之势， 已经严重阻碍了我国养鸭业的发 展。 0003 关于鸭疫里默氏菌病的诊断， 已建立了许多方法。BIOLOG 微生物自动鉴定系统 是 BIOLOG 公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统， 其通过在鉴定板上使用 95 种 碳源进行试验， 微生物利用碳源进行呼吸， 将四唑类氧化还原染色剂， 从无色还原成紫色， 从而在微生物鉴定板上形成微生物特征性的反应模式或指纹， 通过光学读数设备根据光密 度的吸收值的差异， 来读取颜色变化， 再将此指纹与数据库相比较， 确定微生物的属名或种 名。该系统操作标准。
8、化， 简便快捷， 其菌种数据库大、 自动化程度高。 0004 BIOLOG 微生物自动鉴定系统数据库包括鸭疫里默氏菌， 因此可利用该系统对鸭疫 里默氏菌病进行快速鉴定。由于该鉴定系统涉及本病病原鸭疫里默氏菌的培养， 但鸭疫里 默氏菌的培养条件苛刻， 在体外培养需要较高的营养条件， 通常需要加入血液进行培养， 特 别是在生产中初次分离病原菌。BIOLOG 微生物自动鉴定系统操作要求须使用与该鉴定系 统配套专用培养基 BUG 以及添加新鲜脱纤维绵羊血。一方面配套专用培养基依赖于进口， 购买耗时长， 价格高， 另一方面制备新鲜脱纤维绵羊血操作易污染， 部分地区尚不能提供绵 羊， 这些限制了 BIOL。
9、OG 微生物自动鉴定系统的应用。 发明内容 0005 本发明的目的之一在于提供一种培养基添加剂， 该添加剂可以用于替代 BIOLOG 微生物自动鉴定系统中新鲜脱纤维绵羊血。 0006 为实现上述方案， 本发明的技术方案为 ： 0007 培养基添加剂， 所述培养基添加剂由非疫区健康鸭心脏或颈动脉来源的血液和抗 凝剂组成。 0008 进一步， 所述抗凝剂为浓度为 35 g/L 的柠檬酸钠 ； 0009 进一步， 所述抗凝剂为浓度为 80150 mg/L 的肝素钠 ； 0010 本发明的目的之二在于提供一种培养基， 该培养基可以用于鸭疫里默氏菌的培 说 明 书 CN 102250792 B 3 2/。
10、4 页 4 养， 且生产成本低。 0011 为实现上述方案， 本发明的技术方案为 ： 0012 含有所述的培养基添加剂的培养基， 由基础培养基和培养基添加剂组成， 所述培 养基中含有质量分数为 58% 的培养基添加剂。 0013 进一步， 所述基础培养基按重量千分比由以下成分组成 ： 0014 胰蛋白胨 1517 0015 大豆胨 47 0016 酵母提取物 46 0017 NaCl 56 0018 琼脂 1520 0019 余量为水， 所述基础培养基的 pH 值为 7.27.4。 0020 本发明的目的之三在于提供含有培养基添加剂的培养基的应用， 该应用为分离和 鉴定鸭疫里默氏菌提供了新思路。
11、。 0021 为实现上述目的， 本发明的技术方案为 ： 0022 所述的含有培养基添加剂的培养基在分离或鉴定鸭疫里默氏菌中的应用。 0023 进一步， 所述应用为所述的含有培养基添加剂的培养基在 BIOLOG 微生物鉴定系 统中制备分离或鉴定鸭疫里默氏菌培养基的应用。 0024 本发明的有益效果在于 ： 由于本发明的鸭疫里默氏菌培养基采用多种成分的基础 培养基和添加抗凝剂的鸭全血作为添加物， 可应用于鸭疫里默氏菌的常规分离鉴定以及商 业化的 BIOLOG 鉴定系统， 克服了配套专用培养基依赖于进口的缺点， 同时， 因避免了常规 的抽血需脱纤维操作步骤， 在培养基制备过程中能减少杂菌污染， 降低。
12、培养基成本。 附图说明 0025 图 1 为鸭疫里默氏菌在 RCAD 培养基菌落形态 （整个平板） ； 0026 图 2 为鸭疫里默氏菌在 RCAD 培养基菌落形态 （局部） ； 0027 图 3 为疫里默氏菌 ATCC11845 在 BIOLOG 微生物鉴定系统中指纹图谱 ； 0028 图 4 为鸭疫里默氏菌 ATCC11845 在 BIOLOG 鉴定板中的颜色反应 （24h） ； 0029 图 5 为鸭疫里默氏菌 ATCC11845 在 BIOLOG 微生物鉴定系统中读数结果截图。 具体实施方式 0030 实施例 1 体积分数为 5% 的含有培养基添加剂的培养基 0031 胰蛋白胨 15 。
13、g、 大豆胨 5g、 酵母提取物 5 g、 NaCl 5 g， 溶于 900mL 蒸馏水， 煮沸彻 底溶解， 冷却至室温 （25） ； 再称取琼脂 20 g， 加入前述溶液并补加蒸馏水至总体积 1000 ml， 混匀后 121灭菌 15 min， 冷却至 4550 时将所述添加物按体积比加入 50ml 含抗凝 剂的鸭全血， 倾倒平板。凝固后， 倒置于 37恒温箱 24h， 无菌检验后即得， 其 pH 值为 7.2。 0032 添加物为采用心脏抽血或颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健康鸭血， 其中含抗 凝剂 80mg/L（ 80150 mg/L 均可） ， 于 -20冻存， 使用前解冻。 0033。
14、 实施例 2 体积分数为 8% 的含有培养基添加剂的培养基 0034 胰蛋白胨 15 g、 大豆胨 5g、 酵母提取物 5 g、 NaCl 5 g， 溶于 850mL 蒸馏水， 煮沸彻 说 明 书 CN 102250792 B 4 3/4 页 5 底溶解， 冷却至室温 （25） ； 再称取琼脂 20 g， 加入前述溶液并补加蒸馏水至总体积 1000 ml， 混匀后 121灭菌 15 min， 冷却至 4550 时将所述添加物按体积比加入 80ml 含抗凝 剂的鸭全血， 倾倒平板。凝固后， 倒置于 37恒温箱 24h， 无菌检验后即得， 其 pH 值为 7.4。 0035 添加物为采用心脏抽血或。
15、颈动脉放血的方法无菌采取非疫区健康鸭血， 其中含抗 凝剂柠檬酸钠 3g/L（3-5g/L 均可） ， 于 -20冻存， 使用前解冻。 0036 实施例 3 含有培养基添加剂的培养基的应用 0037 一材料 0038 1菌株 0039 鸭疫里默氏菌模式菌株 ATCC11845， 购自美国菌种保藏中心 （American Type Culture Collection， ATCC） ， 12 株鸭疫里默氏菌供试菌株， 四川农业大学动物疫病与人类 健康四川省重点实验室提供。 0040 2试剂 0041 胰蛋白胨、 大豆胨、 酵母提取物购自 BD 公司， 琼脂购自 Biowest 公司、 BUG+B 。
16、购自 BIOLOG 公司， 聚醚 F-68 和吉冷胶 （Gellan Gum） 购自 Sigma 公司， NaCl 为国产分析纯， 脱纤 维绵羊血为自制。 0042 3其它耗材 0043 鉴定板、 浊度标准管 （28%T， 管规格为 20150 mm） 、 V 型加样槽均购自 BIOLOG 公 司。 0044 4培养基及接种液 0045 4.1BUG+B 培养基 （1000mL） 的制备 0046 称取 57 g BUG 培养基， 加入 900 ml 蒸馏水， 煮沸溶解， 冷却至室温 （25） 后调整 pH 值至 7.4。 121灭菌 15 分钟， 冷却至 4550， 加 50mL 新鲜的脱纤。
17、维羊血， 摇匀， 倾倒 平板。凝固后， 倒置于 37恒温箱 24h， 无菌检验后即得 BUG+B 成品培养基。 0047 4.2合成培养基配方采用实施例 2 所列配方制备。 0048 4.3接种液制备 0049 加 0.2g 吉冷胶至 1 升蒸馏水中， 煮沸并持续搅拌， 直至吉冷胶完全溶解 ； 加 4g NaCl， 搅拌至完全溶解 ； 加0.3g聚醚F-68， 搅拌至完全溶解 ； 分装到20 x 150mm的试管中， 每管装 19mL ； 121灭菌 30 min。冷却后备用。 0050 5方法 0051 5.1细菌培养 0052 将保存的菌株活化后， 接种按上述方法制备好的培养基， 37烛缸。
18、培养 24 小时。 0053 5.2菌悬液制备及微平板接种培养 0054 用无菌棉签蘸生理盐水湿润后轻轻擦下培养基上的菌落， 转入制备好的接种液， 混匀得到菌悬液， 调整其浊度， 控制在 25% 浊度标准的 5% 以内， 接种培养用 8 孔自动移液 器将菌悬液加入 GN2 鉴定板中， 每孔 150l， 共 96 孔， 盖上鉴定板盖， 置 37培养箱湿盒培 养。 0055 5.3微平板读数 0056 打开 BIOLOG 鉴定系统的应用程序， 初始化后， 放入鉴定板， 选择合适的参数， 自动 读数并判定结果。培养 46h 后读一次， 如果此次读数没有结果， 培养至 1624 小时后再读 说 明 书。
19、 CN 102250792 B 5 4/4 页 6 取结果。 0057 6结果 0058 6.1细菌培养结果 0059 在含有培养基添加剂的培养基培养基上生长良好， 培养 24 小时菌落呈圆形， 凸 起、 边缘整齐、 透明、 有光泽的奶油状、 无色素的光滑型菌落 （附图 1 和 2） 。 0060 6.2 两种不同培养基的 BIOLOG 鉴定结果 0061 0062 使用所述含有培养基添加剂的培养基及 BIOLOG 微生物鉴定系统配套专用培养基 的能够对鸭疫里默氏菌进行准确鉴定。 0063 6.3培养基成本核算 0064 0065 最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。 说 明 书 CN 102250792 B 6 1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102250792 B 7 2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102250792 B 8 3/3 页 9 图 5 说 明 书 附 图 CN 102250792 B 9 。