技术领域
本发明涉及一种腈水合酶突变体、编码该腈水合酶突变体的基因、含有该基因的DNA、含有该基因的质粒、由该质粒形成的转化体以及使用该转化体生产腈水合酶突变体的方法。
背景技术
近年来，已经发现了作为具有腈水合活性的酶的腈水合酶，该酶能够通过水合作用将各种化合物的腈基转变成酰胺基，并且公开了多种生产该酶的微生物株。为了在工业上使用腈水合酶从腈化合物制造酰胺化合物，降低酰胺化合物的制造成本中所占的该酶的制造成本是重要的。更具体而言，必须提高酶制备物的每单位重量的活性值。
作为通过增加酶制备物中的酶量提高活性值的方法，已尝试对编码该酶的基因进行克隆，利用基因工程方法使该酶大量表达。
例如，已制备出可使来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的腈水合酶在转化体内大量表达的质粒及通过该质粒进行转化而得到的细胞株。此外，可以利用该细胞株来生产该腈水合酶，以及可以通过将该细胞株或由该细胞株得到的该腈水合酶与腈化合物接触来制造对应的酰胺化合物(参见专利文献1)。
另一方面，如果能实现酶分子自身的高活化，则可以进一步提高酶制备物的活性值。
到目前为止，正尝试探索下述腈水合酶突变体，该突变体通过在不破坏其活性的情况下对腈水合酶的氨基酸序列中的特定氨基酸残基导入突变，而使基质特异性、酶稳定性等得到改良(参见专利文献2～4)。
需要说明的是，作为来源于紫红红球菌的腈水合酶突变体，有专利文献5、6中所记载的腈水合酶突变体。
专利文献1：日本特开平9-275978号公报
专利文献2：日本特开2004-194588号公报
专利文献3：日本特开2005-160403号公报
专利文献4：国际公开第2004/056990号说明书
专利文献5：日本特开2007-143409号公报
专利文献6：日本特开2008-253182号公报
发明内容
但是，与专利文献1中记载的野生型腈水合酶相比、其反应初速度及酶稳定性同时提高的具体突变体尚属未知。期待可以通过使反应初速度及酶稳定性同时提高来削减酰胺化合物的制造成本。
本发明的目的在于提供一种具有高的反应初速度及酶稳定性的腈水合酶。
即，本发明如下所述。
[1]一种腈水合酶突变体，其特征在于，包含至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，所述取代通过3个以下1个以上氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。
[2]如[1]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，所述被改善的性质为反应初速度及热稳定性。
[3]如[1]或[2]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，含有序列表的序列号：1表示的α亚单位和序列表的序列号：2表示的β亚单位，并且含有选自由下述(a)～(1)组成的氨基酸取代位置中的至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代：
(a)α亚单位的第92位；
(b)α亚单位的第94位；
(c)α亚单位的第197位；
(d)β亚单位的第4位；
(e)β亚单位的第24位；
(f)β亚单位的第79位；
(g)β亚单位的第96位；
(h)β亚单位的第107位；
(i)β亚单位的第226位；
(j)β亚单位的第110位及β亚单位的第231位；
(k)β亚单位的第206位及β亚单位的第230位；
(l)α亚单位的第13位、α亚单位的第27位、及β亚单位的第110位。
[4]如[3]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(m)～(u)组成的氨基酸取代位置中的至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代：
(m)为(b)或(g)时，α亚单位的第13位；
(n)为(b)或(h)时，α亚单位的第27位；
(o)(d)及(f)；
(p)为(f)时，β亚单位的第230位；
(q)(a)及(i)；
(r)为(i)时，α亚单位的第13号及β亚单位的第206位；
(s)为(a)及(d)时，β亚单位的第206位；
(t)为(c)及(h)时，β亚单位的第230位；
(u)为(f)时，β亚单位的第230位及β亚单位的第231位。
[5]如[3]所述的腈水合酶突变体，其特征在于，为(e)时，进一步包含选自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、β亚单位的第230位、及β亚单位的第231位组成的组中的至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于：
α亚单位的第13位氨基酸被取代时，Ile被取代为Leu；
α亚单位的第27位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile；
α亚单位的第92位氨基酸被取代时，Asp被取代为Glu；
α亚单位的第94位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile；
α亚单位的第197位氨基酸被取代时，Gly被取代为Cys；
β亚单位的第4位氨基酸被取代时，Val被取代为Met；
β亚单位的第24位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile；
β亚单位的第79位氨基酸被取代时，His被取代为Asn；
β亚单位的第96位氨基酸被取代时，Gln被取代为Arg；
β亚单位的第107位氨基酸被取代时，Pro被取代为Met；
β亚单位的第110位氨基酸被取代时，Glu被取代为Asn；
β亚单位的第206位氨基酸被取代时，Pro被取代为Leu；
β亚单位的第226位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile；
β亚单位的第230位氨基酸被取代时，Ala被取代为Glu；
β亚单位的第231位氨基酸被取代时，Ala被取代为Val。
[7]如[3]～[6]中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(aa)～(br)组成的氨基酸取代中的至少1个氨基酸取代：
(aa)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr；
(ab)将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及将α亚单位的第204位的Val取代为Arg；
(ac)将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp；
(ad)将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(ae)将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu取代为Arg；
(af)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr；
(ag)将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第71位的Arg取代为His、及将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr；
(ah)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及将α亚单位的第204位的Val取代为Arg；
(ai)将β亚单位的第10位的Thr取代为Asp、将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(aj)将β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(ak)将β亚单位的第37位的Phe取代为Val、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(al)将β亚单位的第41位的Phe取代为Ile、将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp；
(am)将β亚单位的第46位的Met取代为Lys、将β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr；
(an)将β亚单位的第48位的Leu取代为Val、将β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr；
(ao)将β亚单位的第127位的Leu取代为Ser、将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu取代为Arg；
(ap)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、将β亚单位的第46位的Met取代为Lys、将β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr；
(aq)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、将β亚单位的第48位的Leu取代为Val、将β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将β亚单位的第212位的Ser取代为Tyr；
(ar)将α亚单位的第6位的Leu取代为Ala、将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、将β亚单位的第127位的Leu取代为Ser、将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu取代为Arg；
(as)将α亚单位的第6位的Leu取代为Thr、将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、将β亚单位的第10位的Thr取代为Asp、将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(at)将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第71位的Arg取代为His、将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、将β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(au)将α亚单位的第19位的Ala取代为Val、将α亚单位的第71位的Arg取代为His、将α亚单位的第126位的Phe取代为Tyr、将β亚单位的第37位的Phe取代为Val、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(av)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、将α亚单位的第204位的Val取代为Arg、将β亚单位的第41位的Phe取代为Ile、将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp；
(aw)将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、将α亚单位的第204位的Val取代为Arg、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu；
(ax)将α亚单位的第36位的Thr取代为Gly、及将α亚单位的第188位的Thr取代为Gly；
(ay)将α亚单位的第36位的Thr取代为Ala、及将α亚单位的第48位的Asn取代为Gln；
(az)将α亚单位的第48位的Asn取代为Glu、及将β亚单位的第146位的Arg取代为Gly；
(ba)将α亚单位的第36位的Thr取代为Trp、及将β亚单位的第176位的Tyr取代为Cys；
(bb)将β亚单位的第176位的Tyr取代为Met、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Gly；
(bc)将α亚单位的第36位的Thr取代为Ser、及将β亚单位的第33位的Ala取代为Val；
(bd)将β亚单位的第176位的Tyr取代为Ala、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Val；
(be)将β亚单位的第40位的Thr取代为Val、及将β亚单位的第218位的Cys取代为Met；
(bf)将β亚单位的第33位的Ala取代为Met、及将β亚单位的第176位的Tyr取代为Thr；
(bg)将β亚单位的第40位的Thr取代为Leu、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Leu；
(bh)将β亚单位的第40位的Thr取代为Ile、及将β亚单位的第61位的Ala取代为Val；
(bi)将β亚单位的第61位的Ala取代为Thr、及将β亚单位的第218位的Cys取代为Ser；
(bj)将β亚单位的第112位的Lys取代为Val、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Met；
(bk)将β亚单位的第61位的Ala取代为Trp、及将β亚单位的第217位的Asp取代为His；
(bl)将β亚单位的第61位的Ala取代为Leu、及将β亚单位的第112位的Lys取代为Ile；
(bm)将β亚单位的第146位的Arg取代为Gly、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Ser；
(bn)将β亚单位的第171位的Lys取代为Ala、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Thr；
(bo)将β亚单位的第150位的Ala取代为Ser、及将β亚单位的第217位的Asp取代为Cys；
(bp)将β亚单位的第61位的Ala取代为Gly、及将β亚单位的第150位的Ala取代为Asn；
(bq)将β亚单位的第61位的Ala取代为Ser、及将β亚单位的第160位的Arg取代为Met；
(br)将β亚单位的第160位的Arg取代为Cys、及将β亚单位的第168位的Thr取代为Glu。
[8]一种编码[1]～[7]中任一项所述的腈水合酶突变体的基因。
[9]一种编码腈水合酶突变体的基因，其包含序列表的序列号：3表示的编码α亚单位的基因和序列表的序列号：4表示的编码β亚单位的基因，其特征在于，包含选自由下述(a)～(l)组成的碱基取代位置中的至少1个的碱基取代，
(a)序列号：3的碱基序列的第274位～第276位；
(b)序列号：3的碱基序列的第280位～第282位；
(c)序列号：3的碱基序列的第589位～第591位；
(d)序列号：4的碱基序列的第10位～第12位；
(e)序列号：4的碱基序列的第69位～第71位；
(f)序列号：4的碱基序列的第235位～第237位；
(g)序列号：4的碱基序列的第286位～第288位；
(h)序列号：4的碱基序列的第319位～第321位；
(i)序列号：4的碱基序列的第676位～第678位；
(j)序列号：4的碱基序列的第328位～第330位、及序列号：4的第691位～第693位；
(k)序列号：4的碱基序列的第616位～第618位、及序列号：4的碱基序列的第688位～第690位；
(l)序列号：3的碱基序列的第37位～第39位、及序列号：3的碱基序列的第79位～第81位、及序列号：4的碱基序列的第328位～第330位。
[10]如[9]所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，进一步包含选自由下述(m)～(u)组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代：
(m)为(b)或(g)时，序列号：3的碱基序列的第37位～第39位；
(n)为(b)或(h)时，序列号：3的碱基序列的第79位～第81位；
(o)(d)及(f)；
(p)为(f)时，序列号：4的碱基序列的第688位～690位；
(q)(a)及(i)；
(r)为(i)时，序列号：3的碱基序列的第37～39位及序列号：4的碱基序列的第616位～第618位；
(s)为(a)及(d)时，序列号：4的碱基序列的第616位～第618位；
(t)为(c)及(h)时，序列号：4的碱基序列的第688位～第690位；
(u)为(f)时，序列号：4的碱基序列的第688位～第690位、及序列号：4的碱基序列的第691位～第693位。
[11]如[9]所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，为(e)时，进一步包含选自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、序列号：4的碱基序列的第688位～第690位、及序列号：4的碱基序列的第691位～第693位组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代为其他碱基的取代。
[12]如[9]～[11]中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于：
序列号：3的碱基序列的第37位～第39位被碱基取代时，ATC被取代为CTC；
序列号：3的碱基序列的第79位～第81位被碱基取代时，ATG被取代为ATC；
序列号：3的碱基序列的第274位～第276位被碱基取代时，GAC被取代为GAG；
序列号：3的碱基序列的第280位～第282位被碱基取代时，ATG被取代为ATC；
序列号：3的碱基序列的第589位～第591位被碱基取代时，GGC被取代为TGC；
序列号：4的碱基序列的第10位～第12位被碱基取代时，GTG被取代为ATG；
序列号：4的碱基序列的第69位～第71位被碱基取代时，GTC被取代为ATC；
序列号：4的碱基序列的第235位～第237位被碱基取代时，CAC被取代为AAC；
序列号：4的碱基序列的第286位～第288位被碱基取代时，CAG被取代为CGT；
序列号：4的碱基序列的第319位～第321位被碱基取代时，CCC被取代为ATG；
序列号：4的碱基序列的第328位～第330位被碱基取代时，GAG被取代为AAC；
序列号：4的碱基序列的第616位～第618位被碱基取代时，CCG被取代为CTG；
序列号：4的碱基序列的第676位～第678位被碱基取代时，GTC被取代为ATC；
序列号：4的碱基序列的第688位～第690位被碱基取代时，GCG被取代为GAG；
序列号：4的碱基序列的第691位～第693位被碱基取代时，GCC被取代为GTC。
[13]如[9]～[12]中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因，其特征在于，包含选自由下述(aa)～(br)组成的碱基取代位置中的至少1个碱基取代，且具有腈水合酶活性：
(aa)将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为ATG、及将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC；
(ab)将序列号：3的碱基序列的第442位～第444位的GGC取代为GAC、及将序列号：3的碱基序列的第610位～第612位的GTC取代为CGC；
(ac)将序列号：4的碱基序列的第151位～第153位的TTC取代为GTC、及将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT；
(ad)将序列号：4的碱基序列的第352位～第354位的TTC取代为GTC、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(ae)将序列号：4的碱基序列的第478位～第480位的CGG取代为TGG、及将序列号：4的碱基序列的第556位～第558位的CTG取代为CGG；
(af)将序列号：3的碱基序列的第16位～第18位的CTG取代为ACG、将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为ATG、及将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC；
(ag)将序列号：3的碱基序列的第55位～第57位的GCG取代为GTG、将序列号：3的碱基序列的第211位～第213位的CGT取代为CAT、及将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC；
(ah)将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为ATG、将序列号：3的碱基序列的第442位～第444位的GGC取代为GAC、及将序列号：3的碱基序列的第610位～第612位的GTC取代为CGC；
(ai)将序列号：4的碱基序列的第28位～第30位的ACC取代为GAC、将序列号：4的碱基序列的第352位～第354位的TTC取代为GTC、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(aj)将序列号：4的碱基序列的第109位～第111位的TTC取代为CTC、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(ak)将序列号：4的碱基序列的第109位～第111位的TTC取代为GTC、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(al)将序列号：4的碱基序列的第121位～第123位的TTC取代为ATC、将序列号：4的碱基序列的第151位～第153位的TTC取代为GTC、及将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT；
(am)将序列号：4的碱基序列的第136位～第138位的ATG取代为AAG、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为CGG、及将序列号：4的碱基序列的第634位～第636位的TCC取代为TAC；
(an)将序列号：4的碱基序列的第142位～第144位的CTG取代为GTG、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为CGG、及将序列号：4的碱基序列的第634位～第636位的TCC取代为TAC；
(ao)将序列号：4的碱基序列的第379位～第381位的CTG取代为TCG、将序列号：4的碱基序列的第478位～第480位的CGG取代为TGG、及将序列号：4的碱基序列的第556位～第558位的CTG取代为CGG；
(ap)将序列号：3的碱基序列的第16位～第18位的CTG取代为ACG、将序列号：3的碱基序列的第55位～第57位的GCG取代为GTG、将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC、将序列号：4的碱基序列的第136位～第138位的ATG取代为AAG、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为CGG、及将序列号：4的碱基序列的第634位～第636位的TCC取代为TAC；
(aq)将序列号：3的碱基序列的第16位～第18位的CTG取代为ACG、将序列号：3的碱基序列的第55位～第57位的GCG取代为GTG、将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC、将序列号：4的碱基序列的第142位～第144位的CTG取代为GTG、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为CGG、及将序列号：4的碱基序列的第634位～第636位的TCC取代为TAC；
(ar)将序列号：3的碱基序列的第16位～第18位的CTG取代为GCG、将序列号：3的碱基序列的第55位～第57位的GCG取代为GTG、将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC、将序列号：4的碱基序列的第379位～第381位的CTG取代为TCG、将序列号：4的碱基序列的第478位～第480位的CGG取代为TGG、及将序列号：4的碱基序列的第556位～第558位的CTG取代为CGG；
(as)将序列号：3的碱基序列的第16位～第18位的CTG取代为ACG、将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为ATG、将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC、将序列号：4的碱基序列的第28位～第30位的ACC取代为GAC、将序列号：4的碱基序列的第352位～第354位的TTC取代为GTC、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(at)将序列号：3的碱基序列的第55位～第57位的GCG取代为GTG、将序列号：3的碱基序列的第211位～第213位的CGT取代为CAT、将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC、将序列号：4的碱基序列的第109位～第111位的TTC取代为CTC、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(au)将序列号：3的碱基序列的第55位～第57位的GCG取代为GTG、将序列号：3的碱基序列的第211位～第213位的CGT取代为CAT、将序列号：3的碱基序列的第376位～第378位的TTC取代为TAC、将序列号：4的碱基序列的第109位～第111位的TTC取代为GTC、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(av)将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为ATG、将序列号：3的碱基序列的第442位～第444位的GGC取代为GAC、将序列号：3的碱基序列的第610位～第612位的GTC取代为CGC、将序列号：4的碱基序列的第121位～第123位的TTC取代为ATC、将序列号：4的碱基序列的第151位～第153位的TTC取代为GTC、及将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT；
(aw)将序列号：3的碱基序列的第442位～第444位的GGC取代为GAC、将序列号：3的碱基序列的第610位～第612位的GTC取代为CGC、将序列号：4的碱基序列的第322位～第324位的GAG取代为GAT、及将序列号：4的碱基序列的第598位～第600位的GCC取代为GAG；
(ax)将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为GGG、及将序列号：3的碱基序列的第562位～第564位的ACC取代为GGC；
(ay)将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为GCG、及将序列号：3的碱基序列的第142位～第144位的AAC取代为CAA；
(az)将序列号：3的碱基序列的第142位～第144位的AAC取代为GAA、及将序列号：4的碱基序列的第436位～第438位的CGG取代为GGG；
(ba)将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为TGG、及将序列号：4的碱基序列的第526位～第528位的TAC取代为TGC；
(bb)将序列号：4的碱基序列的第526位～第528位的TAC取代为ATG、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为GGC；
(bc)将序列号：3的碱基序列的第106位～第108位的ACG取代为TCG、及将序列号：4的碱基序列的第97位～第99位的GCG取代为GTG；
(bd)将序列号：4的碱基序列的第526位～第528位的TAC取代为GCC、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为GTC；
(be)将序列号：4的碱基序列的第118位～第120位的ACG取代为GTG、及将序列号：4的碱基序列的第652位～第654位的TGC取代为ATG；
(bf)将序列号：4的碱基序列的第97位～第99位的GCG取代为ATG、及将序列号：4的碱基序列的第526位～第528位的TAC取代为ACC；
(bg)将序列号：4的碱基序列的第118位～第120位的ACG取代为CTG、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为CTC；
(bh)将序列号：4的碱基序列的第118位～第120位的ACG取代为ATT、及将序列号：4的碱基序列的第181位～第183位的GCC取代为GTC；
(bi)将序列号：4的碱基序列的第181位～第183位的GCC取代为ACG、及将序列号：4的碱基序列的第652位～第654位的TGC取代为TCC；
(bj)将序列号：4的碱基序列的第334位～第336位的AAG取代为GTG、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为ATG；
(bk)将序列号：4的碱基序列的第181位～第183位的GCC取代为TGG、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为CAC；
(bl)将序列号：4的碱基序列的第181位～第183位的GCC取代为CTC、及将序列号：4的碱基序列的第334位～第336位的AAG取代为ATT；
(bm)将序列号：4的碱基序列的第436位～第438位的CGG取代为GGG、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为AGC；
(bn)将序列号：4的碱基序列的第511位～第513位的AAG取代为GCG、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为ACC；
(bo)将序列号：4的碱基序列的第448位～第450位的GCG取代为TCG、及将序列号：4的碱基序列的第649位～第651位的GAC取代为TGT；
(bp)将序列号：4的碱基序列的第181位～第183位的GCC取代为GGC、及将序列号：4的碱基序列的第448位～第450位的GCG取代为AAT；
(bq)将序列号：4的碱基序列的第181位～第183位的GCC取代为TCG、及将序列号：4的碱基序列的第478位～第480位的CGG取代为ATG；
(br)将序列号：4的碱基序列的第478位～第480位的CGG取代为TGT、及将序列号：4的碱基序列的第502位～第504位的ACG取代为GAG。
[14]一种被连接的DNA，所述DNA在[9]～[13]中任一项所述的编码腈水合酶突变体的基因的5’末端上游进一步包含含有基因表达所必需的启动子序列的DNA，并且在该启动子的3’末端的下游包含序列号：7中所包含的核糖体结合序列。
[15]一种质粒，含有[14]所述的DNA。
[16]一种转化体，是利用[15]所述的质粒将宿主细胞进行转化而得到的。
[17]一种腈水合酶突变体的生产方法，其特征在于，包括下述步骤：将[16]中所述的转化体在培养基中进行培养，在该转化体中生产基于质粒所含有的腈水合酶基因的腈水合酶突变体。
根据本发明，在含有序列表的序列号：1表示的α亚单位和序列表的序列号：2表示的β亚单位的腈水合酶中，包含选自由上述(a)～(l)组成的氨基酸取代位置中的至少一个氨基酸被取代为其他氨基酸的取代。由此，可以同时提高腈水合酶的反应初速度及酶稳定性，提高酶制备物的每单位重量的活性值，同时可降低在工业利用中由温度变化等引起的酶失活的风险。因此，能够以更少的酶量稳定地生产酰胺化合物，由此可以降低酰胺化合物的制造成本。
根据本发明，能够提供一种与野生型腈水合酶相比反应初速度及酶稳定性得以提高的新型腈水合酶突变体，能够降低酰胺化合物的制造成本中所占的该酶的制造成本。
具体实施方式
上述目的、及其他目的、特征及优点通过以下所述的优选实施方式进一步明确。以下，更详细地说明本发明。
本发明的腈水合酶突变体包含至少1个氨基酸被取代为其他氨基酸的取代，所述取代通过3个以下1个以上的氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。
所谓本发明的腈水合酶突变体所改善的性质有与将腈基水合、转变为酰胺基的反应本身相关的物性和酶稳定性。所谓与反应本身相关的物性有酶的活性、基质特异性、Vmax、Km及反应初速度。酶稳定性中包括热稳定性、对基质的稳定性、对产物的稳定性。
本发明的腈水合酶突变体优选包含改善来源于嗜热菌的腈水合酶的性质的至少1个的氨基酸被取代为其他氨基酸的取代。作为嗜热菌的例子，可以优选使用属于假诺卡氏菌(Pseudonocardia)属的菌，具体可以举出嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)。
更具体而言，本发明的腈水合酶突变体是在含有序列表的序列号：1表示的α亚单位和序列表的序列号：2表示的β亚单位的腈水合酶中，如表I所示，选自(a)～(l)中至少1个的氨基酸取代位置被取代为其他氨基酸。由此，本发明的腈水合酶突变体能够具有比专利文献1记载的野生型腈水合酶高的反应初速度及酶稳定性。
(表I)
表I所示的(a)～(l)的氨基酸取代可以多个进行组合也可以与在(a)～(l)之外的不同位置的氨基酸取代进行组合。例如，为(e)时，选自由(a)、(c)、(f)、(i)、(h)、β亚单位的第230位、及β亚单位的第231位组成的组中的至少1个氨基酸可被取代为其他氨基酸。作为可与(a)～(l)组合的氨基酸取代的例子，例如有表II的例子。
(表II)
本发明的腈水合酶突变体可在上述(a)～(x)中的任一腈水合酶突变体中进一步包含在如表III所示的序列号1及序列号2的腈水合酶的氨基酸位置(aa)～(br)处发生突变。
(表III)
(表III续-1)
(表III续2)
(表III续3)
本发明中，所谓“腈水合酶活性”是指通过水合将各种化合物的腈基转变为酰胺基的腈水合活性，更优选指将丙烯腈转变为丙烯酰胺的活性。
本发明中，所谓“提高腈水合酶活性”是指提高反应初速度。本发明中的“反应初速度”可以以如下方式进行确认。首先，在含有2.5％(v/v)的丙烯腈作为基质的50mMTris-HCl水溶液(pH8.0)中加入腈水合酶样品。也可以使用微生物的菌体及培养液、或腈水合酶粗纯化物代替腈水合酶样品。添加腈水合酶后，于20℃下反应15分钟。在反应液中加入1M磷酸，停止反应，对生成的丙烯酰胺进行定量。丙烯酰胺量可利用HPLC进行分析。
本发明中所谓的“反应初速度的提高”是指，与野生型的腈水合酶、以及一直以来公知的腈水合酶突变体相比，反应初速度显著提高，具体而言是指提高至1.2倍以上。
本发明中，所谓“提高酶稳定性”是指提高腈水合酶的热稳定性。由于热稳定性提高的腈水合酶可以视为是蛋白质的结构稳定性得到强化的腈水合酶，所以期待对加热之外的应力即对有机溶剂、高浓度的基质、或产物的稳定性也增加。
本发明中的“酶的热稳定性”可以以如下方式进行确认。首先，将腈水合酶样品在60℃下加热处理2小时，然后恢复至20℃，加入含有2.5％(v/v)的丙烯腈作为基质的50mMTris-HCl水溶液(pH8.0)。也可以使用微生物的菌体及培养液、或腈水合酶粗纯化物代替腈水合酶样品。将加热处理后的该腈水合酶与基质进行混合，之后于20℃下反应15分钟，测定反应初速度。
本发明中所谓“酶的热稳定性提高”是指与同样施加了加热处理的野生型的腈水合酶、以及一直以来公知的腈水合酶突变体相比，加热处理后的反应初速度显著提高，具体而言是指提高至1.2倍以上。
作为本发明中的野生型的腈水合酶，优选为专利文献1所记载的来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)的腈水合酶，作为可使该野生型腈水合酶在转化体内大量表达的质粒及利用该质粒转化而得到的细胞株，可以举出MT-10822(于1997年1月10日保藏在茨城县筑波市东1-1-1独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERMBP-5785)。本发明中的所谓一直以来公知的腈水合酶突变体，可以举出专利文献1～4中所记载的腈水合酶突变体。
本发明的腈水合酶突变体除了提高腈水合酶活性之外，还具有以下特性。关于该酶，α亚单位和β亚单位缔合得到的二聚物成为该酶的基本结构单元，该二聚物进一步缔合形成四聚物。α亚单位的第111位的半胱氨酸残基被翻译为半胱亚磺酸(cysteinesulfinicacid；Cys-SOOH)、第113位的半胱氨酸残基被翻译为半胱次磺酸(cysteinesulfenicacid；Cys-SOH)后受到修饰，通过该修饰氨基酸残基，α亚单位的多肽链与钴原子键合，形成活性中心。反应可以优选在0～60℃的范围内进行，反应时的pH通常在4～10、优选在6～9的范围内进行选择。
本发明的腈水合酶突变体可以以如下方式进行制造。
首先，准备含有对腈水合酶突变体进行编码的DNA的质粒，使用该质粒将任意的宿主细胞进行转化而得到转化体或细胞株。然后，培养上述转化体或细胞株而产生腈水合酶突变体。
编码野生型的腈水合酶的基因含有序列表的序列号：3表示的碱基序列和序列表的序列号：4表示的碱基序列。序列表的序列号：3表示的碱基序列与由序列表的序列号：1组成的氨基酸序列相对应，序列表的序列号：4表示的碱基序列与由序列表的序列号：2组成的氨基酸序列相对应。通过对序列号3及/或序列号4的碱基序列进行碱基取代可以得到对腈水合酶突变体进行编码的DNA。具体而言，表I所示的(a)～(l)的氨基酸取代，如表IV-1所示，可以通过碱基取代而实现。
(表IV-1)
另外，表II所示的氨基酸取代，如表IV-2所示，可以通过碱基取代而实现。
(表IV-2)
另外，表III所示的氨基酸取代，如表V所示，可以通过碱基取代而实现。
(表V)
(表V续-1)
(表V续-2)
(表V续-3)
(表V续-4)
作为质粒，除了含有如上所述的对腈水合酶突变体的α亚单位进行编码的基因、对β亚单位进行编码的基因或腈水合酶突变体基因之外，还具有能够通过将任意宿主细胞转化得到的转化体或细胞株而产生腈水合酶的结构，如各基因表达必需的控制区域及自我复制所必需的区域等。作为此处所谓的任意宿主细胞之一例，可以举出大肠杆菌。
作为表达所需的控制区域，可以举出启动子序列(含有控制转录的操纵基因序列。)、核糖体结合序列(SD序列)、转录终止序列等。作为具体的启动子序列的例子，可以举出来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子的trp启动子、乳糖操纵子的lac启动子、来源于λ噬菌体的PL启动子及PR启动子等。另外，也可以利用tac启动子或trc启动子之类的人为设计·改良的序列。
作为核糖体结合序列，优选序列号：7中所含的、具有TAAGGAGGT的序列，对于上述控制区域在质粒上的序列顺序，启动子序列和核糖体结合序列优选比编码腈水合酶突变体的基因更靠近5’末端侧上游，转录终止序列优选比编码腈水合酶突变体的基因更靠近3’末端侧下游。另外，腈水合酶突变体的α亚单位基因及β亚单位基因可以通过上述的控制区域以各自独立的顺反子形式进行表达，也可以通过共同的控制区域以多顺反子形式进行表达。
作为满足以上必要条件的质粒载体的例子，可以举出大肠杆菌中的具有可进行自我复制区域的pBR322、pUC18、pBluescript、pKK223-3、pSC101。
将编码本发明的腈水合酶突变体的基因与该腈水合酶突变体的活性表达所必需的区域一同插入上述质粒载体来构建本发明的质粒的方法、利用该质粒将期望的宿主细胞进行转化的方法及在该转化体内产生腈水合酶的方法中，例如可以利用“MolecularCloning3rdEdition”(J.Sambrook等；ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)等中所记载的分子生物学·生物工程学·基因工程学领域中公知的一般方法和宿主细胞。
利用上述质粒对期望的宿主细胞进行转化所得的转化体，可以通过在培养基中进行培养来生产基于该质粒所具有的腈水合酶基因的腈水合酶突变体。宿主细胞为大肠杆菌时，作为培养该转化体的培养基，通常使用LB培养基或M9培养基等，但优选使上述的培养基成分中存在0.1μg/mL以上的Fe离子及Co离子，接种该转化体后，使其在适当的培养温度(通常为20℃～50℃)下增殖即可。
使编码本发明的腈水合酶突变体的基因表达而生产具有所期望的酶活性的腈水合酶突变体时，需要对参与腈水合酶活化的蛋白质进行编码的基因。
上述所谓参与腈水合酶活化的蛋白质，是指具有该蛋白质的表达与否直接影响腈水合酶活化的性质的蛋白质，作为其代表例，可以举出日本特开平11-253168号公报中所记载的参与来源于嗜热假诺卡氏菌的腈水合酶活化的蛋白质(腈水合酶活化蛋白质)。该腈水合酶活化蛋白质的序列示于序列表：5及6中。
可以使用本发明的腈水合酶突变体以如下方式制造酰胺化合物。首先，对产生本发明的腈水合酶突变体的转化体或细胞株进行培养，使所得的培养液、细胞或细胞处理物于介质中与腈化合物相接触。由此制造对应的酰胺化合物。
此处所谓细胞处理物是指：来自该转化体的提取物或粉碎物、分离上述提取物或粉碎物的腈水合酶活性成分而得到的粗酶制备物或进一步精制得到的酶精制物等后分离物、使用适当的方法将该转化体或该转化体的提取物、粉碎物或后分离物固定化而得到的固定化物。接触温度没有特别限定，但优选在腈水合酶突变体不失活的温度范围内，较优选为0℃～60℃。作为腈化合物，只要是本发明的腈水合酶突变体作为基质能发挥作用的化合物即可，没有特殊限定，作为其代表例，可以优选举出乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈、异丁腈、丁烯腈、α-羟基异丁腈等碳原子数为2～4的腈化合物。该腈化合物在水性介质中的浓度没有特别限定，另外，反应温度也没有特别限定，但优选在该腈水合酶不失活的温度范围内，较优选为0℃～60℃。需要说明的是，为了以更少的酶量生产酰胺化合物，优选使用在酰胺化合物的制造条件下具有一定稳定性的腈水合酶突变体。
接下来，对本发明的作用效果进行详细地说明。本发明人等反复进行深入研究，结果发现了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶突变体通过包含经由3个以下1个以上的氨基酸取代而改善其2个以上性质的、至少1个氨基酸被取代为其他氨基酸的取代，而使得与现有的腈水合酶相比与反应本身相关的物性和酶稳定性均得以提高。并且发现，特别是对于含有序列表的序列号：1表示的α亚单位和序列表的序列号：2表示的β亚单位的腈水合酶，通过选自由上述(a)～(l)组成的氨基酸取代位置中的至少1个氨基酸被取代为其他氨基酸，不仅可以提高腈水合酶的反应初速度，而且可同时提高酶稳定性。由此，可以同时实现酶反应的效率化和酶的操作性。另外，通过使用同时提高了反应初速度及酶稳定性的腈水合酶，可以提高酶制备物的每单位重量的活性值，并且可以降低由工业利用上的温度变化等所引起的酶失活的风险。因此，可以以更少的酶量稳定地生产酰胺化合物，从而可以降低酰胺化合物的制造成本。
以上对本发明的实施方式进行了说明，但这些实施方式为本发明的示例，也可以使用除上述之外的各种结构。
[实施例]
通过以下的实施例更详细地说明本发明，但本发明不受以下实施例的任何限定。
[实施例1]改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)的获得
使用专利文献1的实施例3中记载的质粒pPT-DB1、序列表的序列号：7及8中记载的引物作为模板进行PCR反应，由此得到约0.7kbp的基因片段。利用限制酶EcoRI及NotI切割上述PCR片段后，对该限制酶处理液进行苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀以纯化该DNA片段。同样地利用EcoRI及NotI切割pPT-DB1，进行琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶中仅切下约3.9kbp的DNA片段。使用DNA连接试剂盒(ligationkit；宝酒造公司制)对如上所述得到的约0.7kbp与约3.9kbp的DNA片段进行连接，从而制作上述的核糖体结合序列被改变的腈水合酶表达质粒(1)。
利用该质粒对大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)进行转化，得到转化体(1)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪(sequencer)来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了pPT-DB1中具有表1所示的经改变的核糖体结合序列。
通过以下方法对使用如上所述得到的转化体(1)、及含有成为其基础的pPT-DB1的转化体、MT-10822(于平成8年2月7日保藏在茨城县筑波市东1-1-1独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERMBP-5785)制造酰胺化合物时的反应初速度进行比较。
<反应初速度的比较>
在试管中配制含有40μg/mL硫酸铁·七水合物及10μg/mL氯化钴·二水合物的5mLLB液体培养基，利用高压釜在121℃下灭菌20分钟。在培养基中添加氨苄西林，使其最终浓度为100μg/mL，之后，使用一白金环(platinumloop)接种各转化体，于37℃·200rpm下分别培养约20小时。从该培养结束液中取出40μL，使其悬浊在740μL的54mMTris-HCl水溶液(pH8.0)中，在其中添加20μL的丙烯腈，并在20℃下边缓慢搅拌边使其反应15分钟，使其生成丙烯酰胺。反应结束后，使用HPLC对反应液中的丙烯酰胺含量进行分析。
<酶的热稳定性的比较>
通过离心分离(5000G、15分钟)从上述转化体的培养结束液中分离各转化体。
使0.1g各转化体分别悬浊于20ml的50mMTris-HCl水溶液(pH8.0)中，于60℃下加热处理2小时。加热处理后恢复至20℃，添加0.5ml的丙烯腈作为基质，使其于20℃下反应15分钟，测定反应初速度。
<分析条件>
分析仪器：日本分光HPLC
柱：YMCPackODS-A(150×6.00mm)
分析温度：40℃
流动相：3％乙腈、10mM磷酸
关于反应及分析，对各转化体进行3次以上，以修正分注操作等的数据偏差。
对转化体(1)和MT-10822的反应初速度及热稳定性，即对在上述反应条件下生成的丙烯酰胺量进行比较，结果通过新增加表1所示的经改变的核糖体结合序列，可表现出1.15倍的反应初速度的提高，并且热稳定性得以维持。
(表1)
[参考例1]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(2)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(2)，所述腈水合酶突变体如表2所示在(av)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例79中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列由此来制备编码上述腈水合酶突变体的质粒(2)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(2)。
[参考例2]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(3)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(3)，所述腈水合酶突变体如表2所示在(bc)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，使用宝酒造公司制的“LAPCRinvitromutagenesisKit”(以下称作诱变试剂盒)进行位点定向诱变(Site-DirectedMutagenesis)。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板进行PCR反应。
PCR反应No.1如下进行：在含有序列表的序列号：9中记载的引物及M13引物M4(于序列表的序列号：10中记载序列)各50pmol的总量为50μL的体系(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)中，将热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、延长反应(72℃)120秒的条件重复25个循环。
PCR反应No.2如下进行：在含有MUT4引物(于序列表的序列号：11中记载序列)及M13引物RV(于序列表的序列号：12中记载序列)各50pmol的总量为50μL的体系(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)中，进行与PCR反应No.1相同的操作。
通过使用了PCR反应No.1及No.2的反应结束液各5μL的琼脂糖电泳(琼脂糖浓度为1.0重量％)来分析DNA扩增产物，结果可确认存在扩增DNA产物。使用Microcon100(宝酒造公司制)从各PCR反应结束液中除去过量的引物及dNTP，然后加入TE，配制各50μL的溶液。配制各含有该TE溶液0.5μL的总量为47.5μL的退火溶液(组成根据诱变试剂盒中记载的条件而不同)，进行10分钟的热变性处理(98℃)，之后以一定的速度经60分钟冷却至37℃，接着在37℃下保持15分钟，由此进行退火处理。
在退火处理液中加入TaKaRaLATaq(TaKaRaBio株式会社制)0.5μL，于72℃下加热处理3分钟，从而完成异源双链。
在其中加入M13引物M4(于序列表的序列号：10中记载序列)及M13引物RV(于序列表的序列号：12中记载序列)各50pmol，使总量为50μL，之后将热变性(98℃)15秒、退火(55℃)30秒、延长反应(72℃)120秒的条件重复25个循环，由此进行PCR反应No.3。使用5μLPCR反应No.3的反应结束液进行琼脂糖电泳(使用Sigma公司制的VII型低熔点琼脂糖；琼脂糖浓度为0.8重量％)，由此分析DNA扩增产物，结果可确认存在约2kb的扩增DNA产物。
接着，从琼脂糖凝胶中仅切下约2kb的DNA片段，将该琼脂糖片(约0.1g)微细地粉碎并悬浊在1mL的TE溶液中，然后在55℃下保温1小时使琼脂糖完全熔解。对该熔解液进行苯酚/氯仿萃取及乙醇沉淀来纯化该DNA片段，最后将其溶解在10μL的TE中。利用限制酶EcoRI及HindIII对经纯化的约2kb的扩增DNA片段进行切割，然后对该限制酶处理液进行苯酚/氯仿萃取及乙醇沉淀，由此纯化该DNA片段，最后将其溶解在10μL的TE中。
同样地利用EcoRI及HindIII对实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)进行切割，进行琼脂糖凝胶电泳(使用Sigma公司制的VII型低熔点的琼脂糖；琼脂糖浓度为0.7％)，从琼脂糖凝胶中仅切下约2.7kb的DNA片段。将切下的琼脂糖片(约0.1g)微细地粉碎并悬浊于1mL的TE溶液中，然后于55℃下保温1小时，使琼脂糖完全熔解。对该熔解液进行苯酚/氯仿萃取及乙醇沉淀，由此纯化该DNA片段，最后将其溶解在10μL的TE中。
使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制)对通过上述方式得到的约2kbp和约2.7kbp的DNA片段进行连接，之后对大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)进行转化。将从该转化体萃取得到的质粒作为模板，使用序列号：13中记载的引物代替序列号：9中记载的引物实施上述操作，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(3)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，从而得到转化体(3)。
[参考例3]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(4)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(4)，所述腈水合酶突变体如表2所示在(bh)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，使用上述参考例2中记载的诱变试剂盒进行位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号14及15中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(4)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(4)。
(表2)
[实施例2]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(5)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(5)，所述腈水合酶突变体如表3所示在(a)及(av)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例1中记载的转化体(2)中回收所得的质粒(2)为模板，使用序列表的序列号：16中记载的引物，并通过参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(5)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(5)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪来确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例1记载的质粒(2)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu。
利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(5)及成为其基础的转化体(2)制造酰胺化合物时的反应初速度以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(5)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu的突变，而相对于转化体(2)表现出1.65倍的反应初速度的提高及1.25倍的热稳定性的提高。
[实施例3]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(6)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(6)，所述腈水合酶突变体如表3所示在(a)及(bc)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例2中记载的转化体(3)中回收所得的质粒(3)为模板，使用序列表的序列号：16中记载的引物，并通过参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(6)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(6)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例2中记载的质粒(3)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(6)及成为其基础的转化体(3)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(6)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu的突变，而相对于转化体(3)表现出1.63倍的反应初速度的提高及1.23倍的热稳定性的提高。
[实施例4]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(7)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(7)，所述腈水合酶突变体如表3所示在(a)及(bh)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例3中记载的转化体(4)中回收所得的质粒(4)为模板，使用序列表的序列号：16中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(7)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(7)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例3中记载的质粒(4)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(7)及成为其基础的转化体(4)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(7)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu的突变，而相对于转化体(4)表现出1.58倍的反应初速度的提高及1.30倍的热稳定性的提高。
(表3)
[参考例4]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(8)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(8)，所述腈水合酶突变体如表4所示在(ak)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例68中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(8)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(8)。
[参考例5]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(9)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(9)，所述腈水合酶突变体如表4所示在(ap)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例73中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(9)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(9)。
[参考例6]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(10)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(10)，所述腈水合酶突变体如表4所示在(bp)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：17及18中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(10)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(10)。
(表4)
[实施例5]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(11)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(11)，所述腈水合酶突变体如表5所示在(b)及(ak)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例4中记载的转化体(8)中回收所得的质粒(8)为模板，使用序列表的序列号：19中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(11)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(11)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例4中记载的质粒(8)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(11)及成为其基础的转化体(8)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(11)通过新增加α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(8)表现出1.45倍的反应初速度的提高、及1.38倍的热稳定性的提高。
[实施例6]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(12)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(12)，所述腈水合酶突变体如表5所示在(b)及(ap)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例5中记载的转化体(9)中回收所得的质粒(9)为模板，使用序列表的序列号：19中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(12)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(12)。利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例5中记载的质粒(9)中具有新增加有α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变的符合目的的序列。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(12)、及成为其基础的转化体(9)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(12)通过新增加α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(9)表现出1.40倍的反应初速度的提高、及1.25倍的热稳定性的提高。
[实施例7]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(13)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(13)，所述腈水合酶突变体如表5所示在(b)及(bp)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例6中记载的转化体(10)中回收所得的质粒(10)为模板，使用序列表的序列号：19中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(13)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(13)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例6中记载的质粒(10)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(13)、及成为其基础的转化体(10)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(13)通过新增加α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(10)表现出1.32倍的反应初速度的提高、及1.35倍的热稳定性的提高。
(表5)
[参考例7]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(14)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(14)，所述腈水合酶突变体如表6所示在(an)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例71中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(14)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(14)。
[参考例8]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(15)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(15)，所述腈水合酶突变体如表6所示在(be)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：20及21中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(15)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(15)。
[参考例9]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(16)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(16)，所述腈水合酶突变体如表6所示在(br)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：22及23中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(16)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(16)。
(表6)
[实施例8]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(17)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(17)，所述腈水合酶突变体如表7所示在(c)及(an)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例7中记载的转化体(14)回收所得的质粒(14)为模板，使用序列表的序列号：24中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(17)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(17)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例7中记载的质粒(14)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(17)及成为其基础的转化体(14)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(17)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys的突变，而相对于转化体(14)表现出1.80倍的反应初速度的提高、及1.25倍的热稳定性的提高。
[实施例9]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(18)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(18)，所述腈水合酶突变体如表7所示在(c)及(be)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例8中记载的转化体(15)回收所得的质粒(15)为模板，使用序列表的序列号：24中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(18)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(18)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例8中记载的质粒(15)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(18)及成为其基础的转化体(15)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(18)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys的突变，而相对于转化体(15)表现出1.86倍的反应初速度的提高、及1.40倍的热稳定性的提高。
[实施例10]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(19)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(19)，所述腈水合酶突变体如表7所示在(c)及(br)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例9中记载的转化体(16)回收所得的质粒(16)为模板，使用序列表的序列号：24中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(19)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(19)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了参考例9中记载的质粒(16)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(19)及成为其基础的转化体(16)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(19)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys的突变，而相对于转化体(16)表现出1.68倍的反应初速度的提高、及1.20倍的热稳定性的提高。
(表7)
[参考例10]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(20)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(20)，所述腈水合酶突变体如表8所示在(ar)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例75中记载的质粒为模板，利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(20)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(20)。
[参考例11]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(21)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(21)，所述腈水合酶突变体如表8所示在(ax)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：25及26中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(21)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(21)。
[参考例12]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(22)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(22)，所述腈水合酶突变体如表8所示在(bd)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：27及28中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(22)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(22)。
(表8)
[实施例11]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(23)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(23)，所述腈水合酶突变体如表9所示在(d)及(ar)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例10中记载的转化体(20)回收所得的质粒(20)为模板，使用序列表的序列号：29中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(23)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(23)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例10中记载的质粒(20)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(23)及成为其基础的转化体(20)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(23)通过新增加β亚单位的第4位的Val被取代为Met的突变，而相对于转化体(20)表现出1.25倍的反应初速度的提高、及1.35倍的热稳定性的提高。
[实施例12]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(24)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(24)，所述腈水合酶突变体如表9所示在(d)及(ax)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例11中记载的转化体(21)回收所得的质粒(21)为模板，使用序列表的序列号：29中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(24)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(24)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例11中记载的质粒(21)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(24)及成为其基础的转化体(21)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(24)通过新增加β亚单位的第4位的Val被取代为Met的突变，而相对于转化体(21)表现出1.32倍的反应初速度的提高、及1.39倍的热稳定性的提高。
[实施例13]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(25)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(25)，所述腈水合酶突变体如表9所示在(d)及(bd)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例12中记载的转化体(22)回收所得的质粒(22)为模板，使用序列表的序列号：29中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(25)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(19)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例12中记载的质粒(22)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(25)及成为其基础的转化体(22)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
转化体(25)和转化体(22)的反应初速度和热稳定性的比较结果，转化体(25)通过新增加β亚单位的第4位的Val被取代为Met的突变，而相对于转化体(22)表现出1.25倍的反应初速度的提高、及1.25倍的热稳定性的提高。
(表9)
[参考例13]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(26)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(26)，所述腈水合酶突变体如表10所示在(ao)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例72中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(26)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(26)。
[参考例14]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(27)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(27)，所述腈水合酶突变体如表10所示在(at)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例77中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(27)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(27)。
(表10)
[比较例1]腈水合酶活性得以提高的氨基酸取代物的获得(28)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(28)，所述腈水合酶突变体如表11所示在β亚单位的第8位及(ao)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例13中记载的转化体(26)回收得到的质粒(26)为模板，使用序列表的序列号：30中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(28)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(28)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例13中记载的质粒(26)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(28)及成为其基础的转化体(26)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
其比较结果，转化体(28)通过新增加β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala的突变，而相对于转化体(26)表现出1.35倍的反应初速度的提高、及0.65倍的热稳定性的降低。
[比较例2]腈水合酶活性得以提高的氨基酸取代物的获得(29)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(29)，所述腈水合酶突变体如表11所示在β亚单位的第8位及(at)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例14中记载的转化体(27)回收所得的质粒(27)为模板，使用序列表的序列号：30中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(29)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(29)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例14中记载的质粒(27)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(29)及成为其基础的转化体(27)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(29)通过新增加β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala的突变，而相对于转化体(27)表现出1.40倍的反应初速度的提高、及0.31倍的热稳定性的降低。
[比较例3]腈水合酶活性得以提高的氨基酸取代物的获得(30)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(30)，所述腈水合酶突变体如表11所示在β亚单位的第8位及(br)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例9中记载的转化体(16)中回收所得的质粒(16)为模板，使用序列表的序列号：30中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(30)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(30)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了参考例9中记载的质粒(16)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala。采用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(30)及成为其基础的转化体(16)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(30)通过新增加β亚单位的第8位的Gly被取代为Ala的突变，而相对于转化体(16)表现出1.32倍的反应初速度的提高、及0.52倍的热稳定性的降低。
(表11)
[参考例15]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(31)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(31)，所述腈水合酶突变体如表12所示在(au)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例78中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(31)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(31)。
[参考例16]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(32)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(32)，所述腈水合酶突变体如表12所示在(bf)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：31及32中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(32)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(32)。
(表12)
[实施例14]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(33)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(33)，所述腈水合酶突变体如表13所示在(f)及(au)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例15中记载的转化体(31)回收所得的质粒(31)为模板，使用序列表的序列号：33中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(33)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(33)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例15记载的质粒(31)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(33)及成为其基础的转化体(31)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(33)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn的突变，而相对于转化体(31)表现出1.29倍的反应初速度的提高、及1.82倍的热稳定性的提高。
[实施例15]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(34)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(34)，所述腈水合酶突变体如表13所示在(f)及(bf)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例16中记载的转化体(32)回收所得的质粒(32)为模板，使用序列表的序列号：33中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(34)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(34)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例16中记载的质粒(32)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(34)及成为其基础的转化体(32)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(34)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn的突变，而相对于转化体(32)表现出1.25倍的反应初速度的提高、及1.76倍的热稳定性的提高。
[实施例16]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(35)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(35)，所述腈水合酶突变体如表13所示在(f)及(bp)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例6中记载的转化体(10)回收所得的质粒(10)为模板，使用序列表的序列号：33中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(35)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(35)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例6记载的质粒(10)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(35)及成为其基础的转化体(10)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(35)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn的突变，而相对于转化体(10)表现出1.30倍的反应初速度的提高、及1.72倍的热稳定性的提高。
(表13)
[参考例17]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(36)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(36)，所述腈水合酶突变体如表14所示在(aa)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例58中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(36)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(36)。
[参考例18]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(37)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(37)，所述腈水合酶突变体如表14所示在(ah)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例65中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(37)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(37)。
[参考例19]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(38)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(38)，所述腈水合酶突变体如表14所示在(aq)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例74中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(38)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(38)。
(表14)
[实施例17]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(39)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(39)，所述腈水合酶突变体如表15所示在(g)及(aa)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例17中记载的转化体(36)回收所得的质粒(36)为模板，使用序列表的序列号：34中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(39)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(39)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例17中记载的质粒(36)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(39)及成为其基础的转化体(36)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(39)通过新增加β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg的突变，而相对于转化体(36)表现出1.33倍的反应初速度的提高、及1.25倍的热稳定性的提高。
[实施例18]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(40)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(40)，所述腈水合酶突变体如表15所示在(g)及(ah)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例18中记载的转化体(37)回收所得的质粒(37)为模板，使用序列表的序列号：34中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(40)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(40)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例18中记载的质粒(37)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(40)及成为其基础的转化体(37)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(40)通过新增加β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg的突变，而相对于转化体(37)表现出1.25倍的反应初速度的提高、及1.36倍的热稳定性的提高。
[实施例19]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(41)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(41)，所述腈水合酶突变体如表15所示在(g)及(aq)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例19中记载的转化体(38)回收所得的质粒(38)为模板，使用序列表的序列号：34中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(41)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(41)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例19中记载的质粒(38)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(41)及成为其基础的转化体(38)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(41)通过新增加β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg的突变，而相对于转化体(38)表现出1.35倍的反应初速度的提高、及1.42倍的热稳定性的提高。
(表15)
[参考例20]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(42)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(42)，所述腈水合酶突变体如表16所示在(ae)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例62中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(42)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(42)。
[参考例21]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(43)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(43)，所述腈水合酶突变体如表16所示在(bk)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：35及36中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(43)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(43)。
(表16)
[实施例20]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(44)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(44)，所述腈水合酶突变体如表17所示在(h)及(ae)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例20中记载的转化体(42)回收所得的质粒(42)为模板，使用序列表的序列号：37中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(44)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(44)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例20中记载的质粒(42)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(44)及成为其基础的转化体(42)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(44)通过新增加β亚单位的第107位的Pro被取代为Met的突变，而相对于转化体(42)表现出1.34倍的反应初速度的提高、及2.25倍的热稳定性的提高。
[实施例21]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(45)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(45)，所述腈水合酶突变体如表17所示在(h)及(au)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例15中记载的转化体(31)回收所得的质粒(31)为模板，使用序列表的序列号：68中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(45)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(45)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例15中记载的质粒(31)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过上述方式得到的转化体(45)及成为其基础的转化体(31)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(45)通过新增加β亚单位的第107位的Pro被取代为Met的突变，而相对于转化体(31)表现出1.40倍的反应初速度的提高、及2.12倍的热稳定性的提高。
[实施例22]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(46)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(46)，所述腈水合酶突变体如表17所示在(h)及(bk)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述的参考例21中记载的转化体(43)回收所得的质粒(43)为模板，使用序列表的序列号：37中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(46)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(46)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例21中记载的质粒(43)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(46)及成为其基础的转化体(43)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(46)通过新增加β亚单位的第107位的Pro被取代为Met的突变，而相对于转化体(43)表现出1.32倍的反应初速度的提高、及2.40倍的热稳定性的提高。
(表17)
[实施例23]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(47)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(47)，所述腈水合酶突变体如表18所示在(i)及(aa)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例17中记载的转化体(36)回收所得的质粒(36)为模板，使用序列表的序列号：38中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(47)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(47)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例17中记载的质粒(36)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(47)及成为其基础的转化体(36)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(47)通过新增加β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(36)表现出1.26倍的反应初速度的提高、及1.29倍的热稳定性的提高。
[实施例24]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(48)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(48)，所述腈水合酶突变体如表18所示在(i)及(ak)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例4中记载的转化体(8)回收所得的质粒(8)为模板，使用序列表的序列号：38中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(48)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(48)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例4中记载的质粒(8)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(48)及成为其基础的转化体(8)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(48)通过新增加β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(8)表现出1.35倍的反应初速度的提高、及1.27倍的热稳定性的提高。
[实施例25]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(49)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(49)，所述腈水合酶突变体如表18所示在(i)及(be)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例8中记载的转化体(15)回收所得的质粒(15)为模板，使用序列表的序列号：38中记载的引物，并利用参考例2中记载的使用诱变试剂盒的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(49)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(49)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例8中记载的质粒(15)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(49)及成为其基础的转化体(15)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(49)通过新增加β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(15)表现出1.25倍的反应初速度的提高、及1.30倍的热稳定性的提高。
(表18)
[参考例22]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(50)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(50)，所述腈水合酶突变体如表19所示在(af)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例63中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(50)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(50)。
[参考例23]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(51)
为了获得编码腈水合酶突变体的质粒，所述腈水合酶突变体如表19所示在(bq)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：39及40中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(51)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(51)。
[参考例24]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(52)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(52)，所述腈水合酶突变体如表19所示在(bj)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：41及42中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(52)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(52)。
(表19)
[实施例26]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(53)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(53)，所述腈水合酶突变体如表20所示在(m-1)及(af)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例22中记载的转化体(50)回收所得的质粒(50)为模板，使用序列表的序列号：43及19中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(53)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(53)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例22中记载的质粒(50)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(53)及成为其基础的转化体(50)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(53)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(50)表现出1.67倍的反应初速度的提高和1.45倍的热稳定性的提高。
[实施例27]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(54)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(54)，所述腈水合酶突变体如表20所示在(m-1)及(bq)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例23中记载的转化体(51)回收所得的质粒(51)为模板，使用序列表的序列号：43及19中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(54)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(54)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例23中记载的质粒(51)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。通过利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(54)及成为其基础的转化体(51)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(54)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(51)表现出1.59倍的反应初速度的提高、及1.32倍的热稳定性的提高。
[实施例28]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(55)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(55)，所述腈水合酶突变体如表20所示在(m-1)及(bj)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例24中记载的转化体(52)回收所得的质粒(52)为模板，使用序列表的序列号：43及19中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(55)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(55)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例24中记载的质粒(52)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(55)及成为其基础的转化体(52)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(55)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(52)表现出1.62倍的反应初速度的提高、及1.26倍的热稳定性的提高。
(表20)
[参考例25]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(56)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(56)，所述腈水合酶突变体如表21所示在(am)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例70中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(56)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(56)。
[参考例26]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(57)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(57)，所述腈水合酶突变体如表21所示在(ay)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：44及45中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(57)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(57)。
(表21)
[实施例29]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(58)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(58)，所述腈水合酶突变体如表22所示在(m-2)及(am)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例25中记载的转化体(56)回收所得的质粒(56)为模板，使用序列表的序列号：43及34中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(58)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(58)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例25中记载的质粒(56)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(58)及成为其基础的转化体(56)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(58)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg的突变，而相对于转化体(56)表现出1.53倍的反应初速度的提高、及1.32倍的热稳定性的提高。
[实施例30]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(59)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(59)，所述腈水合酶突变体如表22所示在(m-2)及(at)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例14中记载的转化体(27)回收所得的质粒(27)为模板，使用序列表的序列号：43及34中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(59)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(59)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例14中记载的质粒(27)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(59)、及成为其基础的转化体(27)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(59)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg的突变，而相对于转化体(27)表现出1.49倍的反应初速度的提高、及1.28倍的热稳定性的提高。
[实施例31]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(60)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(60)，所述腈水合酶突变体如表22所示在(m-2)及(ay)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例26中记载的转化体(57)回收所得的质粒(57)为模板，使用序列表的序列号：43及34中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(60)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(60)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例26中记载的质粒(57)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(60)及成为其基础的转化体(57)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(60)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu及β亚单位的第96位的Gln被取代为Arg的突变，而相对于转化体(57)表现出1.39倍的反应初速度的提高、及1.45倍的热稳定性的提高。
(表22)
[实施例32]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(61)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(61)，所述腈水合酶突变体如表23所示在(n-1)及(af)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例22中记载的转化体(50)回收所得的质粒(50)为模板，使用序列表的序列号：46及19中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(61)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(61)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例22中记载的质粒(50)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。利用与实施例1中记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(61)及成为其基础的转化体(50)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(61)通过新增加α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(50)表现出1.65倍的反应初速度的提高、及1.36倍的热稳定性的提高。
[实施例33]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(62)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(62)，所述腈水合酶突变体如表23所示在(n-1)及(ao)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例13中记载的转化体(26)回收所得的质粒(26)为模板，使用序列表的序列号：46及19中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(62)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(62)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例13中记载的质粒(26)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法来对使用通过如上方式得到的转化体(62)及成为其基础的转化体(26)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(62)通过新增加α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(26)表现出1.72倍的反应初速度的提高、及1.47倍的热稳定性的提高。
[实施例34]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(63)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(63)，所述腈水合酶突变体如表23所示在(n-1)及(ax)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例11中记载的转化体(21)回收所得的质粒(21)为模板，使用序列表的序列号：46及19中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(63)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(63)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例11中记载的质粒(21)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(63)及成为其基础的转化体(21)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(63)通过新增加α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及α亚单位的第94位的Met被取代为Ile的突变，而相对于转化体(21)表现出1.55倍的反应初速度的提高、及1.27倍的热稳定性的提高。
(表23)
[参考例27]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(64)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(64)，所述腈水合酶突变体如表24所示在(aj)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例67中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(64)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(64)。
[参考例28]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(65)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(65)，所述腈水合酶突变体如表24所示在(as)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例76中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(65)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(65)。
[参考例29]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(66)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(66)，所述腈水合酶突变体如表24所示在(bb)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：47及48中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(66)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(66)。
(表24)
[实施例35]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(67)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(67)，所述腈水合酶突变体如表25所示在(n-2)及(aj)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例27中记载的转化体(64)回收所得的质粒(64)为模板，使用序列表的序列号：46及68中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(67)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(67)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例27中记载的质粒(64)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(67)及成为其基础的转化体(64)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(67)通过新增加α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met的突变，而相对于转化体(64)表现出1.53倍的反应初速度的提高、及2.23倍的热稳定性的提高。
[实施例36]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(68)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(68)，所述腈水合酶突变体如表25所示在(n-2)及(as)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例28中记载的转化体(65)中回收所得的质粒(65)为模板，使用序列表的序列号：46及37中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(68)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(68)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例28中记载的质粒(65)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(68)及成为其基础的转化体(65)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(68)通过新增加α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met的突变，而相对于转化体(65)表现出1.55倍的反应初速度的提高、及2.15倍的热稳定性的提高。
[实施例37]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(69)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(69)，所述腈水合酶突变体如表25所示在(n-2)及(bb)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例29中记载的转化体(66)回收所得的质粒(66)为模板，使用序列表的序列号：46及37中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(69)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(69)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例29中记载的质粒(66)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(69)及成为其基础的转化体(66)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(69)通过新增加α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第107位的Pro被取代为Met的突变，而相对于转化体(66)表现出1.46倍的反应初速度的提高、及1.92倍的热稳定性的提高。
(表25)
[参考例30]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(70)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(70)，所述腈水合酶突变体如表26所示在(al)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例69中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(70)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(70)。
[参考例31]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(71)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(71)，所述腈水合酶突变体如表26所示在(aw)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2实施例80中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(71)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(71)。
[参考例32]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(72)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(72)，所述腈水合酶突变体如表26所示在(bl)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：49及50中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(72)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(72)。
(表26)
[实施例38]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(73)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(73)，所述腈水合酶突变体如表27所示在(q)及(al)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例30中记载的转化体(70)回收所得的质粒(70)为模板，使用序列表的序列号：16及38中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(73)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(73)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例30中记载的质粒(70)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(73)及成为其基础的转化体(70)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(73)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(70)表现出2.00倍的反应初速度的提高及1.52倍的热稳定性的提高。
[实施例39]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(74)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(74)，所述腈水合酶突变体如表27所示在(q)及(aw)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例31中记载的转化体(71)回收所得的质粒(71)为模板，使用序列表的序列号：16及38中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(74)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(74)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例31中记载的质粒(71)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(74)及成为其基础的转化体(71)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(74)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(71)表现出1.78倍的反应初速度的提高、及1.44倍的热稳定性的提高。
[实施例40]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(75)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(75)，所述腈水合酶突变体如表27所示在(q)及(bl)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例32中记载的转化体(72)回收所得的质粒(72)为模板，使用序列表的序列号：16及38中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(75)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(75)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例32中记载的质粒(72)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(75)及成为其基础的转化体(72)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(75)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(72)表现出1.85倍的反应初速度的提高、及1.38倍的热稳定性的提高。
(表27)
[参考例33]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(76)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(76)，所述腈水合酶突变体如表28所示在(bi)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：51及52中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(76)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(76)。
[参考例34]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(77)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(77)，所述腈水合酶突变体如表28所示在(bm)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：53及54中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(77)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(77)。
(表28)
[实施例41]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(78)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(78)，所述腈水合酶突变体如表29所示在(o)及(an)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例7中记载的转化体(14)回收所得的质粒(14)为模板，使用序列表的序列号：29及33中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(78)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(78)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例7中记载的质粒(14)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第79位的His被取代为Asn。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(78)及成为其基础的转化体(14)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(78)通过新增加β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第79位的His被取代为Asn的突变，而相对于转化体(14)表现出1.60倍的反应初速度的提高、及1.46倍的热稳定性的提高。
[实施例42]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(79)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(79)，所述腈水合酶突变体如表29所示在(o)及(bi)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例33中记载的转化体(76)回收所得的质粒(76)为模板，使用序列表的序列号：29及33中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(79)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(79)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例33中记载的质粒(76)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第79位的His被取代为Asn。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(79)及成为其基础的转化体(76)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(79)通过新增加β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第79位的His被取代为Asn的突变，而相对于转化体(76)表现出1.38倍的反应初速度的提高、及1.35倍的热稳定性的提高。
[实施例43]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(80)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(80)，所述腈水合酶突变体如表29所示在(o)及(bm)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例34中记载的转化体(77)回收所得的质粒(77)为模板，使用序列表的序列号：29及33中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(80)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(80)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例34中记载的质粒(77)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第79位的His被取代为Asn。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(80)及成为其基础的转化体(77)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(80)通过新增加β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第79位的His被取代为Asn的突变，而相对于转化体(77)表现出1.52倍的反应初速度的提高、及1.28倍的热稳定性的提高。
(表29)
[参考例35]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(81)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(81)，所述腈水合酶突变体如表30所示在(ag)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例64中记载的质粒为模板，利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(81)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(81)。
[参考例36]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(82)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(82)，所述腈水合酶突变体如表30所示在(ai)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例66中记载的质粒为模板，利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(82)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(82)。
(表30)
[实施例44]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(83)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(83)，所述腈水合酶突变体如表31所示在(p)及(ag)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例35中记载的转化体(81)回收所得的质粒(81)为模板，使用序列表的序列号：33及60中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(83)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(83)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例35中记载的质粒(81)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(83)及成为其基础的转化体(81)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(83)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(81)表现出1.25倍的反应初速度的提高、及2.16倍的热稳定性的提高。
[实施例45]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(84)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(84)，所述腈水合酶突变体如表31所示在(p)及(ai)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例36中记载的转化体(82)回收所得的质粒(82)为模板，使用序列表的序列号：33及60中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(84)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(84)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例36中记载的质粒(82)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(84)、及成为其基础的转化体(82)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(84)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(82)表现出1.27倍的反应初速度的提高、及2.10倍的热稳定性的提高。
[实施例46]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(85)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(85)，所述腈水合酶突变体如表31所示在(p)及(aq)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例19中记载的转化体(38)回收所得的质粒(38)为模板，使用序列表的序列号：33及60中记载的引物，并在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(85)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(85)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例31中记载的质粒(38)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(85)及成为其基础的转化体(38)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(85)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(38)表现出1.33倍的反应初速度的提高、及2.52倍的热稳定性的提高。
(表31)
[参考例37]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(86)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(86)，所述腈水合酶突变体如表32所示在(ad)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例61中记载的质粒为模板，利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(86)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(86)。
[参考例38]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(87)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(87)，所述腈水合酶突变体如表32所示在(bg)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：55及56中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(87)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(87)。
(表32)
[实施例47]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(88)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(88)，所述腈水合酶突变体如表33所示在(j)及(ad)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例37中记载的转化体(86)回收所得的质粒(86)为模板，使用序列表的序列号：57及58中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(88)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(88)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例37中记载的质粒(86)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(88)及成为其基础的转化体(86)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(88)通过新增加β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val的突变，而相对于转化体(86)表现出1.29倍的反应初速度的提高、及1.62倍的热稳定性的提高。
[实施例48]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(89)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(89)，所述腈水合酶突变体如表33所示在(j)及(aj)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例27中记载的转化体(64)回收所得的质粒(64)为模板，使用序列表的序列号：57及58中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(89)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(89)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例27中记载的质粒(64)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(89)及成为其基础的转化体(64)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(89)通过新增加β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val的突变，而相对于转化体(64)表现出1.34倍的反应初速度的提高、及1.83倍的热稳定性的提高。
[实施例49]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(90)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(90)，所述腈水合酶突变体如表33所示在(j)及(bg)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例38中记载的转化体(87)回收所得的质粒(87)为模板，使用序列表的序列号：57及58中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(90)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(90)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例38中记载的质粒(87)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(90)及成为其基础的转化体(87)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(90)通过新增加β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val的突变，而相对于转化体(87)表现出1.25倍的反应初速度的提高、及1.46倍的热稳定性的提高。
(表33)
[实施例50]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(91)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(91)，所述腈水合酶突变体如表34所示在(k)及(ad)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例37中记载的转化体(86)回收所得的质粒(86)为模板，使用序列表的序列号：59及60中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(91)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(91)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例37中记载的质粒(86)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(91)及成为其基础的转化体(86)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(91)通过新增加β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(86)表现出1.44倍的反应初速度的提高、及1.42倍的热稳定性的提高。
[实施例51]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(92)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(92)，所述腈水合酶突变体如表34所示在(k)及(as)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例28中记载的转化体(65)回收所得的质粒(65)为模板，使用序列表的序列号：59及60中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(92)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(92)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例28中记载的质粒(65)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(92)及成为其基础的转化体(65)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(92)通过新增加β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(65)表现出1.48倍的反应初速度的提高、及1.39倍的热稳定性的提高。
[实施例52]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(93)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(93)，所述腈水合酶突变体如表34所示在(k)及(av)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例1中记载的转化体(2)回收所得的质粒(2)为模板，使用序列表的序列号：59及60中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(93)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(93)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例1中记载的质粒(2)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(93)及成为其基础的转化体(2)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(93)通过新增加β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(2)表现出1.36倍的反应初速度的提高、及1.52倍的热稳定性的提高。
(表34)
[参考例39]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(94)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(94)，所述腈水合酶突变体如表35所示在(bo)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：61及62中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(94)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(94)。
(表35)
[实施例53]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(95)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(95)，所述腈水合酶突变体如表36所示在(l)及(ag)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例35中记载的转化体(81)回收所得的质粒(81)为模板，使用序列表的序列号：43、46及57中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(95)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(95)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例35中记载的质粒(81)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(95)、及成为其基础的转化体(81)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(95)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn的突变，而相对于转化体(81)表现出1.53倍的反应初速度的提高、及1.76倍的热稳定性的提高。
[实施例54]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(96)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(96)，所述腈水合酶突变体如表36所示在(l)及(am)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例25中记载的转化体(56)回收所得的质粒(56)为模板，使用序列表的序列号：43、46及57中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(96)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(96)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例25中记载的质粒(56)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(96)及成为其基础的转化体(56)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(96)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn的突变，而相对于转化体(56)表现出1.49倍的反应初速度的提高、及1.69倍的热稳定性的提高。
[实施例55]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(97)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(97)，所述腈水合酶突变体如表36所示在(l)及(bo)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例39中记载的转化体(94)回收所得的质粒(94)为模板，使用序列表的序列号：43、46及57中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(97)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(97)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例39中记载的质粒(94)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(97)及成为其基础的转化体(94)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(97)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、α亚单位的第27位的Met被取代为Ile及β亚单位的第110位的Glu被取代为Asn的突变，而相对于转化体(94)表现出1.37倍的反应初速度的提高、及1.83倍的热稳定性的提高。
(表36)
[参考例40]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(98)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(98)，所述腈水合酶突变体如表37所示在(ab)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例59中记载的质粒为模板，利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(98)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(98)。
(表37)
[实施例56]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(99)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(99)，所述腈水合酶突变体如表38所示在(r)及(ab)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例40中记载的转化体(98)回收所得的质粒(98)为模板，使用序列表的序列号：43、59及38中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(99)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(99)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例40中记载的质粒(98)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(99)及成为其基础的转化体(98)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(99)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(98)表现出1.85倍的反应初速度的提高、及1.36倍的热稳定性的提高。
[实施例57]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(100)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(100)，所述腈水合酶突变体如表38所示在(r)及(ai)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例36中记载的转化体(82)回收所得的质粒(82)为模板，使用序列表的序列号：43、59及38中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(100)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(100)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例36中记载的质粒(82)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(100)及成为其基础的转化体(82)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(100)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(82)表现出1.72倍的反应初速度的提高、及1.42倍的热稳定性的提高。
[实施例58]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(101)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(101)，所述腈水合酶突变体如表38所示在(r)及(bh)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例3中记载的转化体(4)回收所得的质粒(4)为模板，使用序列表的序列号：43、59及38中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(101)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(101)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例3中记载的质粒(4)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(101)及成为其基础的转化体(4)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(101)通过新增加α亚单位的第13位的Ile被取代为Leu、β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(4)表现出1.65倍的反应初速度的提高、及1.29倍的热稳定性的提高。
(表38)
[参考例41]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(102)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(102)，所述腈水合酶突变体如表39所示在(ac)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以专利文献2的实施例60中记载的质粒为模板并利用实施例1中记载的方法改变核糖体结合序列来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(102)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(102)。
(表39)
[实施例59]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(103)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(103)，所述腈水合酶突变体如表40所示在(s)及(ab)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例40中记载的转化体(98)回收所得的质粒(98)为模板，使用序列表的序列号：16、29及59中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(103)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(103)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例40中记载的质粒(98)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(103)及成为其基础的转化体(98)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(103)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu的突变，而相对于转化体(98)表现出2.50倍的反应初速度的提高、及1.57倍的热稳定性的提高。
[实施例60]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(104)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(104)，所述腈水合酶突变体如表40所示在(s)及(ah)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例18中记载的转化体(37)回收所得的质粒(37)为模板，使用序列表的序列号：16、29及59中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(104)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(104)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例18中记载的质粒(37)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(104)及成为其基础的转化体(37)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(104)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu的突变，而相对于转化体(37)表现出1.82倍的反应初速度的提高、及1.41倍的热稳定性的提高。
[实施例61]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(105)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(105)，所述腈水合酶突变体如表40所示在(s)及(ac)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例41中记载的转化体(102)回收所得的质粒(102)为模板，使用序列表的序列号：16、29及59中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(105)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(105)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例41中记载的质粒(102)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第4位的Val被取代为Met、及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(105)及成为其基础的转化体(102)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(105)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第4位的Val被取代为Met及β亚单位的第206位的Pro被取代为Leu的突变，而相对于转化体(102)表现出1.67倍的反应初速度的提高、及1.61倍的热稳定性的提高。
(表40)
[参考例42]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(106)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(106)，所述腈水合酶突变体如表41所示在(az)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：65及53中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(106)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(106)。
(表41)
[实施例62]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(107)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(107)，所述腈水合酶突变体如表42所示在(t)及(ac)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例41中记载的转化体(102)回收所得的质粒(102)为模板，使用序列表的序列号：24、37及60中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(107)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(107)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例41中记载的质粒(102)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(107)及成为其基础的转化体(102)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(107)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(102)表现出2.11倍的反应初速度的提高、及1.88倍的热稳定性的提高。
[实施例63]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(108)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(108)，所述腈水合酶突变体如表42所示在(t)及(al)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例30中记载的转化体(70)回收所得的质粒(70)为模板，使用序列表的序列号：24、37、及60中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(108)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(108)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例30中记载的质粒(70)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(108)及成为其基础的转化体(70)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(108)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(70)表现出1.98倍的反应初速度的提高、及2.34倍的热稳定性的提高。
[实施例64]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(109)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(109)，所述腈水合酶突变体如表42所示在(t)及(az)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例42中记载的转化体(106)回收所得的质粒(106)为模板，使用序列表的序列号：24、37及60中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(109)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(109)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例43中记载的质粒(106)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(109)及成为其基础的转化体(106)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(109)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(106)表现出2.05倍的反应初速度的提高、及1.62倍的热稳定性的提高。
(表42)
[参考例43]保持有腈水合酶活性的氨基酸取代物的获得(110)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(110)，所述腈水合酶突变体如表43所示在(ba)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，进行上述参考例2中记载的使用诱变试剂盒的位点定向诱变。以实施例1中记载的改变了核糖体结合序列的腈水合酶表达质粒(1)为模板，使用序列表的序列号：66及67中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(110)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(110)。
(表43)
[实施例65]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(111)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(111)，所述腈水合酶突变体如表44所示在(u)及(aq)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例19中记载的转化体(38)回收所得的质粒(38)为模板，使用序列表的序列号：33及69中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(111)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(111)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例19中记载的质粒(38)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(111)及成为其基础的转化体(38)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(111)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu、及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val的突变，而相对于转化体(38)表现出1.46倍的反应初速度的提高、及1.43倍的热稳定性的提高。
[实施例66]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(112)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(112)，所述腈水合酶突变体如表44所示在(u)及(ap)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例5中记载的转化体(9)回收所得的质粒(9)为模板，使用序列表的序列号：33及69中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(112)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(112)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例5中记载的质粒(9)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(112)、及成为其基础的转化体(9)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(112)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val的突变，而相对于转化体(9)表现出1.42倍的反应初速度的提高、及1.66倍的热稳定性的提高。
[实施例67]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(113)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(113)，所述腈水合酶突变体如表44所示在(u)及(ba)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例43中记载的转化体(110)回收所得的质粒(110)为模板，使用序列表的序列号：33及69中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(113)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(113)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例43中记载的质粒(110)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(113)及成为其基础的转化体(110)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(113)通过新增加β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val的突变，而相对于转化体(110)表现出1.39倍的反应初速度的提高、及1.38倍的热稳定性的提高。
(表44)
[实施例68]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(114)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(114)，所述腈水合酶突变体如表45所示在(v)及(al)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例30中记载的转化体(70)回收所得的质粒(70)为模板，使用序列表的序列号：16、38及70中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(114)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此制备转化体(114)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例30中记载的质粒(70)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第24位的Val被取代为Ile及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(114)及成为其基础的转化体(70)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(114)通过新增加α亚单位的第92位的Asp被取代为Glu、β亚单位的第24位的Val被取代为Ile及β亚单位的第226位的Val被取代为Ile的突变，而相对于转化体(70)表现出2.43倍的反应初速度的提高、及1.63倍的热稳定性的提高。
(表45)
[实施例69]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(115)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(115)，所述腈水合酶突变体如表46所示在(w)及(al)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例30中记载的转化体(70)回收所得的质粒(70)为模板，使用序列表的序列号：24、37、60及70中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，来制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(115)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(115)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例30中记载的质粒(70)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第24位的Val被取代为Ile、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(115)及成为其基础的转化体(70)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(115)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第24位的Val被取代为Ile、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(70)表现出2.23倍的反应初速度的提高、及2.51倍的热稳定性的提高。
[实施例70]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(116)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(116)，所述腈水合酶突变体如表46所示在(w)及(az)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例42中记载的转化体(106)回收所得的质粒(106)为模板，使用序列表的序列号：24、37、60及70中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(116)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(116)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例42中记载的质粒(106)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第24位的Val被取代为Ile、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(116)及成为其基础的转化体(106)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(116)通过新增加α亚单位的第197位的Gly被取代为Cys、β亚单位的第24位的Val被取代为Ile、β亚单位的第107位的Pro被取代为Met及β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu的突变，而相对于转化体(106)表现出2.35倍的反应初速度的提高、及1.87倍的热稳定性的提高。
(表46)
[实施例71]腈水合酶活性及热稳定性得以提高的氨基酸取代物的获得(117)
为了获得表达腈水合酶突变体的转化体(117)，所述腈水合酶突变体如表47所示在(x)及(aq)的氨基酸取代位置使腈水合酶发生突变，以从上述参考例19中记载的转化体(38)回收所得的质粒(38)为模板，使用序列表的序列号：33、69及70中记载的引物，在每个突变位点反复进行参考例2中记载的方法，由此制备对上述腈水合酶突变体进行编码的质粒(117)。利用该质粒转化大肠杆菌HB101的感受态细胞(东洋纺织公司制)，由此得到转化体(117)。另外利用碱性SDS提取法由上述菌体来制备质粒，利用DNA序列分析仪确定腈水合酶基因部分的碱基序列，确认了在参考例19中记载的质粒(38)中具有新增加有突变的符合目的的序列，所述突变为β亚单位的第24位的Val被取代为Ile、β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val。利用与实施例1记载的方法相同的方法对使用通过如上方式得到的转化体(117)及成为其基础的转化体(38)制造酰胺化合物时的反应初速度、以及热稳定性进行比较。
结果，转化体(117)通过新增加β亚单位的第24位的Val被取代为Ile、β亚单位的第79位的His被取代为Asn、β亚单位的第230位的Ala被取代为Glu及β亚单位的第231位的Ala被取代为Val的突变，而相对于转化体(38)表现出1.73倍的反应初速度的提高、及1.50倍的热稳定性的提高。
(表47)