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1、(10)申请公布号 CN 102226199 A (43)申请公布日 2011.10.26 CN 102226199 A *CN102226199A* (21)申请号 201110109950.4 (22)申请日 2011.04.29 C12N 15/85(2006.01) (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城 路 3 号 (72)发明人 靳亚平 胡林勇 王爱华 张涌 李倩 陈华涛 (54) 发明名称 用于生产外源蛋白的山羊 - 乳球蛋白基因 座打靶载体构建方法 (57) 摘要 本发明公开了一种用于生产外源蛋白的山羊 - 乳球蛋白基因座打靶载体构建方。
2、法， 以山羊 - 乳球蛋白基因 5 端调控序列 BLG5 作为 5 端 同源臂， 以山羊 - 乳球蛋白基因 3 端包含第 6、 第 7 外显子及下游的序列 BLG3 作为 3 端同源臂， 以第 5 外显子和第 5 内含子的部分序列 E5 作为 连接序列用以将正筛选标记基因置于第 5 内含子 中 ； 将 BLG5、 目的基因及 E5 顺次连接， 再和 BLG3 分别连接到通用型打靶载体中正筛选标记两侧。 在需要时可以将目标蛋白的基因组DNA或cDNA序 列插入到该通用打靶载体的目的基因位置处或直 接置换掉原来的目的基因， 然后用所获得的打靶 载体转染山羊胎儿成纤维细胞或其他细胞， 筛选 出中靶的。
3、细胞， 通过体细胞核移植技术获得能在 乳腺中生产目标蛋白的转基因山羊。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 17 页 附图 2 页 CN 102226206 A1/1 页 2 1. 用于生产外源蛋白的山羊 - 乳球蛋白基因座打靶载体构建方法， 其特征在于， 以 山羊 - 乳球蛋白基因 5 端调控序列 BLG5 作为 5 端同源臂， 以山羊 - 乳球蛋白基因 3 端包含第 6、 第 7 外显子及下游的序列 BLG3 作为 3 端同源臂， 以第 5 外显子和第 5 内含子 的部分序列 E5 作为连接序列用以。
4、将正筛选标记基因置于第 5 内含子中 ； 将 BLG5、 目的基因 及 E5 顺次连接， 再和 BLG3 分别连接到通用型打靶载体中正筛选标记两侧。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述目的基因可以是包含起始密码子和 终止密码子的基因组 DNA、 cDNA 或其他人工合成拼接的 DNA 片段。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述正筛选标记可以是新霉素、 潮霉素、 嘌呤霉素、 绿色荧光蛋白中的一种或几种。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 还在正筛选标记基因两侧分别引入一段 同向的 loxp 序列。 5. 根据权利要求 1 所述的方法，。
5、 其特征在于， 还在其中一个或两个同源臂的外侧引入 负筛选标记基因。 权 利 要 求 书 CN 102226199 A CN 102226206 A1/5 页 3 用于生产外源蛋白的山羊 - 乳球蛋白基因座打靶载体构 建方法 技术领域 0001 本发明涉及一类通过同源重组将外源目的基因定向整合到山羊 - 乳球蛋白基 因座的基因打靶载体构建方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 转基因技术能够在基因水平对家畜的基因组进行遗传修饰， 从而迅速改变家畜的 性状。例如 ： 整合有生长激素基因的转基因猪在生长发育和饲料利用率等方面得到了明显 地改善， 而转溶葡萄球菌酶基因的山羊对乳腺炎的抗性也明。
6、显得到增强。1987 年， Gorden 等成功将人组织纤维酶原激活剂表达于小鼠乳腺中， 建立了第一例基于小鼠的乳腺生物反 应器。 由于乳汁产量大、 对动物自身没有损伤， 且外源蛋白易于分离纯化而使得乳腺生物反 应器得到了人们的重视。2006 年， 第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的重组人抗 凝血酶 III(ATryn) 获准上市更是激发了人们的研究热情。 0003 然而， 到目前为止所得到的转基因家畜大都是采用随机整合的方式， 即目的基因 在转基因动物基因组中的整合位点和拷贝数都是随机的。 这就造成了目的基因在转基因动 物中的表达水平不均一， 有高有低， 甚至由于受到位置效应的影响而无。
7、法表达。另外， 由于 人们对相关基因的调控序列研究尚不完全清楚， 为了尽可能的包含到这些调控序列往往采 用足够长的基因片段来作为调控序列， 这无形中又增加了操作的难度， 同时插入的外源基 因片段还可能会影响基因组中相邻基因的表达， 存在诱发癌症等的风险。 0004 而基于同源重组的基因打靶技术可以实现对基因组的定向修饰， 不仅能够很好的 解决上述问题， 同时也能够更加充分的利用靶位点的内源性调控序列， 实现目标蛋白更加 高效的表达。 0005 目前， 基因打靶技术在小鼠上的研究应用比较成熟， 在研究基因和 或蛋白功能、 构建人类疾病的动物模型等方面发挥了重要作用。然而， 家畜中尚没有胚胎干细胞。
8、可供使 用， 制约了基因打靶技术在家畜中的研究应用。1996 年， 克隆羊 “多莉” 的降生为研究基 因打靶家畜开辟了另一条途径 ： 首先用打靶载体转染家畜体细胞， 筛选得到打靶阳性细胞 后通过体细胞核移植技术生产基因打靶的胚胎， 再借助胚胎移植技术将基因打靶胚胎移植 至代孕母畜子宫中进而获得基因打靶家畜。2000 年， McGreath 等借助于该技术成功将人 1- 抗胰蛋白酶基因 (AAT) 定位整合于绵羊的原胶原基因座， 获得了高表达 AAT 的基因打 靶绵羊。随后， 敲除 -1， 3- 半乳糖苷转移酶用以为人类提供移植器官的猪、 敲除朊蛋白基 因(Prp)以抵御疯牛病的奶牛、 敲除囊性。
9、纤维化跨膜通道调节因子(CFTR)以用以研究人囊 性纤化的模型猪、 缺失免疫球蛋白重链和轻链用以生产人源化抗体的猪和牛等相继诞生， 为构建乳腺生物反应器生产药用蛋白、 生产器官移植动物、 培育高产、 抗病家畜新品种 品 系奠定了基础。 0006 - 乳球蛋白是山羊乳中主要的乳清蛋白， 在乳汁中的分泌量可达 2.3g/L。截至 目前， 尚未见到通过基因打靶的方式应用其内源性调控序列指导外源目的蛋白表达的报 说 明 书 CN 102226199 A CN 102226206 A2/5 页 4 道。作为基因打靶的载体， 应该具有良好的筛选标记、 方便筛选阳性克隆、 无毒副作用并方 便后续操作。现有的。
10、阳性细胞富集策略以启动子缺失的方法最为有效， 在家畜中对 -1， 3- 半乳糖苷转移酶、 朊蛋白等基因位点的敲除研究即是采用启动子缺失的方法来富集阳性 细胞。 然而构建乳腺生物反应器所需的乳蛋白启动子在目前通常使用的打靶细胞胎儿 成纤维中并不表达， 这就限制了启动子缺失富集策略的应用， 这时以正负筛选方法来构建 打靶载体便成为首选。 相较而言， 正负筛选的富集策略对基因是否转录没有要求， 适用范围 更加广泛。 有研究表明， 载体中的筛选基因会影响其整合位点邻近基因的正常表达， 而且出 于动物福利的考虑也需要在后续的研究中将筛选基因等附属基因结构剔除。目前， 通常采 用 Cre/loxp 系统和。
11、 FLP/FTR 系统来达到将筛选标记基因剔除的目的。 发明内容 0007 本发明的目的在于， 构建一种能够充分利用山羊 - 乳球蛋白基因内源性调控序 列的基因打靶载体， 将外源性目的定位置于这些调控序列调控之下， 从而使目的基因得到 更加高效地表达。为构建乳腺生物反应器和抗乳腺炎等奠定基础。 0008 为了实现上述目标， 本发明采取了以下方案 ： 0009 以山羊 - 乳球蛋白基因 5 端调控序列 (BLG5) 作为 5 端同源臂， 以山羊 - 乳 球蛋白基因 3 端包含第 6、 第 7 外显子及下游的序列 (BLG3) 作为 3 端同源臂， 以第 5 外显 子和第 5 内含子的部分序列 (。
12、E5) 作为连接序列用以将正筛选标记基因置于第 5 内含子中。 0010 将 BLG5、 目的基因及 E5 顺次连接， 再和 BLG3 分别连接到通用型打靶载体 ( 如 ploxpII) 中正筛选标记两侧。 0011 目的基因可以是包含起始密码子和终止密码子的基因组 DNA、 cDNA 或其他人工合 成拼接的 DNA 片段。 0012 正筛选标记可以是新霉素 (Neo)、 潮霉素 (Hyg)、 嘌呤霉素 (puro)、 绿色荧光蛋白 (GFP) 中的一种或几种。 0013 为了方便在后续工作中剔除正筛选标记， 可以在正筛选标记基因两侧分别引入一 段同向的 loxp 序列。 0014 为了增加阳。
13、性克隆的富集率， 可以在其中一个或两个同源臂的外侧引入负筛选标 记基因， 如胸苷激本酶 (tk) 或白喉毒素 (DT) 基因。 0015 通过构建同源重组将外源目的基因定向整合到山羊 - 乳球蛋白基因座的基因 打靶载体， 以借助山羊乳腺生产外源目的蛋白或培育高产、 抗病奶山羊新品种。 将本方法构 建得到的载体转染山羊胎儿成纤维细胞或其他山羊细胞， 筛选出中靶细胞， 用于核移植生 产转基因动物， 使获得的山羊能在乳腺中表达外源蛋白或具有高产、 抗病特性。 0016 在需要时可以将目标蛋白的基因组 DNA 或 cDNA 序列插入到该通用打靶载体的目 的基因位置处或直接置换掉原来的目的基因， 然后用。
14、所获得的打靶载体转染山羊胎儿成纤 维细胞或其他细胞， 筛选出中靶的细胞， 通过体细胞核移植技术获得能在乳腺中生产目标 蛋白的转基因山羊。 附图说明 0017 图 1 打靶载体示意图 ； 说 明 书 CN 102226199 A CN 102226206 A3/5 页 5 0018 图 2 打靶载体构建流程示意图 ； 图中 pB5T 为将 BLG5 连接到 pMD18 T simple 载体 中的得到的载体， pAEKS 是将 ALA 和 E5 连接到 pBluescript KS(-) 中得到的载体， pB3T 为 将 BLG3 连接到 pMD18 T simple 中所得到的载体。ploxp。
15、II 为一个通用型打靶载体。 0019 图 3 打靶载体的酶切鉴定图 ； 1. 为 SmaI 单切产物 2. 为 EcoRI 单切产物 3. 为 BamHI 单切产物 4. 为 1kb ladder Marker ； 0020 图4打靶载体中loxp序列生物活性鉴定图 ； pBAT-C为将pBAT转化组成性表达Cre 酶的 BM25.8 菌株后所提取到的质粒。1&2.XhoI 和 SalI 分别双酶切 pBAT-C 和 pBAT 的酶切 产物 3&4.pBAT 和 pBAT-C 的 PCR 产物 M1&M2 为 DNA Marker。 具体实施方式 0021 以下结合具体实施例， 对本发明进行。
16、详细说明。 0022 1 使用的试剂、 质粒与菌株 0023 本发明实施过程中使用了下列试剂及质粒菌株 ： PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶、 T4DNA 连接酶、 限制性内切酶、 pMD18 T-simple 载体及 DH5 菌株均为 Takara 公司产品， 琼脂糖凝胶胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒为 Tiangen 公司产品， PCR 引物由上海捷瑞公司 合成， 序列测定由南京金斯瑞公司完成。BM25.8 菌株为 Novagen 公司产品， pBluescript KS(-) 购自 Stratagene 公司。 0024 2 设计和使用的引物 0025 表 1 引物序列及 P。
17、CR 反应相关参数 0026 0027 说 明 书 CN 102226199 A CN 102226206 A4/5 页 6 0028 注 ： 下划线标注的为添加的酶切位点。 0029 3 同源序列的获得 0030 以山羊血液基因组为模板， 分别以 BLG5F/R， BLG3F/R 为引物， 应用 Takara 公司 PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶进行 PCR 扩增， 反应体系参照该聚合酶说明书配制。反应循环 参数为 95预变性 5min ； 98变性 10sec ； 各个 PCR 反应的退火温度如表 1 所示 ； 退火时 间均为 15sec ； 72延伸温度参照表 1 相关数据。
18、设置。反应循环次数均为 30 次。将 PCR 反 应得到的 BLG5( 见 SEQ ID NO ： 1)， BLG3( 见 SEQ ID NO ： 4) 两个片段分别进行胶回收， 并将 BLG5 和 BLG3 分别连接到 pMD18-T simple。选择阳性克隆经酶切鉴定及测序鉴定为阳性者 标记为 pB5T 和 pB3T。为了将目的基因插入到第五内含子内， 同样方法获得 E5( 见 SEQ ID NO ： 3)。 0031 4 目的基因的获得 0032 以人血液基因组为模板， 以 ALAF/R 为引物， 应用 Takara 公司 PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。
19、。PCR 扩增的循环参数设置参照同源序列的扩增进行。将 PCR 反应得 到的ALA(见SEQ ID NO ： 2)进行胶回收， 将琼脂糖凝胶回收目的片段并连接到pbluescript KS(-) 中， 酶切和测序鉴定为阳性者标记为 pAKS。 0033 5 打靶载体的构建 0034 首先将 E5 连接到 pAKS 中， 得到 pAEKS。然后将亚克隆得到的 BLG5 连接到 pAEKS 中， 得到 pBAEKS。最后依次将 BLG3 和 BLG5-ALA-E5 连接到通用打靶载体中正筛选标记两 侧， 例如 ploxpII， 得到最终的打靶载体 pBAT。构建流程见图 2。 0035 上述目的基。
20、因可以是其他包含起始密码子和终止密码子的基因组 DNA、 cDNA 或其 他人工合成拼接的 DNA 片段。 0036 正筛选标记可以是新霉素 (Neo)、 潮霉素 (Hyg)、 嘌呤霉素 (puro)、 绿色荧光蛋白 (GFP) 中的一种或几种。 0037 为了方便在后续工作中剔除正筛选标记， 可以在正筛选标记基因两侧分别引入一 段同向的 loxp 序列。 0038 为了增加阳性克隆的富集率， 可以在其中一个或两个同源臂的外侧引入负筛选标 记基因， 如胸苷激本酶 (tk) 或白喉毒素 (DT) 基因。 说 明 书 CN 102226199 A CN 102226206 A5/5 页 7 003。
21、9 在得到 pBAT 后， 分别选择 EcoRI， SmaI 和 BamHI 对其进行单酶切鉴定。结果见图 3， 图中第 1， 2， 3 泳道所示分别为 pBAT 经 SmaI， EcoRI 和 BamHI 三个限制性内切酶单酶切所 得产物经琼脂糖凝胶电泳后的图像。M 所示为 1kb ladder Marker 的电泳图谱。结果与理 论值相符。 0040 用上述酶切鉴定正确的质粒 pBAT 转染组成性表达 Cre 酶的 BM25.8 菌株， 提取质 粒 ( 标记为 pBAT-C) 进行 XhoI 和 SalI 双酶切以鉴定 pBAT 中 loxp 序列的生物活性。同时， 根据打靶载体中的正筛选。
22、基因即 neo 基因的序列设计引物 ( 见表 1)， 以质粒 pBAT-C 为模 板， pBAT 为阳性对照进行 PCR 扩增及琼脂糖电泳， 进一步验证 loxp 序列活性。结果见图 4， 第 1 泳道所示为 XhoI 和 SalI 双酶切 pBAT-C 所得产物的电泳图， 在 2kb 附近无可见条带。 第 2 泳道为 XhoI 和 SalI 双酶切 pBAT 所得产物的电泳图， 在 2kb 处有一明亮条带， 应为 neo 基因的条带。第 3， 4 泳道分别为以 pBAT 和 pBAT-C 模板， neoF/R 和 E5F/R 为引物进行的多 重 PCR 扩增产物电泳图， 图 4 中在 0.4。
23、kb 处无可见条带， 表明夹在 loxp 序列中间的 neo 基 因被切除。 0041 应当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 CN 102226199 A CN 102226206 A1/17 页 8 0001 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A2/17 页 9 0002 0003 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A3/17 页 10 0004 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 。
24、A4/17 页 11 0005 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A5/17 页 12 0006 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A6/17 页 13 0007 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A7/17 页 14 0008 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A8/17 页 15 0009 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A9/17 页 16 0010 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 。
25、A10/17 页 17 0011 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A11/17 页 18 0012 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A12/17 页 19 0013 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A13/17 页 20 0014 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A14/17 页 21 0015 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A15/17 页 22 0016 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A16/17 页 23 0017 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A17/17 页 24 序 列 表 CN 102226199 A CN 102226206 A1/2 页 25 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102226199 A CN 102226206 A2/2 页 26 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102226199 A 。