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1、(10)授权公告号 CN 102181404 B (45)授权公告日 2013.01.02 CN 102181404 B *CN102181404B* (21)申请号 201110000978.4 (22)申请日 2011.01.05 C12N 7/01(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 孙永科 地址 650201 云南省昆明市盘龙区金黑公路 云南农业大学 (72)发明人 孙永科 杨玉艾 (74)专利代理机构 昆明正原专利商标代理有限 公司 53100 代理人 徐玲菊 孙永科 . 表达猪瘟病毒石门株 E0/E2 基因重 组腺病毒的构建及免疫效果研究 . 。
2、cnki- 中国博 士学位论文全文数据库 .2007,24-76 页 . 孙永科 . 表达猪瘟病毒石门株 E0/E2 基因重 组腺病毒的构建及免疫效果研究 . cnki- 中国博 士学位论文全文数据库 .2007,24-76 页 . Qiu， H.AY775178.1.GENE BANK .2004, zhou， p.AF058715.1.GENE BANK .1998, (54) 发明名称 一种表达猪瘟病毒 E0、 E2 基因的重组腺病毒 (57) 摘要 本发明提供一种表达猪瘟病毒 E0、 E2 基因的 重组腺病毒， 其特征在于在腺病毒的 CMV 启动子 下游多克隆位点的Bgl II和Kpn。
3、 I酶切位点中插 入猪瘟病毒 E0 基因， 在 Xho I 和 Xba I 酶切位点 中插入腺病毒 CMV 启动子和猪瘟病毒 E2 基因的 CMV-E2 片段。它解决了 E0、 E2 基因融合串联表达 产量低和保护效果弱的问题， 仅通过一次免疫接 种就能够使免疫后的猪获得对猪瘟病毒的抗体， 且生产成本是常规疫苗的一半， 本重组腺病毒们 属于非复制型病毒， 在猪体内不繁殖， 解决了弱毒 疫苗长期接种导致的病毒返祖， 毒力增强的现象。 本重组腺病毒仅含有猪瘟病毒的主要保护基因， 不含病毒的其它基因， 因此， 与野毒株之间不会发 生重组。 用本重组腺病毒制成的疫苗， 免疫猪后对 致死量 100 倍 。
4、TCID50的猪瘟病毒强毒攻击的保护 效果为 100。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黄蕊 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种表达猪瘟病毒 E0、 E2 基因的重组腺病毒的构建方法， 其特征在于包括下列构建 步骤 ： A.从市购的猪瘟病毒中分别扩增出E0和E2基因， 猪瘟病毒的E0基因在GenBank中的 登录号为 ： AF058715.1， 猪瘟病毒的 E2 基因在 GenBank 中的登录号为 ： AY775178.2 。
5、； B.将步骤A获得的猪瘟病毒E0基因通过Bgl II和Kpn I酶切位点插入至腺病毒穿梭 载体 pAdTrack 中， 形成腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0 ； C. 将步骤 A 获得的猪瘟病毒 E2 基因通过 Kpn I 和 Not I 酶切位点插入至腺病毒穿梭 载体 pAdTrack 中， 形成腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E2 ； D. 将步骤 C 的腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E2 按常规的 PCR 方法扩增出含有 CMV 启动子的 CMV-E2 基因， 通过 Xhol I 和 Xba I 酶切位点插入至步骤 B 的腺病毒穿 梭载体 pAdTrack-E0 中的 Xh。
6、ol I 和 Xba I 酶切位点中， 形成重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 ； E.将步骤D的重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-E0-CMV-E2经Pme I酶切线性化后， 转化 到含有腺病毒骨架载体 pAd-easy-1 的大肠杆菌 BJ5183 感受态细胞中， 形成重组腺病毒骨 架载体 pAd-easy-E0-CMV-E2 ； F.将重组腺病毒骨架载体pAd-easy-E0-CMV-E2经Pac I线性化后， 转染人胚胎肾细胞 HEK293 中， 包装出重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2。 权 利 要 求 书 CN 102181404 B 2 1/11 页 。
7、3 一种表达猪瘟病毒 E0、 E2 基因的重组腺病毒 技术领域 0001 本发明涉及一种重组腺病毒， 尤其是一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒 E0 基 因和 E2 基因的重组腺病毒， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 猪瘟是一种传染性非常强的传染病， 常给养猪业造成毁灭性损失。 目前， 免疫接种 仍是猪瘟防治的主要措施， 而且是根除猪瘟病和阻止野毒传向无猪瘟病猪群的必要手段。 猪瘟疫苗无论在过去、 现在还是将来， 对控制和消灭猪瘟病都具有极其重要的作用， 各国学 者对猪瘟疫苗的研制和开发一直没有放弃。传统的猪瘟疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗， 其中 灭活苗免疫效力低， 保护期短， 激发机体产生。
8、免疫力的速度慢， 到目前为止， 组织培养猪瘟 毒的产量以及灭活疫苗所造成的病毒有效抗原的损失， 仍是制造灭活疫苗的二大障碍 ； 猪 瘟弱毒疫苗的广泛应用， 对于控制猪瘟的流行起到了关键作用， 但是弱毒疫苗也存在下列 不足 ： 首先近年来猪瘟的流行特点发生了很大的变化， 呈现周期性、 波浪形的地区性散发和 温和性猪瘟病， 发病后的临床症状有无名高热、 症状不典型、 持续性感染、 出生仔猪先天性 震颤和母猪繁殖性障碍， 用传统疫苗免疫常常造成免疫失败， 即使将剂量增加到 750 个兔 体反应 ( 国家规定 150 个兔体反应 ) 也不能预防其感染， 而且有蔓延的趋势， 在妊娠早期接 种疫苗还会发生。
9、疫苗毒通过胎盘感染胎儿， 造成死胎或弱仔并成持续性带毒者， 产生新的 疫源 ； 其次， 弱毒疫苗已经沿用了近 40 年， 猪瘟的流行形式发生了很大变化， 说明猪瘟病毒 的抗原性可能存在着变异， 特别是近年来国内外应用单克隆抗体对 C- 株检测， 发现有不同 的反应模式， 表明经过多年在不同细胞上的驯化， C- 株已经产生变异， 这种流行毒株的变化 趋势国内外情况基本一致， 流行毒往往逃避免疫， 导致免疫失败的严重后果 ； 第三， 接种弱 毒疫苗还会影响到国际贸易， 欧盟已禁止使用猪瘟弱毒疫苗， 而采用严格的卫生防疫制度， 扑杀猪瘟感染猪和血清学阳性猪来控制和消灭猪瘟， 采用扑杀政策需要大量的人。
10、力、 物力 和巨额资金， 发展中国家是难以承受的， 这就促使人们研究和开发新型的猪瘟疫苗来防控 本病。 近年来， 基因工程技术的迅猛发展， 为新型猪瘟疫苗的研究和开发提供了工具， 目前， 猪瘟基因工程疫苗的研制已经成为新的研究方向和热点。 0003 人 -5 型腺病毒载体与其他动物病毒载体相比， 具有许多优点 ： 首先是安全， 腺病 毒毒性低， 基本不致病或只引起轻微的症状， 腺病毒重组后， 毒力进一步降低， 并且克服了 逆转录病毒载体因随机整合可能导致插入突变的潜在风险 ； 其次是宿主范围广， 腺病毒可 感染多种细胞包括分裂与非分裂细胞 ； 第三是稳定， 腺病毒粒子十分牢固， 不易突变， 并。
11、且 容易大量制备并纯化， 得到高滴度的病毒， 在体外可获得 1011pfu/mL ； 第四就是对于腺病毒 基因组的结构和功能目前研究得比较清楚， 基因操作方便 ； 第五是插入外源基因容量大， 在 基因治疗构建重组疫苗中大多采用缺失 E1 和 E3 区基因的腺病毒载体， 通常复制缺陷型腺 病毒可容纳约7kb8kb的外源基因， 比逆转录病毒和腺相关病毒的容量大很多 ； 还有就是 免疫途径简便， 腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖， 疫苗接种简便， 可口服或气雾吸入而不 需注射， 并且经口服后能产生局部黏膜免疫应答， 在免疫方法上比其它疫苗好， 容易推广使 说 明 书 CN 102181404 B 3 。
12、2/11 页 4 用。 0004 非复制型腺病毒不仅更安全有效， 而且以低剂量的方式产生抗原蛋白而不裂解 细胞， 故表达抗原的时间更持久， 有利于激发长期的免疫反应。目前， 已经有多种产品已 经上市， 例如 ：“安柯瑞重组人 5 型腺病毒注射液” ；“重组人 - 干扰素腺病毒注射液 (E10B)” ；“今又生 ( 重组人 p53 腺病毒注射液 )” ；“人禽流感重组腺病毒疫苗临床前安全评 价方法的研究” 取得阶段性成果 ；“重组腺病毒 - 胸苷激酶基因制剂” ； 另外 “猪繁殖与呼吸 综合征重组腺病毒和疫苗” 已经被南京农业大学申请专利。 发明内容 0005 为解决猪瘟弱毒疫苗长期接种导致的病。
13、毒返祖、 毒力增强的现象和弱毒疫苗株与 野毒发生重组等问题， 以及猪瘟病毒 E0、 E2 基因融合串联表达存在的产量低和保护效果弱 的问题， 本发明提供一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒 E0、 E2 基因的重组腺病毒。 0006 本发明提供的是这样一种表达猪瘟病毒 E0、 E2 基因的重组腺病毒， 其特征在于在 腺病毒的 CMV 启动子下游多克隆位点的 Bgl II 和 KpnI 酶切位点中插入猪瘟病毒 E0 基因， 在 Xho I 和 XbaI 酶切位点中插入腺病毒 CMV 启动子和猪瘟病毒 E2 基因的 CMV-E2 片段。 0007 所述猪瘟病毒为常规的市购病毒， 猪瘟病毒的 E0 基因。
14、在 GenBank 中的登录号为 ： AF058715.1， 猪瘟病毒的 E2 基因在 GenBank 中的登录号为 ： AY775178.2 0008 所述腺病毒为常规的市购人 -5 型非复制型腺病毒。 0009 所述在腺病毒中同时分别表达猪瘟病毒 E0、 E2 基因的重组腺病毒， 包括下列构建 步骤 ： 0010 A. 从市购的猪瘟病毒和猪瘟病毒中分别扩增出 E0 和 E2 基因 ； 0011 B.将步骤A获得的猪瘟病毒E0基因通过BglII和KpnI酶切位点插入至腺病毒穿 梭载体 pAdTrack 中， 形成腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0 ； 0012 C. 将步骤 A 获得的猪。
15、瘟病毒 E2 基因通过 Kpn I 和 Not I 酶切位点插入至腺病毒 穿梭载体 pAdTrack 中， 形成腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E2 ； 0013 D. 将步骤 C 的腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E2 按常规的 PCR 方法扩增出含 有 CMV 启动子的 CMV-E2 基因， 通过 Xhol I 和 Xba I 酶切位点插入至步骤 B 的腺病毒 穿梭载体 pAdTrack-E0 中的 Xhol I 和 Xba I 酶切位点中， 形成重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 ； 0014 E. 将步骤 D 的重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CM。
16、V-E2 经 PmeI 酶切线性化后， 转化到含有腺病毒骨架载体 pAd-easy-1 的大肠杆菌 BJ5183 感受态细胞中， 形成重组腺病 毒骨架载体 pAd-easy-E0-CMV-E2 ； 0015 F. 将重组腺病毒骨架载体 pAd-easy-E0-CMV-E2 经 PacI 线性化后， 转染人胚胎肾 细胞 HEK293 中， 包装出重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2。 0016 本发明具有下列优点和效果 ： 0017 采用上述方案获得的重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2， 能在同一腺病毒中分别表达猪 瘟病毒 E0 蛋白和猪瘟病毒 E2 蛋白， 解决了 E0、 E2 基因融合。
17、串联表达产量低和保护效果弱 的问题， 本发明仅通过一次免疫接种就能够使免疫后的猪获得对猪瘟病毒的抗体， 对猪瘟 具有较强的抵抗能力， 生产成本是常规疫苗的一半， 大大降低了疫苗成本。 本发明提供的重 说 明 书 CN 102181404 B 4 3/11 页 5 组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 属于非复制型病毒， 在猪体内不繁殖， 解决了弱毒疫苗长期接种 导致的病毒返祖， 毒力增强的现象。本发明提供的重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 仅含有猪瘟 病毒的主要保护基因， 不含病毒的其它基因， 因此， 本发明提供的重组腺病毒与野毒株之间 不会发生重组。采用上述方案构建获得的重组腺病毒制成。
18、的疫苗， 免疫猪后对致死量 100 倍 TCID50的猪瘟病毒强毒攻击的保护效果为 100。既解决了猪瘟疫苗和猪瘟野毒同源重 组后毒力返强的问题， 也解决了弱毒疫苗生产成本高的问题。 附图说明 0018 图 1 为 ELISA 检测的猪瘟病毒抗体的水平。 具体实施方式 ： 0019 下面结合实施例对本发明做进一步说明。 0020 实施例 0021 A. 猪瘟病毒 E0 基因和 E2 基因的扩增 0022 (1)PCR 扩增引物的设计 0023 在猪瘟病毒 E0 基因的上、 下游引物中分别加入 Bgl II 和 Kpn I 限制性内切酶酶 切位点， 所述猪瘟病毒 E0 基因的上、 下游引物分别设。
19、计为 ： 0024 上游引物 P1 ： 5 -AAAAGATCTATGGAAAATATAACTCAATGG-3 0025 下游引物 P2 ： 5 -CACGGTACCGTAAGGCGATAGGGCATAG-3 0026 在猪瘟病毒 E2 基因的上、 下游引物中分别加入 Kpn I 和 NotI 和限制性内切酶酶 切位点， 所述猪瘟病毒 E2 基因的上、 下游引物分别设计为 ： 0027 上游引物 P1 ： 5 -AAAGGTACCATGAGGGGACAGATCGTGC-3 0028 下游引物 P2 ： 5 -CCC GCGCCCGCACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3 0029 (2)。
20、 猪瘟病毒 E0 基因片段的体外扩增及扩增产物的回收与纯化 0030 将含有猪瘟病毒E0基因的pMD18-T-E0质粒用双蒸水稀释100倍， 取1L为模板， 用猪瘟病毒 E0 基因的引物扩增编码 E0 蛋白的目的片段， 其中 PCR 反应体系如下 ： 0031 模板 1L 0032 10PCR 缓冲液 5L 0033 2.5mmol/L dNTP 5L 0034 E0 基因上游引物 (50mol/L)2L 0035 E0 基因下游引物 (50mol/L)2L 0036 Ex Taq DNA 聚合酶 (5U/L) 1L 0037 灭菌去离子水 34L 0038 反应总体系为 50L 0039 P。
21、CR 反应条件 ： 95预变性 5min ； 94 1min， 54 1min， 72 1min， 共 35 个循环 ； 最后 72延伸 10min， 4储存 ； 将 PCR 产物置于 8g/L 琼脂糖凝胶， 于 60V 电泳 20min 后切 取目的条带大小的片段， 回收猪瘟病毒 E0 基因的扩增产物 ； 0040 (3) 猪瘟病毒 E2 基因片段的体外扩增及扩增产物的回收与纯化 0041 将含有猪瘟病毒E2基因的pMD18-T-E2质粒用双蒸水稀释100倍， 取1L为模板， 说 明 书 CN 102181404 B 5 4/11 页 6 用猪瘟病毒 E2 基因的引物扩增编码 E2 蛋白的目。
22、的片段， 其中 PCR 反应体系如下 ： 0042 模板 1L 0043 10PCR 缓冲液 5L 0044 2.5mmol/L dNTP 5L 0045 E2 基因上游引物 (50mol/L) 2L 0046 E2 基因下游引物 (50mol/L) 2L 0047 Ex Taq DNA 聚合酶 (5U/L) 1L 0048 灭菌去离子水 34L 0049 反应总体系为 50L 0050 PCR 反应条件 ： 95预变性 5min ； 94 1min， 54 1min， 72 1min 30sec， 共 35 个 循环 ； 最后 72延伸 10min， 4储存 ； 将 PCR 产物置于 8g/。
23、L 琼脂糖凝胶， 于 60V 电泳 20min 后切取目的条带大小的片段， 回收猪瘟病毒 E2 基因的扩增产物 ； 0051 B. 腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0 的构建 0052 (1) 猪瘟病毒 E0 基因的 PCR 扩增产物的 Bgl II 和 Kpn I 双酶切 0053 向 1.5mL Eppendorf 管中依次加入 ： 0054 E0 基因 PCR 产物 15L 0055 10Buffer 5L 0056 Bgl II 3L 0057 Kpn I 3L 0058 H2O 24L 0059 总体积为 50Ml， 充分混匀后瞬时离心 0060 以 37水浴 6h 后， 用 8。
24、g/L 琼脂糖凝胶电泳， 切下含目的条带的凝胶回收 ； 0061 (2) 穿梭载体 pAdTrack-CMV 的 Bgl II 和 Kpn I 双酶切 0062 向 1.5mL Eppendorf 管中依次加入 ： 0063 pAdTrack-CMV 质粒 10L 0064 10Buffer 6L 0065 Bgl II 3L 0066 Kpn I 3L 0067 H2O 38L 0068 总体积为 60L， 充分混匀后， 瞬时离心 0069 以 37水浴 6h 后， 用 8g/L 琼脂糖凝胶电泳， 切下含目的条带的凝胶回收 ； 0070 (3) 猪瘟病毒 E0 基因与穿梭质粒载体 pAdTr。
25、ack-CMV 的连接 0071 连接反应体系 ： 0072 E0 基因片段 4L 0073 pAdTrack-CMV 2L 0074 10Buffer 1L 0075 T4DNA 连接酶 1L 0076 H2O 3L 0077 总体积为 10L， 充分混匀后瞬时离心 说 明 书 CN 102181404 B 6 5/11 页 7 0078 16水浴连接过夜 ； 0079 (4) 猪瘟病毒 E0 基因和 pAdTrack-CMV 载体连接产物的转化和鉴定 0080 DH5 感受态细胞的制备 0081 将-70甘油保种的DH5接种于不含抗生素的LB琼脂培养基上， 37培养过夜， 挑取长势良好的单。
26、菌落， 接种于 3mL 新配置的不含抗生素的 LB 培养液中， 37 250r/min 振 荡培养过夜， 约 14h ； 取 100L 培养物， 按 1 100 比例接种于 100mL 新鲜 LB 培养液中， 300r/min 剧烈振荡培养约 3h， 至 OD600为 0.6 ； 无菌条件下转移细菌培养物至两个预冷的 50mL 离心管中， 冰浴 10min ； 4下 1600r/min 离心 10min， 弃上清， 倒置离心管沥干液体， 加 入预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10mL， 悬浮菌体沉淀， 置冰浴放置30min ； 4下1100r/min离 心 10min， 弃上清， 用 2。
27、mL 0.1mol/L 预冷的 CaCl2( 含 150mL/L 甘油 ) 重悬菌体， 然后分装于 预冷的灭菌 Eppendorf 管中， 每管 100L， 置 -70冰箱保存备用 ； 0082 重组质粒转化感受态细胞 0083 取一管感受态细胞置于冰水混合物上， 待完全融化后， 将 10L 的连接产物加入 管中， 轻轻混匀 ； 冰浴30min ； 42水浴中热激90s ； 冰浴3min ； 加入800L LB培养基， 37 下 200 250r/min 振荡培养 1h ； 8000r/min 离心 1min， 弃部分上清， 存留 100L 左右的上 清重悬沉淀 ； 取 100L 混合物均匀涂。
28、布于含卡那霉素 (50g/mL) 的 LB 琼脂平板上， 待完 全吹干后， 37培养过夜 (12 16h) ； 挑取单菌落于 3mL 含 50g/mL 卡那霉素的 LB 液体 培养基中， 37培养过夜 ； 碱裂解法提取质粒后进行酶切、 PCR 和测序鉴定 ； 0084 将猪瘟病毒 E0 基因插入至穿梭载体 pAdTrack-CMV 中构建的重组质粒命名为 ： 腺 病毒穿梭载体 pAdTrack-E0 ； 0085 C. 腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E2 的构建及 CMV-E2 片段的获得 0086 (1) 猪瘟病毒 E2 基因 PCR 扩增产物的 Kpn I 和 Not I 双酶切 00。
29、87 向 1.5mL Eppendorf 管中依次加入 ： 0088 E2 基因 PCR 产物 15L 0089 10Buffer 5L 0090 Kpn I 3L 0091 Not I 3L 0092 H2O 24L 0093 总体积为 50L， 充分混匀后瞬时离心 0094 以 37水浴 6h 后， 用 8g/L 琼脂糖凝胶电泳， 切下含目的条带的凝胶回收 ； 0095 (2) 穿梭载体 pAdTrack-CMV 的 Kpn I 和 Not I 双酶切 0096 向 1.5mL Eppendorf 管中依次加入 ： 0097 pAdTrack-CMV 质粒 10L 0098 10Buffe。
30、r 6L 0099 Kpn I 3L 0100 Not I 3L 0101 H2O 38L 0102 总体积为 60L， 充分混匀后瞬时离心 0103 以 37水浴 6h 后， 用 8g/L 琼脂糖凝胶电泳， 切下含目的条带的凝胶回收 ； 说 明 书 CN 102181404 B 7 6/11 页 8 0104 (3) 猪瘟病毒 E2 基因与穿梭质粒载体 pAdTrack-CMV 的连接 0105 连接反应体系 ： 0106 E2 基因片段 4L 0107 pAdTrack-CMV 2L 0108 10Buffer 1L 0109 T4DNA 连接酶 1L 0110 H2O 3L 0111 总。
31、体积为 10L， 充分混匀后瞬时离心 0112 16水浴连接过夜 ； 0113 (4) 猪瘟病毒 E2 基因和 pAdTrack-CMV 载体连接产物的转化和鉴定 0114 DH5 感受态细胞的制备 0115 同步骤 B 的 (4) ； 0116 重组质粒转化感受态细胞 0117 同步骤 B 的 (4) ； 0118 将猪瘟病毒 E2 基因插入至穿梭载体 pAdTrack-CMV 中构建的重组质粒命名为为 ： 腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E2 ； 0119 (5)CMV-E2 基因的获得 0120 根据 pAdTrack-E2 载体中 CMV 启动子的序列设计扩增 CMV-E2 基因的引。
32、物 ： 0121 上游引物 P1 ： 5 -AAACTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCAAT-3 0122 下游引物 P2 ： 5 -CACTCTAGAACCAGCGGCGAGTTGTTCTG-3 0123 在CMV-E2基因的上、 下游引物中分别加入Xho I、 XbaI和限制性内切酶酶切位点， 并在下游引物中引入终止密码子 ； 0124 D. 重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 的构建 0125 (1)CMV-E2 基因 PCR 产物的 Xho I 和 Xba I 双酶切 0126 向 1.5mL Eppendorf 管中依次加入 ： 0127 CMV-E。
33、2 片段 PCR 产物 15L 0128 10Buffer 5L 0129 Xho I 3L 0130 Xba I 3L 0131 H2O 24L 0132 总体积为 50L， 充分混匀后瞬时离心 0133 以 37水浴 6h 后， 用 8g/L 琼脂糖凝胶电泳， 切下含目的条带的凝胶回收 ； 0134 (2) 穿梭载体 pAdTrack-E0 的 Xho I 和 Xba I 双酶切 0135 向 1.5mL Eppendorf 管中依次加入 ： 0136 pAdTrack-E0 质粒 10L 0137 10Buffer 6L 0138 Xho I 3L 0139 Xba I 3L 0140 。
34、H2O 38L 说 明 书 CN 102181404 B 8 7/11 页 9 0141 总体积为 60L， 充分混匀后瞬时离心 0142 以 37水浴 6h 后， 用 8g/L 琼脂糖凝胶电泳， 切下含目的条带的凝胶回收 ； 0143 (3)CMV-E2 基因与穿梭质粒载体 pAdTrack-E0 的连接 0144 连接反应体系 ： 0145 CMV-E2 基因片段 4L 0146 pAdTrack-E0 2L 0147 10Buffer 1L 0148 T4DNA 连接酶 1L 0149 H2O 3L 0150 总体积为 10L， 充分混匀后瞬时离心 0151 16水浴连接过夜 ； 015。
35、2 (4)CMV-E2 片段和 pAdTrack-E0 载体连接产物的转化和鉴定 0153 DH5 感受态细胞的制备 0154 同步骤 B 的 (4) ； 0155 重组质粒转化感受态细胞 0156 同步骤 B 的 (4) ； 0157 将CMV-E2片段插入至穿梭载体pAdTrack-E0中构建的重组质粒命名为 ： 重组腺病 毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 ； 0158 E. 重组腺病毒骨架载体 pAdEasy-E0-CMV-E2 的构建 0159 (1) 重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 的线性化 0160 用 PmeI 对穿梭载体 pAdTrac。
36、k-E0-CMV-E2 酶切线性化， 按如下所示分别加入各组 分 ： 0161 pAdTrack-E0-CMV-E2 25L 0162 PmeI 4L 0163 0.1g/L BSA 10L 0164 10Buffer 4 10L 0165 H2O 51L 0166 总体积为 100L 0167 置 37水浴中 6h 后经琼脂糖凝胶电泳回收 ； 0168 (2) 线性化的重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 转化到含有腺病毒骨架 载体 pAdEasy-1 的大肠杆菌 BJ5183 感受态细胞 0169 同步骤 B 的 (4) ； 0170 将重组后的腺病毒骨架载体命名为 ：。
37、 重组腺病毒骨架载体 pAdEasy-E0-CMV-E2 ； 0171 F. 重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 的获得 0172 (1) 重组腺病毒骨架载体 pAdEasy-E0-CMV-E2 的线性化、 回收和纯化 0173 用 PacI 酶切使重组腺病毒骨架载体 pAdEasy-E0-CMV-E2 线性化， 酶切反应体系 为 ： 0174 pAdeasy-E0-CMV-E2 25L 0175 Pac I 5L 说 明 书 CN 102181404 B 9 8/11 页 10 0176 0.1g/L BSA 10L 0177 10Buffer 4 10L 0178 H2O 50L 01。
38、79 总体积为 100L， 置 37水浴中 8h。 0180 在酶切后的产物中， 加入 2.5 体积的无水乙醇和 1/10 体积的 3mol/L NaAc， -20 沉淀 1h， 在 4以 12000r/min 离心 15min， 弃去上清， 加入 70乙醇洗一次， 自然干燥后， 加 入 20L H2O 溶解 DNA ； 0181 (2) 重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 的获得 0182 将线性化的重组腺病毒骨架载体 pAdEasy-E0-CMV-E2 转染至人胚胎肾细胞 HEK 293 细胞中， 具体操作按 LipofectamineTM2000 产品说明书进行 ； 收获的病毒液命名。
39、为重组 腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 ； 0183 (3) 重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 的扩增及滴度测定 0184 按照噬斑法测定 rAd-E0-CMV-E2 在 293 细胞中传至 15 代时的病毒滴度。 0185 本发明获得的重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 经过下列试验 ： 0186 1.rAd-E0-CMV-E2 免疫保护性试验 0187 (1) 实验动物分组 0188 将 25 头猪随机分为 5 组， 第一组为 rAd-E0-CMV-E2 免疫组， 5 头。第二组为猪瘟 脾淋苗免疫组， 5 头。第三组为融合表达 E0-E2 基因的重组腺病毒 rAd-E0-E2。
40、 免疫组， 5 头。 第四组为非重组腺病毒免疫组， 5 头。第五组为空白对照组， 5 头。 0189 (2) 免疫和攻毒 0190 重组腺病毒组和非重组腺病毒组的免疫剂量均为2.4109pfu(定量至2mL)， 于颈 部肌肉和腹部皮下多点注射 ； 猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫方法和剂量按照疫苗实际使用剂量 进行免疫 ； 空白对照用培养重组腺病毒的 DMEM 培养液免疫， 2mL/ 头。所有试验猪在免疫后 的 20d 时用 100 倍 TCID50猪瘟强毒肌肉注射、 点眼、 滴鼻和口服攻击。 0191 (3) 体温检测和临床观察 0192 所有试验猪从攻毒的第 1 天开始测量体温， 以后每天测量体温，。
41、 观察临床症状。 0193 (4) 血清抗体的检测 0194 从免疫开始和免疫后的每个星期采集血液， 收集血清， 用于猪瘟抗体的检测， 另一 份加入抗凝剂， 用于血液中猪瘟病毒的检测。 0195 (5) 攻毒后血液中病毒存在的检测 0196 攻毒后隔天采集抗凝全血， 用 RT-PCR 方法检测血液中的猪瘟病毒。 0197 (6) 病理观察 0198 在攻毒后的 14 天， 当所有存活猪的临床症状基本消失后， 全部处死并进行剖检， 观察下颌淋巴结、 肠系膜淋巴结、 腹股沟浅淋巴结、 肾脏、 脾脏、 膀胱以及心脏是否有病理变 化。 0199 2. 结果 0200 (1) 体温和临床症状 0201 。
42、第一组 (rAd-E0-CMV-E2 免疫组 ) 在免疫后没有出现任何临床症状， 在攻毒后第 4 天， 5 头免疫猪中 1 头猪体温达 40以上， 持续 48h 左右， 第 7 天时左右体温恢复正常。致 说 明 书 CN 102181404 B 10 9/11 页 11 死保护率为 100。 0202 第二组(猪瘟脾淋苗免疫组)在攻毒后的第4天， 5头免疫猪中1头猪体温达40 以上， 持续 72h 左右， 食欲稍微下降， 在第 8 天体温和食欲恢复正常。致死保护率为 100。 0203 第三组 ( 融合表达 E0-E2 基因的重组腺病毒 rAd-E0-E2 免疫组 ) 在免疫后没有出 现任何临。
43、床症状， 在攻毒后第 4 天， 5 头免疫猪中 2 头猪体温达 40以上， 持续 72h 左右， 第 8 天时左右体温恢复正常。致死保护率为 100。 0204 第四组 ( 非重组腺病毒免疫组 ) 和第五组 ( 空白对照组 ) 的所有试验猪在攻毒后 第 1 2 天体温升至 40以上， 病猪便秘 ； 第 3 天食欲减退， 精神沉郁， 有些病猪发生呕吐， 很少采食， 仅少量饮水， 精神高度沉郁， 四肢软弱无力， 行动缓慢， 摇摆不稳， 普遍拉稀， 两眼 无神， 有多量黏液脓性分泌物， 腹下、 耳和四肢内侧有出血点 ； 第 4 天病猪伏卧不起， 全身震 颤， 四肢呈游泳状划动， 体温一直稽留在 41。
44、左右。第 5 天开始陆续死亡， 至第 7 天全部死 亡， 死前体温下降。死亡率为 100。 0205 体温及死亡情况见表 1。 0206 (2) 抗猪瘟病毒和抗猪瘟病毒抗体的检测 0207 用中国兽药监察所提供的猪瘟 ELISA 抗体检测试剂盒对所有试验猪的抗体水 平进行检测。rAd-E0-CMV-E2 免疫组的抗体呈上升趋势， 在攻毒前抗体 OD630值分别达到 0.696， 攻毒后所有试验组的抗体水平都呈明显的上升趋势。rAd-E0-E2 免疫组的抗体水平 也呈上升趋势， 但在攻毒前抗体 OD630值分别达到 0.595。猪瘟兔化弱毒苗免疫组的抗体水 平在攻毒前的OD630最高值为0.71。
45、3。 非重组腺病毒对照组和空白对照组在攻毒前一直没有 检测到抗体水平， 但是在攻毒后临死前能检测到猪瘟抗体水平。图 1。 0208 表 1 不同疫苗免疫组 CSFV 强毒攻击后体温情况 0209 0210 表 2 攻毒后血液中猪瘟病毒的检测 0211 说 明 书 CN 102181404 B 11 10/11 页 12 0212 (3) 攻毒后血液中猪瘟病毒和猪瘟病毒的检测 0213 攻 毒 后 隔 天 采 集 的 抗 凝 血， 用 RT-PCR 方 法 检 测 猪 瘟 病 毒， 结 果 发 现 rAd-E0-CMV-E2 免疫组中有 1/5 头能检测出猪瘟病毒。rAd-E0-E2 免疫组中有。
46、 2/5 头能检 测出猪瘟病毒。猪瘟脾淋苗免疫组也有 1/5 能检测出猪瘟病毒， 而非重组腺病毒对照和空 白对照都 100检出， 结果见表 2。 0214 (4) 攻毒后组织脏器的病理观察 0215 非重组腺病毒和空白对照组死亡猪的剖检结果显示， 猪下颌淋巴结、 肠系膜淋巴 结、 腹股沟淋巴结， 肾脏、 脾脏、 膀胱以及心脏均有明显的出血现象。 0216 rAd-E0-CMV-E2 免疫组、 rAd-E0-E2 免疫组和常规疫苗免疫组所有存活猪的剖检 结果表明， 尽管临床症状已经消失， 但是某些脏器还存在一些病理变化。rAd-E0-CMV-E2 免 疫组 5 头存活猪中， 1/5 头下颌淋巴结。
47、、 肠系膜淋巴结出血。rAd-E0-E2 免疫组 5 头存活猪 中， 2/5 头肠系膜淋巴结和肾脏出血， 1/5 头下颌淋巴结出血。猪瘟脾淋苗免疫组 5 头存活 猪中， 1/5 头下颌淋巴结， 1/5 头肾脏出血。 0217 (5) 讨论 0218 本 发 明 采 用 ELISA 方 法 检 测 了 免 疫 猪 的 体 液 免 疫 水 平。 重 组 腺 病 毒 rAd-E0-CMV-E2、 rAd-E0-E2 和常规疫苗免疫猪后都能诱导机体产生特异性体液免疫应 答， 这表明重组腺病毒接种猪体后， 在宿主细胞内所表达的蛋白具有较好的免疫原性。 常规疫苗接种猪体后诱导的抗体水平和重组腺病毒 rAd。
48、-E0-CMV-E2 诱导的抗体水平无 差异， 但要高于重组腺病毒 rAd-E0-E2 诱导的抗体水平， 这可能是因为尽管重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2和rAd-E0-E2都表达E0和E2蛋白， 但是重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2表达的 E0 和 E2 蛋白是带有各自的启动子启动， E0 和 E2 蛋白是两个独立的蛋白， 这和猪瘟病毒本 身在动物体内复制和繁殖时的途径一样， 而重组腺病毒 rAd-E0-E2 表达的 E0 和 E2 蛋白不 是各自独立的蛋白， 而是一种融合蛋白， 两者在体内形成的空间折叠可能导致有些抗原位 点被包埋， 不能有效刺激机体产生抗体反应。 0219 当用。
49、致死量的强毒攻击时， 尽管重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2、 重组腺病毒 rAd-E0-E2 免疫组和常规疫苗免疫组都提供了 100的致死保护率， 但是在攻毒后重组腺 病毒 rAd-E0-CMV-E2 和常规疫苗免疫动物的临床症状要轻于重组腺病毒 rAd-E0-E2 免疫 的动物， 重组腺病毒 rAd-E0-CMV-E2 和常规疫苗有 1/5 头出现临床症状， 而重组腺病毒 说 明 书 CN 102181404 B 12 11/11 页 13 rAd-E0-E2 有 2/5 头出现临床症状。非重组腺病毒免疫组和空白对照组全部死亡。 0220 从攻毒后的血毒检测来看， rAd-E0-CMV-E2 免疫组和常规疫苗免疫组之间没有差 。