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1、(10)申请公布号 CN 102220246 A (43)申请公布日 2011.10.19 CN 102220246 A *CN102220246A* (21)申请号 201110128890.0 (22)申请日 2011.05.18 CGMCC NO.4063 2010.08.18 C12N 1/14(2006.01) A01N 63/04(2006.01) A01P 21/00(2006.01) A01P 7/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 辽宁省农业科学院 地址 110161 辽宁省沈阳市东陵区东陵路 84 号 (72)发明人 陶承光 杨涛。
2、 肇莹 肖军 王娜 龚娜 陈珣 王红 贾东贝 杨镇 (74)专利代理机构 沈阳智龙专利事务所 ( 普通 合伙 ) 21115 代理人 宋铁军 (54) 发明名称 蓝莓菌根真菌 （晶粒鬼伞） 及其分离方法和用 途 (57) 摘要 本发明涉及蓝莓菌根真菌 （晶粒鬼伞）及其 分离方法和用途， 属于微生物技术领域， 主要是涉 及一株从长白山野生越橘属植物根系中分离获得 的用于接种蓝莓的菌根真菌及其在促进蓝莓生长 和提高产量方面的应用。该蓝莓菌根真菌已在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏， 分类命名为 ： 晶粒鬼伞 （Coprinusmicaceus） ， 通过对该真菌的应用， 可以促进。
3、蓝莓根系发育， 具 有提高产量及坐果率、 提高抗虫害作用等优点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 5 页 CN 102220255 A1/1 页 2 1. 一 种 蓝 莓 菌 根 真 菌， 其 特 征 在 于 ： 该 真 菌 分 类 命 名 ： 晶 粒 鬼 伞 （Coprinus micaceus） ， 在国家知识产权局指定的保藏单位保藏， 保藏日期 ： 2010 年 8 月 18 号， 保藏单 位名称 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 。
4、： CGMCC No.4063， 保藏 代号为 ： MF002。 2. 根据权利要求 1 所述的蓝莓菌根真菌， 其特征在于 ： 该真菌的扩增 DNA 序列如下 ： AGGGGGAATGGAATACCTATGGTGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCATTGTGCACGCCCGCCATTTT TATCTATCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATGACTCTCGTGCTCTCTGAGTGCGGATGCGAGGATTGCCCTT CAACTCGGAGGTGTCTCTCCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAAAAGCATGAT。
5、ATAGAATGTA GTCAATGGGCTTGATCGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCT TGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCCGTTTTCTGAACGGTTCTCCGAGG CTTGGATTGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCAGCGCGGTCCGCTCCCCTGAAAT。
6、GCATTAGCGAGTTCGTACTGAG CTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACAGGGTTTAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCAAGGACAATA CCTTTGTCAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。 3. 一种如权利要求 1 所述蓝莓菌根真菌的分离方法， 其特征在于 ： 从野生越橘属植物 的根际获得菌根真菌， 步骤如下 ： （1） 清洗 ： 取新鲜完整的健康野生蓝莓的根， 用自来水冲洗一小时， 然后用无菌水冲洗 2 4 次， 将根转移到灭过菌的玻璃平皿。
7、中待用 ； （2） 消毒 ： 将步骤 （1） 中待用的根放入体积分数 70% 的酒精溶液中灭菌 20 40s， 无菌 水冲洗3次， 然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒13min， 冲洗3次， 再立即放入质量百 分比为 1% 的无菌硫化钠水溶液中浸 1 3min， 无菌水冲洗 3 次， 无菌滤纸吸干待用 ； （3） 培养 ： 将步骤 （2） 消毒后待用的根切成 0.5 1cm 长的小段， 置于 PDA 培养基平板 上， 25 28下恒温倒置培养， 设 5 个重复培养皿， 每个培养皿接 3 个小段 ； （4） 纯化 ： 待菌丝生长 5 7 天后， 用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无 菌。
8、培养基上继续纯化培养， 直至每一个平板培养基中只含有单一菌落， 得到 4 个菌落 ； （5） 筛选优势菌株 ： 将步骤 （4） 中得到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根的蓝 莓苗， 观察蓝莓接菌后的生长， 将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来， 即为权利要求 1 所述的蓝莓菌根真菌。 4. 根据权利要求 3 所述的一种蓝莓菌根真菌的分离方法， 其特征在于 ： 步骤 （3） 中将 步骤 （2） 消毒后待用的根切成 0.8cm 长的小段， 置于 PDA 培养基平板上， 25下恒温倒置培 养。 5. 一种如权利要求 1 所述的蓝莓菌根真菌的用途， 其特征在于 ： 该蓝莓菌根真菌用于 促进蓝莓各个生。
9、长阶段的生长、 防虫害、 防冷害以及提高产量。 权 利 要 求 书 CN 102220246 A CN 102220255 A1/7 页 3 蓝莓菌根真菌 （晶粒鬼伞） 及其分离方法和用途 0001 一、 技术领域 ： 本发明属于微生物技术领域， 主要涉及一株从越橘属植物蓝莓根内分离获得的植物菌 根真菌及其分离方法及其在促进蓝莓各阶段生长、 防虫害和防冷害等方面的应用。 0002 二、 背景技术 ： 植物菌根菌是指植物根系与真菌所形成的互惠共生体即 “菌根” （mycorrhizas） ， 是一 种极为普遍的生命活动和生态现象。Frank 1885 年首次拟创了 “菌根” 这个术语， 之后若 。
10、干年一直处于平稳发展期， 直到20世纪50年代， 菌根学在现代分子生物学和生化技术的辅 助下进入迅猛共发展期， 尤其是近 30 年， 随着新方法、 新技术的不断建立， 研究内容更加广 泛， 菌根学研究已成为一项包括多种学科相互渗透的一门边缘生物科学。 0003 菌根菌的侵染能诱导植物根系形态发生明显变化， 影响菌根围各成员的相互作 用。Duckett 和 Read (1995) 研究发现Hymenoscyphus ericae分离物能促使假根根尖膨 大， 并在其细胞内形成菌丝团。菌根菌还可通过分泌 H+和一些酸性化合物， 直接影响到土 壤化学特性。 大量研究表明， 菌根真菌能显著促进植物对土壤。
11、中营养物质的吸收、 提高植物 抗病虫害的作用。 接种菌根真菌还可促进各类植物生长、 提高产量和品质， 并促进组培苗的 生长， 提高移栽成活率。 0004 蓝莓 （Semen Trigonellae） 又名越桔， 是杜鹃花科 （Ericaceae） 越橘属(Vaccinium spp.)植物， 为多年生落叶或常绿灌木， 果实为浆果。 在我国原产于高海拔的野生灌木， 在吉 林长白山分布于海拔 15002400 米的地区。其须根部缺少大部分植物所具有的根毛， 需借 助合适的菌根菌帮助其吸收水分、 矿物质营养等。蓝莓的栽培种类有三大类， 即高丛蓝莓、 矮丛蓝莓和兔眼蓝莓， 均于美国、 加拿大等地， 经。
12、过育种者的驯化， 其土壤习性中对于气流 的要求降低， 但对土壤酸性条件要求依然较高。 在缺乏菌根菌的条件下， 一般选择施用硫粉 调节土壤 pH 在 4 左右， 更适宜蓝莓生长。但硫粉的实施容易破坏土壤的微环境， 对土质造 成影响。 0005 通过对栽培区蓝莓菌根菌的调查， 在原产地种植的蓝莓菌根化率达到 80% 以上， 对生长情况进行调查， 菌根化的蓝莓生长好于未菌根化的蓝莓。 0006 本专利提及的菌根真菌晶粒鬼伞菌 （Coprinus micaceus） ， 能够侵染蓝莓根系， 并 促进植株生长， 此前还未见报道。 0007 三、 发明内容 ： 1、 发明目的 ： 本发明涉及一种蓝莓菌根真。
13、菌及其分离方法和用途， 其目的在于解决以往栽培蓝莓时 利用硫粉调节土壤 pH 时所带来的对土壤造成伤害的问题， 通过对该真菌的应用， 促进蓝莓 生长并提高产量。 0008 2、 技术方案 ： 本发明是通过以下技术方案来实现的 ： 一种蓝莓菌根真菌， 其特征在于 ： 该真菌分类命名 ： 晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） ， 在国家知识产权局指定的保藏单位保藏， 保藏日期 ： 2010 年 8 月 18 号， 保藏单位名称 ： 中 说 明 书 CN 102220246 A CN 102220255 A2/7 页 4 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 ： CGMC。
14、C No.4063， 保藏代号为 ： MF002。 0009 该真菌的扩增 DNA 序列如下， 该序列是蓝莓菌根真菌分类的分子依据 ： AGGGGGAATGGAATACCTATGGTGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCATTGTGCACGCCCGCCATTTT TATCTATCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATGACTCTCGTGCTCTCTGAGTGCGGATGCGAGGATTGCCCTT CAACTCGGAGGTGTCTCTCCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAAAAGCATGATATAGAATGTA GTC。
15、AATGGGCTTGATCGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCT TGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCCGTTTTCTGAACGGTTCTCCGAGG CTTGGATTGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCAGCGCGGTCCGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGTTC。
16、GTACTGAG CTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACAGGGTTTAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCAAGGACAATA CCTTTGTCAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA 一种如上所述蓝莓菌根真菌的分离方法， 其特征在于 ： 从野生越橘属植物的根际获得 菌根真菌， 步骤如下 ： （1） 清洗 ： 取新鲜完整的健康野生蓝莓的根， 用自来水冲洗一小时， 然后用无菌水冲洗 2 4 次， 将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。 0010 （2） 消毒 ： 将步骤 （。
17、1） 中待用的根放入体积分数 70% 的酒精溶液中灭菌 20 40s， 无菌水冲洗3次， 然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒13min， 冲洗3次， 再立即放入质 量百分比为 1% 的无菌硫化钠水溶液中浸 1 3min， 无菌水冲洗 3 次， 无菌滤纸吸干待用。 0011 （3） 培养 ： 将步骤 （2） 消毒后待用的根切成 0.51cm 长的小段， 置于 PDA 培养基平 板上， 25 28下恒温倒置培养， 设 5 个重复培养皿， 每个培养皿接 3 个小段。 0012 （4） 纯化 ： 待菌丝生长 5 7 天后， 用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新 的无菌培养基上继续纯化培养， 直至。
18、每一个平板培养基中只含有单一菌落， 得到4个菌落。 （5） 筛选优势菌株 ： 将步骤 （4） 中得到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根的蓝 莓苗， 观察蓝莓接菌后的生长， 将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来， 即为所述的蓝莓 菌根真菌。 0013 该菌株侵染蓝莓根部后， 在显微镜下观察， 是菌根共生结构， 可以确定其为蓝莓菌 根真菌。 0014 上述步骤 （3） 中将步骤 （2） 消毒后待用的根切成 0.8cm 长的小段， 置于 PDA 培养基 平板上， 25下恒温倒置培养效果较好。 0015 一种蓝莓菌根真菌的用途 ： 该蓝莓菌根真菌用于促进蓝莓各个生长阶段的生长、 防虫害、 防冷害以及。
19、提高产量。 0016 3、 优点及效果 ： 本发明涉及一株蓝莓菌根真菌， 该真菌对蓝莓组培阶段、 瓶外生根阶段和大田栽培阶 段的各品种蓝莓生长均有明显的促进作用。 接菌处理的蓝莓对叶甲和蚜虫等害虫具有明确 的诱导取食作用， 从而减轻害虫的危害 ； 还可以降低栽培蓝莓对土壤低 PH 值的要求， 可以 将 PH 从 4 左右提高到 6 左右， 且接种本发明菌根菌也可以将土壤 PH 值从 6 降到 5 甚至更 低 ； 而且该蓝莓菌根菌还可以提高蓝莓对低温的抗性， 在 6 10的条件下， 蓝莓仍可保持 生长状态， 而不会进入休眠。 总之， 本发明的这种菌株可以在蓝莓栽培、 防虫害、 防冷害等方 说 明。
20、 书 CN 102220246 A CN 102220255 A3/7 页 5 面得到广泛的应用。 0017 四、 附图说明 ： 图 1 为本发明蓝莓菌根真菌显微镜下菌丝体形态图 ； 图 2 为本发明蓝莓菌根真菌扩增 DNA 序列图 ； 图 3 为温度对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图 ； 图 4 为 pH 值对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图 ； 图 5 为碳源对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图 ； 图 6 为氮源对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图 ； 图 7 为本发明蓝莓菌根真菌对组培苗阶段生长量的影响图 ； 图 8 为本发明蓝莓菌根真菌对驯化阶段生长量的影响图 ； 图 9 为本发明蓝莓菌。
21、根真菌对蓝莓盆栽阶段生长量的影响图。 0018 专利菌种说明 ： 本专利所涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC） 保 藏， 单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 该真菌分类命名为 ： 晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） ， 保藏代号为 ： MF002， 保藏编号为 ： CGMCC No.4063， 保藏日期为 2010 年 8 月 18 日。 0019 五、 具体实施方式 ： 下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的说明， 本发明的保护范围不受实施 例的限制 ： 1、 蓝莓菌根真菌的筛选及其鉴定 ： （1） 、 筛选 蓝莓菌。
22、根真菌的分离方法， 其特征在于 ： 从野生越橘属植物的根际获得菌根真菌， 步骤 如下 ： （1） 清洗 ： 取新鲜完整的健康野生蓝莓的根， 用自来水冲洗一小时， 然后用无菌水冲洗 2 4 次， 将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。 0020 （2） 消毒 ： 将步骤 （1） 中待用的根放入体积分数 70% 的酒精溶液中灭菌 20 40s， 无菌水冲洗3次， 然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒13min， 冲洗3次， 再立即放入质 量百分比为 1% 的无菌硫化钠水溶液中浸 1 3min， 无菌水冲洗 3 次， 无菌滤纸吸干待用。 0021 （3） 培养 ： 将步骤 （2） 消毒后待用的根切成 0。
23、.51cm 长的小段， 置于 PDA 培养基平 板上， 25 28下恒温倒置培养， 设 5 个重复培养皿， 每个培养皿接 3 个小段。 0022 （4） 纯化 ： 待菌丝生长 5 7 天后， 用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新 的无菌培养基上继续纯化培养， 直至每一个平板培养基中只含有单一菌落， 得到 4 个菌落。 0023 （5） 筛选优势菌株 ： 将步骤 （4） 中得到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根 的蓝莓苗， 观察蓝莓接菌后的生长， 将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来， 即为所述蓝 莓菌根真菌， 晶粒鬼伞 CGMCC4063（MF002） 。 0024 上述菌落的直径约为 。
24、7.5cm 左右， 白色绒毛状 ； 显微镜下观察， 菌丝纤细， 偶有分 枝， 无隔， 菌丝宽 25 100m， 无分生孢子， 有大量菌丝断， 粗 长 ： 25m50m。 0025 该菌株侵染蓝莓根部后， 在显微镜下观察， 可以看到是菌根共生结构， 可确定其为 蓝莓菌根真菌。 说 明 书 CN 102220246 A CN 102220255 A4/7 页 6 0026 该蓝莓菌根真菌可用于促进蓝莓各个生长阶段的生长、 防虫害、 防冷害以及提高 产量等方面。 0027 （2） 、 菌株鉴定 晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 的鉴定 ： 在 PDA 板上， 28。
25、培养 7 天后， 菌落的直径为 7.5cm， 白色绒毛状 ； 显微镜下观察， 菌丝纤细， 偶有分枝， 无隔， 菌丝宽 25 100m， 无分生孢子， 有大量菌丝断， 粗 长 ： 25m50m。如图 1 所示为其在显微镜下菌丝体形态图。 0028 对 该 菌 株 的 rDNA-ITS 序 列 即 18S， ITS1， 5.8S， ITS2 和 28S 区 域 部 分 序 列 进 行 扩 增 鉴 定 ： 提 取 菌 株 的 基 因 组 DNA 作 为 模 板， 采 用 两 条 通 用 引 物 ITS1 （5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3 ） 和 ITS4（5 -TCCTCCGC。
26、TTAGATATGC-3 ） 进行 PCR 扩增， 获得大小约0.6Kb的扩增产物 ； 扩增片段克隆后送由上海生工进行测序， 测序获得680个碱 基的 ITS 序列， 序列 （如图 2 所示） 如下 ： AGGGGGAATGGAATACCTATGGTGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCATTGTGCACGCCCGCCATTTT TATCTATCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATGACTCTCGTGCTCTCTGAGTGCGGATGCGAGGATTGCCCTT CAACTCGGAGGTGTCTCTCCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTT。
27、ACACACCCCAAAAGCATGATATAGAATGTA GTCAATGGGCTTGATCGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCT TGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCCGTTTTCTGAACGGTTCTCCGAGG CTTGGATTGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCAGC。
28、GCGGTCCGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGTTCGTACTGAG CTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACAGGGTTTAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCAAGGACAATA CCTTTGTCAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。 0029 将该菌株的上述 rDNA-ITS 序列在 Genbank 数据库中进行 BLAST 比对， 结果显示， 其序列与Coprinus micaceus的 rDNA-ITS 区序列同源性达到 99%。 0030 。
29、通过上述表性特征和分子特征将其鉴定为Coprinus micaceus属真菌， 即晶粒鬼 伞 （Coprinus micaceus） ， 已于2010年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通生物中心， 保藏号为 CGMCC No.4063， 保藏代号 ： MF002。 0031 2、 蓝莓菌根真菌的使用及其对蓝莓各阶段生长情况的研究结果 ： （1） 、 接种晶粒鬼伞 CGMCC4063 对生根的蓝莓组培苗的影响 ： 将己生根的蓝莓组培苗转接在蓝莓与蓝莓菌根真菌的共生培养基上， 每瓶一株， 试验 时尽量挑选生长较为一致的组培幼苗， 2 个月后记录组培苗生长量， 并统计接菌处理及对照 。
30、处理对瓶内蓝莓组培苗的生长势的影响。 0032 实验表明如图 7 所示， 接种蓝莓菌根真菌 CGMCC4063 对蓝莓组培苗的生长促进作 用稍好于对照， 接菌处理的生长量比对照 （CK） 高出 36.11%。 0033 （2） 、 接菌处理对驯化阶段的蓝莓组培苗的影响 ： 待 2 个月后形成菌根， 用无菌镊子把培养瓶内的琼脂轻轻捣碎， 将已形成菌根的蓝莓 组培苗从培养基中拔出， 然后放入 25温水中轻轻洗去琼脂培养基， 洗去琼脂后将其移植 到0.1MPa压力下灭菌2.5小时的营养土上 ； 移植时先用塑料育苗钵盛装己灭菌的培养基质 达 2/3 容器高时， 挖定植坑， 接入相应菌种， 再栽上组培苗。
31、， 在根部覆盖 2 3cm 厚的珍珠岩 并浇水透湿 ； 然后， 放置在光照培养箱中， 温度 25， 光照 12 h/d， 每周浇 WPM 营养液一次， 说 明 书 CN 102220246 A CN 102220255 A5/7 页 7 并进行常规管理 ； 3 个月后记录植株生长量。 0034 实验表明如图 8 所示， 接菌对蓝莓组培苗驯化阶段植株的生长势也表现出明显促 进作用， 接种 MF002 处理的植株生长量高出对照 （CK） 134%。 0035 （3） 、 接种菌根真菌对 2 年生盆栽蓝莓的影响 ： 将扩大繁殖的菌根真菌接种在盆栽蓝莓根际周围， 20 盆重复， 每株接种 5ml 菌液。
32、， 接种 后覆土遮盖植株根系 ； 接种需重复一次， 间隔时间为一个月。按照常规方法进行水肥管理， 2 个月后记录植株生长量及茎粗。 0036 实验表明如图 9 所示， 接菌对 2 个月的蓝莓苗盆栽阶段对植株生长的促进作用较 明显， 接种 MF002 处理的植株生长量高于对照 （CK） 24.1%。 0037 3、 菌根真菌的基础生物学特性研究 晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 生长最适培养基的确定 ： （1） 、 晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 在 PDA 和 MMN 培养基上生长情况的比 较 ： PDA（马铃薯葡萄糖）。
33、 培养基 ： 去皮马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 18g， 去皮马铃薯煮沸 煮沸 30min 后用蒸馏水将滤液定容至 1000mL ； 改 良 MMN 培 养 基 ： CaCl22H2O 0.05g， NaCl 0.025g， K2HPO4 0.025g， (NH4)2HPO4： 0.25g， MgSO47H2O ： 0.15g， 维生素 B1： 0.1mg， FeCl3(1% 溶液 ) ： 1.2ml， 葡萄糖 ： 10g， 麦芽汁 （12.7Be） ： 20g， 琼脂 ： 20g， 蒸馏水 ： 1000ml， pH 5.5。 0038 上述培养基均为 121， 灭菌 20min。
34、。 0039 在培养皿中倒入 20mL 融化的上述固体培养基， 凝固后得到等厚度固体平板， 在平 板中央接种直径 7mm 大小的相同菌龄的晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 （MF002） 打孔菌块， 每种培养基设 3 个重复， 28倒置培养， 7 天后测量菌落大小 ； 结果表明， 在 PDA 培养基上生长速度最快， 其次为 MMN 培养基。 0040 （2） 、 晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 生长温度范围研究 ： 在灭菌后的培养基中倒入改良 MMN 培养基， 冷却后接种生长一致的， 直径 7mm 菌饼， 分 别置于 5。
35、， 10， 15， 20， 25， 30， 35条件下的恒温箱内培养， 每种温度处理设 3 个重复， 接种后 第 7 天采用十字交叉法测量菌落直径， 结果表明， 如图 3 所示， 在所采用的 7 个温度中， 25 为其生长最适温度。 0041 （3） 、 晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 生长 pH 值范围检测 ： 将改良 MMN 培养基 （不加琼脂） 的 pH 值分别用 1mol/L HCl 或 1mol/L NaOH 调为 3.0， 4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0 之后装入 50mL 三角瓶 （25mL/ 瓶） ， 在 121、。
36、 0.05MPa 条件下灭 菌 20min， 冷却后每瓶定量接种 1 块直径为 7mm 的菌饼， 每处理 3 个重复， 在 25恒温振荡 培养 （150r/min） 7 天后进行生物量测定， 结果表明， 如图 4 所示， 该菌株在供试 pH3 9 范 围内的最佳生长 pH 值为 6。 0042 （4） 、 不同碳源对晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 生长的影响 ： 以改良 MMN 固体培养基为基础培养基， 将培养基中的碳源 （葡萄糖 + 麦芽汁） 分别用 20g/L的葡萄糖、 麦芽糖、 乳糖和可溶性淀粉代替， 每皿接种一块7mm菌饼， 置于25恒温箱 培养，。
37、 每处理设 3 个重复， 第 7 天时测量菌落直径， 结果表明， 如图 5 所示， 该菌株对麦芽糖 和乳糖利用稍好。 说 明 书 CN 102220246 A CN 102220255 A6/7 页 8 0043 （5） 、 不同氮源对晶粒鬼伞 （Coprinus micaceus） CGMCC4063 生长的影响 ： 分别用 0.25g/L 的无机氮源 （(NH4)2HPO4、 NH4NO3、 KNO3） 和 3g/L 的有机氮源 （蛋白胨） 替代培养基中的氮源 （ （NH4)2HPO4+ 麦芽汁） ， 每处理重复 3 次， 每皿接种一块 7mm 菌饼， 置于 25恒温箱培养， 每处理设 3。
38、 个重复， 第 7 天时测量菌落直径， 结果表明， 如图 6 所示， 该菌 株对无机氮的利用要好于有机氮， 最适氮源为硝酸钾。 0044 4、 蚜虫对接种菌根菌的蓝莓叶片取食性的观察 ： 剪取约 20cm 长的接菌处理的两年生盆栽蓝莓枝条和未接菌的两年生蓝莓枝条， 将枝 条插入装有 WPM 液体培养基的锥形瓶中， 在每个处理的叶片上放置 10 只蚜虫， 每隔 5 小时 记录蚜虫数量， 相机实时监测。 0045 实验发现， 5 小时后在接菌的蓝莓枝条上蚜虫产量约为对照的 2 倍， 由此可推测， 接菌处理的盆栽蓝莓在菌根真菌的影响下能够产生某种敏感气味， 诱导蚜虫倾向于处理后 的蓝莓枝条。 004。
39、6 实施例 1 ： 一种蓝莓菌根真菌的分离方法， 其特征在于 ： 从野生越橘属植物的根际获得菌根真菌， 步骤如下 ： （1） 清洗 ： 取新鲜完整的健康野生蓝莓的根， 用自来水冲洗一小时， 然后用无菌水冲洗 3 次， 将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。 0047 （2） 消毒 ： 将步骤 （1） 中待用的根放入体积分数 70% 的酒精溶液中灭菌 30s， 无菌 水冲洗3次， 然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒2min， 冲洗3次， 再立即放入质量百分比 为 1% 的无菌硫化钠水溶液中浸 2min， 无菌水冲洗 3 次， 无菌滤纸吸干待用。 0048 （3） 培养 ： 将步骤 （2） 消毒后待。
40、用的根切成 0.8cm 长的小段， 置于 PDA 培养基平板 上， 25下恒温倒置培养， 设 5 个重复培养皿， 每个培养皿接 3 个小段。 0049 （4） 纯化 ： 待菌丝培养 5 天后， 用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无 菌培养基上继续纯化培养， 直至每一个平板培养基中只含有单一菌落， 得到 4 个菌落。 0050 （5） 筛选优势菌株 ： 将步骤 （4） 中得到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根 的蓝莓苗， 观察蓝莓接菌后的生长， 将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来， 即为所述的 蓝莓菌根真菌。 0051 该菌株侵染蓝莓根部后， 在显微镜下观察， 是菌根共生结构， 可以。
41、确定其为蓝莓菌 根真菌。 0052 该蓝莓菌根真菌可用于促进蓝莓各个生长阶段的生长、 防虫害、 防冷害以及提高 产量等方面。 0053 实施例 2 ： 一种蓝莓菌根真菌的分离方法， 其特征在于 ： 从野生越橘属植物的根际获得菌根真菌， 步骤如下 ： （1） 清洗 ： 取新鲜完整的健康野生蓝莓的根， 用自来水冲洗一小时， 然后用无菌水冲洗 2 次， 将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。 0054 （2） 消毒 ： 将步骤 （1） 中待用的根放入体积分数 70% 的酒精溶液中灭菌 20s， 无菌 水冲洗3次， 然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒1min， 冲洗3次， 再立即放入质量百分比 为 1%。
42、 的无菌硫化钠水溶液中浸 3min， 无菌水冲洗 3 次， 无菌滤纸吸干待用。 说 明 书 CN 102220246 A CN 102220255 A7/7 页 9 0055 （3） 培养 ： 将步骤 （2） 消毒后待用的根切成 0.5cm 长的小段， 置于 PDA 培养基平板 上， 28下恒温倒置培养， 设 5 个重复培养皿， 每个培养皿接 3 个小段。 0056 （4） 纯化 ： 待菌丝培养 6 天后， 用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无 菌培养基上继续纯化培养， 直至每一个平板培养基中只含有单一菌落， 得到 4 个菌落。 0057 （5） 筛选优势菌株 ： 将步骤 （4） 中得。
43、到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根 的蓝莓苗， 观察蓝莓接菌后的生长， 将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来， 即为所述的 蓝莓菌根真菌。 0058 该菌株侵染蓝莓根部后， 在显微镜下观察， 是菌根共生结构， 可以确定其为蓝莓菌 根真菌。 0059 该蓝莓菌根真菌可用于促进蓝莓各个生长阶段的生长、 防虫害、 防冷害以及提高 产量等方面。 0060 实施例 3 ： 一种蓝莓菌根真菌的分离方法， 其特征在于 ： 从野生越橘属植物的根际获得菌根真菌， 步骤如下 ： （1） 清洗 ： 取新鲜完整的健康野生蓝莓的根， 用自来水冲洗一小时， 然后用无菌水冲洗 4 次， 将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。
44、。 0061 （2） 消毒 ： 将步骤 （1） 中待用的根放入体积分数 70% 的酒精溶液中灭菌 40s， 无菌 水冲洗3次， 然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒3min， 冲洗3次， 再立即放入质量百分比 为 1% 的无菌硫化钠水溶液中浸 1min， 无菌水冲洗 3 次， 无菌滤纸吸干待用。 0062 （3） 培养 ： 将步骤 （2） 消毒后待用的根切成 1cm 长的小段， 置于 PDA 培养基平板上， 27下恒温倒置培养， 设 5 个重复培养皿， 每个培养皿接 3 个小段。 0063 （4） 纯化 ： 待菌丝生长 7 天后， 用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无 菌培养基上继续纯。
45、化培养， 直至每一个平板培养基中只含有单一菌落， 得到 4 个菌落。 0064 （5） 筛选优势菌株 ： 将步骤 （4） 中得到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根 的蓝莓苗， 观察蓝莓接菌后的生长， 将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来， 即为所述的 蓝莓菌根真菌。 0065 该菌株侵染蓝莓根部后， 在显微镜下观察， 是菌根共生结构， 可以确定其为蓝莓菌 根真菌。 0066 该蓝莓菌根真菌可用于促进蓝莓各个生长阶段的生长、 防虫害、 防冷害以及提高 产量等方面。 说 明 书 CN 102220246 A CN 102220255 A1/1 页 10 AGGGGGAATGGAATACCTATG。
46、GTGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCATTGTGCACGCCCGCCATTTT TATCTATCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATGACTCTCGTGCTCTCTGAGTGCGGATGCGAGGATTGCCCTT CAACTCGGAGGTGTCTCTCCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAAAAGCATGATATAGAATGTA GTCAATGGGCTTGATCGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAA CGCAGCGAAATGCG。
47、ATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCT TGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCCGTTTTCTGAACGGTTCTCCGAGG CTTGGATTGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCAGCGCGGTCCGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGTTCGTACTGAG CTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACAGGGTTTAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCAAGGACAATA CC。
48、TTTGTCAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA 序 列 表 CN 102220246 A CN 102220255 A1/5 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102220246 A CN 102220255 A2/5 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102220246 A CN 102220255 A3/5 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102220246 A CN 102220255 A4/5 页 14 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102220246 A CN 102220255 A5/5 页 15 图 9 说 明 书 附 图 CN 102220246 A 。