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1、(10)申请公布号 CN 102191303 A (43)申请公布日 2011.09.21 CN 102191303 A *CN102191303A* (21)申请号 201010560378.9 (22)申请日 2010.11.26 C12P 21/02(2006.01) (71)申请人 扬子江药业集团北京海燕药业有限 公司 地址 102206 北京市昌平区中关村生命科学 园科学院路 16 号北京海燕药业生药所 (72)发明人 丁宇 岳妙姝 杨子义 干玉 李光伟 (54) 发明名称 基因重组 T1 的表达和制备方法 (57) 摘要 本发明是关于基因重组 T1 的表达和制备 新方法， 各个步骤。
2、经过优化后， 简捷高效， 选用对 环境和人员无害的原材料， 便于操作和规模放大。 优化后的方法流程如下 ： (1) 用密码子优化后的 碱基序列， 构建大肠杆菌高效表达工程菌株 ； (2) 工程菌的发酵表达采用 IPTG 诱导法诱导表达融 合蛋白 ； (3)目的多肽的分离采用Ni金属螯合、 蛋 白酶切、 Capto Q 和 S100 纯化 ； (4) 纯化获得的多 肽经过理化、 活性分析鉴定， 与设计的一致。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 6 页 CN 102191306 A1/1 页。
3、 2 1. 采用经密码子优化的序列构建工程菌， 经过发酵表达、 纯化， 获得高纯度的目的多 肽 ； 多肽经理化活性分析鉴定， 与设计的一致。 2. 如权利要求 1 所述， 目的多肽的碱基序列如文中所述 ； 3. 如权利要求 1 所述， 目的多肽的纯化经金属螯合捕获融合蛋白肠激酶酶切。酶切 后的混合蛋白采用 Capto Q 和 S100 获得高纯度目的蛋白。 权 利 要 求 书 CN 102191303 A CN 102191306 A1/4 页 3 基因重组 T1 的表达和制备方法 技术领域 ： 0001 本发明是关于基因重组 T1 的制备工艺， 重点是经密码子优化后的工程菌构建、 发酵表达与。
4、纯化的工艺。 技术背景 ： 0002 慢性乙型病毒性肝炎 (Chronic Viral Hepatitis B， CH-B) 是一种严重危害人类 健康的常见病， 慢性乙肝的防治是一个全球性公共卫生问题， 已引起世界各国的关注。 我国 乙型肝炎病毒 (HBV) 感染率高达 57.63， 目前有现症慢性乙肝患者 2000 多万人， 每年有 23.7 万人死于乙型肝炎相关的疾病。T1 是一种生物反应调节因子， 主要是 T 淋巴细胞的 免疫增强剂， 对NK及LAK等免疫细胞也有协同作用。 此外它能促进免疫细胞释放IL-2和合 成IL-2等免疫分子。 目前在临床上T1广泛应用于慢性乙型肝炎(HBV)、 。
5、丙型肝炎(HCV)、 肝细胞癌及增强免疫疾病的联合治疗。 0003 T1 在体内半衰期长， 每周只需注射 2 次， 同时停药后仍有较长时间的治疗作用 ； 并且具有极高的安全性， 自 1997 年 T1 在中国上市后， 数以万计病者使用过本品， 约少于 0.5病者出现过敏性皮疹， 及偶尔在注射部位疼痛的报告。 0004 T1 多肽的制备方法有动物组织提取法、 化学合成法和基因重组法。目前用化学 合成法的比较多， 已上市的日达仙即为化学合成的， 但是合成仪器昂贵、 成本较高， 过程涉 及有害化学物质。基因重组法易于规模放大， 对环境影响小， 制备成本低。 0005 研究内容 ： 0006 本发明提。
6、供的 T1 生产方法， 采用基因重组工程菌表达蛋白， 制备工艺步骤简捷 高效， 所用材料低毒， 易于规模放大。 0007 研究内容包括表达工程菌的构建、 工程菌发酵表达、 目的蛋白的纯化工艺和活性 理化性质分析鉴定。 0008 1. 工程菌的构建 ： 0009 内容包括根据密码子偏爱性设计序列、 合成全基因序列、 酶切连接转导， 构建了以 大肠杆菌 BL21(DE3) 为宿主菌、 以 pET32a(+) 为表达载体的 T1 融合表达系统。T1 的氨 基酸序列， 按照大肠杆菌密码子偏爱性， 确定基因序列如下 ： 0010 5 -AGCGATGCGGCGGTGGATACCAGCAGCGAAATTA。
7、CCACCAAAGATCTGAAAGAAAAAAAAGAAGT GGTGGAAGAAGCGGAAAAC-3 0011 基因序列由北京三博远志生物技术有限公司合成。pET32a(+) 克隆载体购自 Invitrogen 公司， E.coli BL21(DE3) 宿主菌购自 Invitrogen 公司。工程菌构建完成后， 经 表达质粒酶切鉴定、 目的片段 DNA 测序鉴定， 结果表明工程菌构建正确。 0012 2. 工程菌发酵表达 0013 确立了工程菌株后， 通过对种子培养基、 接种浓度、 发酵培养基、 发酵过程参数的 摸索， 确定工艺步骤如下 ： 0014 (1) ： 将冻存种子按 1 100。
8、 接种于含 100 微克 / 毫升氨苄青霉素的 LB 培养基， 在 说 明 书 CN 102191303 A CN 102191306 A2/4 页 4 37、 180rpm 下摇瓶培养约 8-10 小时， 为一级种子液 ； 0015 (2) ： 将一级种子液按适当比例接种于含适量抗生素的 LB 培养基， 在 37、 200rpm 下摇瓶培养约 10-16 小时， OD600 2.0 3.0 时为二级种子 ； 菌体此时处于对数生长期初 期， 生长旺盛， 更容易适应新的生长环境 ； 0016 (3) ： 二级种子液接种比例为 1 10 接种入发酵起始培养基 ； 发酵过程培养温度 控制在37， 氨。
9、水调节pH至7.000.2， 溶氧率通过搅拌速度和通气量维持在30以上， 用 20的泡敌溶液做消泡剂， 根据发酵过程各培养阶段工程菌生长补料。 0017 在 M9 发酵培养基加葡萄糖培养工程菌生长达 OD6008.0 10.0 密度时， 一次性加 入 IPTG 开始诱导， 开始 IPTG 诱导。诱导培养要保证适合浓度的碳源和氮源， 维持溶氧率在 20以上， 诱导表达 3.5 小时终止发酵离心收菌。此种方式， 适合于中试及以上规模， 诱导 培养时间容易掌握。 0018 3. 目的蛋白的纯化工艺 0019 研究内容包括融合蛋白的捕获、 肠激酶酶切融合蛋白、 酶切混合物的纯化。 本发明 提供的纯化工。
10、艺是亲和层析、 阴离子交换层析和凝胶过滤层析相组合的方法。该工艺简化 了流程， 节省时间、 试剂耗材， 易于放大。 0020 具体步骤如下 ： 0021 (1) ： Ni-Sepharose 6FF 亲和层析法捕获带 His-S-Trx 标签的 T1 融合蛋白 ； 0022 (2) ： 适宜浓度的肠激酶酶切融合蛋白， 得到标签蛋白与目的多肽的混合液 ； 0023 (3) ： Capto Q 纯化， 得到较高纯度的目的多肽 ； 0024 (4) ： S100 纯化， 得到高纯度的目的多肽， 其中流动相可以换为制剂缓冲液。 0025 4. 活性理化性质分析鉴定 0026 经 SDS-PAGE 电泳。
11、、 HPLC、 质谱、 相应的细胞活性检测分析鉴定， 获得的目的多肽与 设计的完全一致。 具体实施方式 ： 0027 实施例一 0028 IPTG 诱导液补料发酵培养 0029 (1) ： 将冻存种子按1100接种于含100g/mL氨苄青霉素(Amp)的20mL/瓶LB 培养基 1 瓶， 在 37、 180rpm 下摇瓶培养约 10 小时， 为一级种子液 ； 0030 (2) ： 将一级种子液按 1 100 接种于含 100g/mLAmp 的 200mL/ 瓶 LB 培养基 5 瓶， 在 37、 200rpm 下摇瓶培养约 12 小时， 为二级种子 ； 0031 (3) ： 二级种子液接种比例。
12、为 1 10 接种入 9L 基础培养基 ( 培养基成分 g/L ： glucose 3-5， tryptone 10， yeast extract 5， KH2P04 3， Na2HP0412H2017.1， NH4C11.0， MgSO47H200.72， NaCI 0.5) 的发酵罐 ； 温度控制在 37， 氨水调节 pH 至 7.00.2， 初始 搅拌速度为 300rpm， 通过逐步增加搅拌速度和通气量维持溶氧量在 30以上。 0032 约 2 2.5h 后， OD600上升至 2.5-3.0， 一次性补加 300mL 碳源和氮源 (glucose 200g/L ： yeast extr。
13、act 200g/L ： tryptone 200g/L 为 2 1 2) ； 当 OD600上升为 6.0-7.0 时一次性补加 300mL 碳源和氮源 (glucose 200g/L ： yeast extract 200g/L ： tryptone 200g/L 为 1 1 2)。当 OD600上升为 8-10 时， 添加 IPTG 至终浓度 0.5mM 开始诱导， 诱导 说 明 书 CN 102191303 A CN 102191306 A3/4 页 5 3.5h 后收菌。经离心后称重共获得湿菌 350 克。 0033 取诱导3h、 3.5h的菌体， 相同浓度超声破碎， 取上清。 经1。
14、5SDS-PAGE胶检验， 分 子量约为 20KD， 目的蛋白表达量约为 15 20， 见图 2。 0034 实施例二 0035 目的多肽的纯化 0036 菌体处理 ： 取100g湿菌， 溶于1.0L Tris缓冲液(50mM Tris， 300mM NaCl， 30mM咪 唑 ) 中， 超声破碎， 4， 9000rpm 离心 30min， 取上清， 0.45m 滤膜过滤。 0037 (1) ： 选用含 100mL Ni Sepharose 6FF 柱料的柱子， 经平衡 (30mM 咪唑 )、 上样 (30mM 咪唑 )、 清洗 (60mM 咪唑 )、 洗脱 (100 150mM 咪唑 )， 。
15、收集 T1 融合蛋白 ； 0038 (2) ： 将 Ni 柱洗脱用 G25 换液至酶切缓冲液 (50mMTris， 50mMNaCl)， 加入合适浓度 的肠激酶， 25 37 度酶切 12 24h ； 0039 (3) ： 选用含 5mL Capto Q 柱料的柱子， 以 50mM HAc-NaAc， PH5.0， 电导 6.0mS/cm 为 流动相 A， 以 50mM HAc-NaAc， 500mM NaCl， PH5.0 为流动相 B ； 流速 1.5mL/min， 线性梯度 洗脱， 收集各组分 ； 0040 (4) ： 选用含 470mL S100 柱料的柱子， 以 50mM 碳酸氢铵为。
16、流动相 ； 上样 6mL， 流速 2.5mL/min， 收集各组分。 0041 经检测， 收集的目的多肽组分纯度为 98.1 ； 纯化制备过程见图 3、 4。 0042 在用S100时可将流动相换为制剂缓冲液。 T1多肽纯化过程的Tris-Tricine电 泳图见图 5、 6。 0043 实施例三 0044 部分性质分析鉴定 0045 (1) 纯度检测 ： 选用 C4 色谱柱 (100mm4.6mm)， 检测波长为 214nm， 柱温 30， 流 速 0.8mL/min ； 以 H2O(0.1 TFA) 为流动相 A， 以乙腈 (0.1 TFA) 为流动相 B ； 线性梯度洗 脱从 20 B 。
17、到 60 B。结果表明 ： 目的多肽纯度为 98.1。见图 7。 0046 (2) 分子量检测 ： 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF， ABI-4700 型)进行分子量测定， 结果表明 ： 所纯化多肽的分子量为3067.92， 与理论值基本一致 ； 见图 8。 0047 (3) 细胞体外活性检测 0048 取小试管 6 支， 其中 3 支各加 hanks 液 0.1ml 作对照管， 另 3 支各加供试品溶液 0.1ml 作测定管， 每管中各加 T 细胞悬液 0.2ml( 每 ml 含有 3*106 5*106 个 T 细胞 )， 37 度保温 1 小时后， 加入绵羊红血。
18、球悬液 0.2ml( 每 ml 含有 3*107 5*107 个红血球 )， 摇匀， 以每分钟 500 转离心 3 分钟， 放入 4 度冰箱过夜。 0049 次日取出， 弃去上清液， 每管中各加入固定液一滴， 轻轻摇匀， 静置 10 分钟， 加入 染色液 2 滴并摇匀， 静置 15 分钟后开始计数， 显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细 胞， 共数计数板16个大方格上所有的淋巴细胞的个数(不少于200个)， 统计其中的E玫瑰 花结形成的细胞(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)， 求得结合百分率， 取平均值， 即为 供试品管或对照管的平均值， 见图 9。 附图说明 ： 0050 图 1 ： 工。
19、程菌的质粒目的序列测序图 ； 说 明 书 CN 102191303 A CN 102191306 A4/4 页 6 0051 图 2 ： IPTG 诱导发酵培养过程， 融合蛋白表达图 ； 0052 各泳道是不同诱导时间的菌体裂解上清， 分别为 1 ： 收菌 ； 2 ： 诱导 3 小时 ； 3 ： 诱导 前 4 小时 ； 4 ： 诱导前 3 小时 ； 5 ： 诱导前 2 小时 ； 6 ： 诱导前 1 小时 ； 7 ： 诱导前 0 小时。 0053 图 3 ： Capto Q 纯化过程， 在线检测图 0054 图 4 ： S100 纯化过程， 在线检测图 ； 0055 图 5 ： Capto Q 。
20、纯化过程的 Tris-Tricine 图 0056 各泳道分别为 1 ： 肠激酶酶切融合蛋白混合物 ； 2 ： 分部收集的第 7 管 ； 3 ： 分部收集 的第 9 管 ； 4 ： 分部收集的第 11 管 ； 5 ： 分部收集的第 13 管 ； 6 ： 分部收集的第 15 管 ； 7 ： 分部 收集的第 17 管 ； 8 ： 分部收集的第 20 管 ； 9 ： 分部收集的第 22 管 ； 0057 图 6 ： S100 纯化过程的 Tris-Tricine 图 0058 各泳道分别为 1 ： Capto Q 洗脱分部收集的第 7 管至第 13 管合并样品 ； 2 ： 分部收 集的第 5 管 ；。
21、 3 ： 分部收集的第 6 管 ； 4 ： 分部收集的第 7 管 ； 5 ： 分部收集的第 8 管 ； 6 ： 分部收 集的第 10 管 ； 7 ： 分部收集的第 11 管 ； 8 ： 分部收集的第 12 管 ； 9 ： 分部收集的第 14 管 ； 0059 图 7 ： 目的多肽的 HPLC 纯度分析图 0060 图 8 ： 目的多肽的质谱分析图 0061 图 9 ： 目的多肽的细胞活性检测分析表 0062 菌种保藏说明 0063 本菌种是根据密码子偏爱性设计序列、 合成全基因序列、 酶切连接转导， 构建了以 大肠杆菌 BL21(DE3) 为宿主菌、 以 pET32a(+) 为表达载体的 T1。
22、 融合表达系统。T1 的氨 基酸序列， 按照大肠杆菌密码子偏爱性确定， 基因序列如文中所述， 经检定结果表明工程菌 构建正确。本菌种构建简单， 易于实现， 无需保藏。 说 明 书 CN 102191303 A CN 102191306 A1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 102191303 A CN 102191306 A1/6 页 8 说 明 书 附 图 CN 102191303 A CN 102191306 A2/6 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102191303 A CN 102191306 A3/6 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102191303 A CN 102191306 A4/6 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102191303 A CN 102191306 A5/6 页 12 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102191303 A CN 102191306 A6/6 页 13 图 9 说 明 书 附 图 CN 102191303 A 。