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1、(10)授权公告号 CN 102181412 B (45)授权公告日 2012.12.12 CN 102181412 B *CN102181412B* (21)申请号 201110056470.6 (22)申请日 2011.03.09 CCTCC NO ： M2011043 2011.02.21 C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 13/04(2006.01) (73)专利权人 南京工业大学。
2、 地址 210009 江苏省南京市新模范马路 5 号 (72)发明人 徐虹 夏军 冯小海 张扬 李莎 倪芳 欧阳平凯 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 肖明芳 WO 2007105203 A3,2007.09.20, 全文 . WO 200914699 A1,2009.12.03, 全文 . GI:297195114. diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486. Genbank .2010, 全文 . (54) 发明。
3、名称 一种二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶及其应 用 (57) 摘要 本发明公开了一种二氨基丁酸 -2- 酮戊二 酸转氨酶及其应用， 它具有如 SEQ ID NO ： 2 所示 的氨基酸序列 ； 本发明还公开了上述酶的编码基 因， 如SEQ ID NO ： 1所示的核苷酸序列。 本发明同 时公开了包含上述二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨 酶的编码基因的表达载体、 基因工程菌及其构建 方法。本发明首次从小白链霉菌 (Streptomyces albulus) 中提取、 测序、 克隆表达的了二氨基丁 酸 -2- 酮戊二酸转氨酶基因， 通过构建基因工程 菌， 利用基因工程菌发酵生产 L-2， 4-。
4、 二氨基丁 酸， 开辟了一条新的 L-2， 4- 二氨基丁酸获取途 径。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高宇 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 10 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 10 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 一种二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶， 其特征在于它是如 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基 酸序列。 2. 一种权利要求 1 所示二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的编码基因， 其特征在于它具 有如 SEQ IDNO ： 1 。
5、所示的核苷酸序列。 3. 一种表达载体， 其特征在于包含权利要求 2 所述的二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶 基因。 4. 根据权利要求 3 所述的表达载体， 其特征在于所述的表达载体为 pET-28a（+） 。 5. 一种基因工程菌， 其特征在于它包含权利要求 3 所述的表达载体。 6. 根据权利要求 5 所述的基因工程菌， 其特征在于所述的基因工程菌为包含有重组质 粒 pET-dabat 的 E.coli BL21（DE3） 。 7. 权利要求 6 所述的基因工程菌的构建方法， 其特征在于它包含如下步骤 ： （1） 二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的基因 dabat 扩增 ： 根据Ge。
6、neBank公布的Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组序列， 设计如下一对 引物 ： 引物 1 ： 5 -CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3 引物 2 ： 5 -CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3 在上述引物的 5 端的下划线部分分别引入 EcoR I 和 Hind III 酶切位点， 以小白链霉 菌 （Streptomyces albulus） PD-1 CCTCC NO ： M2011043 总 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增， PCR 反应物组成如下 ： 25l 体系， 2.5l 10Ex Taq。
7、 Buffer， 2l dNTP， 2.5l MgCl2， 2l DMSO， 2l 模板， 引物 1 和引物 2 各 2l， 0.5l Ex Taq， 9.5l ddH2O， PCR 反应程序为 ： 95变性 5min， 然后 94 30s， 58 60s， 72 90s， 共 30 个循环， 72延续 10min ； 将 PCR 产物克隆测序 ； （2） 重组表达质粒 pET-dabat 的构建 ： 将步骤 （1） 得到 PCR 产物纯化后用限制性内切酶 EcoR I 和 Hind III 酶切， 与经过同 样双酶切的质粒 pET-28a(+)， 在 T4 连接酶的作用下进行连接， 得到重组。
8、质粒 pET-dabat ； （3） 将该重组质粒 pET-dabat 转化至宿主细胞中 ： 将重组质粒 pET-dabat 转化至感受态大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 涂布含有 25g/mL 卡那 霉素的 LB 固体培养基上， 37培养 18 24h 得到初步阳性克隆 ； （4） 经抗性培养基筛选得到阳性克隆 ： 分别挑取初步阳性克隆于 5mL 含有 25g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37， 200rpm培养过夜， 提取质粒， 经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切质粒， 根据电泳结果判 断具有序列表 SEQ ID NO ： 1 的 DNA 片段的质粒为重组质粒 p。
9、ET-dabat， 具有该质粒的菌落 为阳性克隆， 即为基因工程菌。 8. 权利要求 6 所述的基因工程菌在发酵生产 L-2,4 二氨基丁酸中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于将基因工程菌在含有25g/mL卡那霉素的 LB 液体培养基中 30 40液体培养 8-20h， 按 2 10%(v/v) 的接种量转接至发酵培养基 培养 5 7h 后， 加入终浓度为 0.2 1mmol/L 的乳糖诱导， 降温至 25 30再诱导培养 12 20h。 10. 根据权利要求 9 所述的应用， 其特征在于所述的发酵培养基包含如下组分 ： 葡萄糖 权 利 要 求 书 CN 102181412 。
10、B 2 2/2 页 3 10 50g/L， (NH4)2SO4 5 l0g/L， NaC1 5 l0g/L， KH2PO4 1 3g/L， MgSO4 0.1 l g/L， 溶剂为水。 权 利 要 求 书 CN 102181412 B 3 1/6 页 4 一种二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程技术领域， 具体涉及涉及一种二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨 酶及其应用。 背景技术 0002 L-2， 4- 二氨基丁酸 (L-2， 4-diaminobutyric acid， 英文缩写 DABA)， 也称 2， 4- 丁 二氨酸， 是一种次生非蛋白质氨。
11、基酸， 属于四碳化合物， 其结构式为 (NH2)CH2CH2CH(NH2) COOH， 属于碱性氨基酸。 它广泛存在于动物、 植物和微生物体内， 具有独特的生理功能， 目前 其研究处于起步阶段， 尚未大规模应用。二氨基丁酸在农业和医药行业中具有良好的应用 前景。在农业方面， 研究发现在高等植物中， 尤其是山黧豆属 (Lathyrus) 中， 游离的二氨基 丁酸含量较高， 当外界环境恶劣时， 二氨基丁酸含量上升， 环境改善时， 二氨基丁酸含量又 下降， 这可能与这种植物抗旱、 耐瘠薄、 耐盐碱、 抗虫的特性有关， 实验室研究表明如果外界 提供氮源， 固氮植物以硝酸盐的形式提供无机氮， 则该植物体。
12、内二氨基丁酸含量上升， 以储 存多余的氮素， 消除氨态氮对植物的毒害作用。美国农业部将植物抗逆性的研究作为一个 研究方向， 专门拨款研究林生山黧豆和其体内的二氨基丁酸。 在我国， 中国农业大学也在进 行该方面的研究。 除了水土保持， 研究发现对于体内没有发现二氨基丁酸的植物来说， 二氨 基丁酸是一种竞争性的代谢抑制剂， 国外研究者证实二氨基丁酸对莴苣、 蚕豆的生长有抑 制作用， 对一些蝗虫的生长也有抑制作用。 含有二氨基丁酸的植物在植物群落中生存力强， 具有竞争力， 可能就是由于释放出的二氨基丁酸对其他动植物的生长起到了抑制作用。除 了抑制作用， 二氨基丁酸能促进豌豆根瘤菌的生长， 对土壤杆菌。
13、和其他的根瘤菌的生长也 有刺激作用。 在医学方面， 过量的二氨基丁酸对人体有毒性， 但在适当的剂量下又是一种药 物， 研究发现二氨基丁酸能引起高渗透压， 对小鼠纤维瘤细胞有毒害性， 对人体恶性神经胶 质瘤细胞有溶解作用， 因此， 二氨基丁酸能用于脑肿瘤的防治。 把抗癌药物道诺霉素制成二 氨基丁酸衍生物， 用它治疗白血病疗效更好， 更为安全。 0003 本课题组在筛选具有聚赖氨酸能力的菌株时发现一株能同时生产聚赖氨酸及聚 二氨基丁酸的菌株 Streptomyces albulus PD-1(CCTCC NO ： M2011043)。目前该菌株保 藏于武汉中国典型培养物保藏中心 ( 简称 CCTC。
14、C)， 地址 ： 武汉武汉大学， 邮编 ： 430072， 登记入册的编号是 CCTCC NO ： M2011043， 保藏日期是 ： 2011 年 2 月 21 日， 详见中国专利 2011100499868。 0004 二 氨 基 丁 酸 -2- 酮 戊 二 酸 转 氨 酶 (diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase， 简称DABAT， EC 2.6.1.76)在L-2， 4-二氨基丁酸的合成中起重要作用， 天冬 氨酸的衍生物天冬氨酸 - 半醛和谷氨酸在该酶催化下生成 L-2， 4- 二氨基丁酸和 - 酮 戊二酸。目前 L-2， 4- 二氨基丁。
15、酸尚未大规模生产， 作为精细化工品， 只能通过有机合成的 方法得到， 价格昂贵， 价格达 900 元 / 克。山黧豆属的植物中， L-2， 4- 二氨基丁酸占种子干 重的 1 -3， 含量低， 直接从种子中提取在技术角度、 经济角度上都不可行。因此， 本发明 从微生物合成的角度研究如何发酵生产 L-2， 4- 二氨基丁酸， 为 L-2， 4- 二氨基丁酸高产基 说 明 书 CN 102181412 B 4 2/6 页 5 因工程菌的构建及 L-2， 4- 二氨基丁酸的生产开辟了一条新的途径。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶。 0006 。
16、本发明还要解决的技术问题是提供编码上述二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的 基因序列。 0007 本发明还要解决的技术问题是提供包含上述二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶基 因的表达载体及基因工程菌。 0008 本发明还要解决的另一个技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。 0009 本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌在制备 L-2， 4- 二氨基丁酸 的应用。 0010 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下 ： 0011 一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶， 它具有如SEQ ID NO ： 2所示的氨基酸序列。 包含 422 个氨基酸。其来源于小白链霉菌 (Strept。
17、omyces albulus)PD-1( 菌种保藏号 ： CCTCC NO ： M2011043， 关于上述小白链霉菌具体见中国专利 2011100499868)。 0012 一种权利要求 1 所示二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的编码基因， 它具有如 SEQ IDNO ： 1 所示的核苷酸序列， 其含有 1269bp 碱基。 。 0013 一种表达载体， 包含权利要求 2 所述的二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶基因。 0014 其中， 所述的表达载体为 pET28a(+)。 0015 一种基因工程菌， 它包含权利要求 3 所述的表达载体。 0016 上述基因工程菌优选为包含有重组质粒 p。
18、ET-dabat 的 E.coli BL21(DE3)。 0017 上述基因工程菌的构建方法， 包含如下步骤 ： 0018 (1) 二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的基因 dabat 扩增 ： 0019 根据GeneBank公布的Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组序列， 设计如下 一对引物 ： 0020 引物 1 ： 5 -CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3 0021 引物 2 ： 5 -CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3 0022 在上述引物的 5 端的下划线部分分别引入 EcoR I 和 Hind I。
19、II 酶切位点， 以小白 链霉菌 PD-1(Streptomyces albulus PD-1， CCTCC NO ： M2011043) 总 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增， PCR 反应物组成如下 (25l 体系 ) ： 2.5l 10Ex Taq Buffer， 2l dNTP， 2.5l MgCl2， 2l DMSO， 2l模板， 引物1和引物2各2l， 0.5l Ex Taq， 9.5l ddH2O， PCR反 应程序为 ： 95变性5min， 然后9430s， 5860s， 7290s， 共30个循环， 72延续10min。 将 PCR 产物克隆测序。 0023 (2) 重组。
20、表达质粒 pET-dabat 的构建 ： 0024 将步骤 (1) 得到的 PCR 产物纯化后用限制性内切酶 EcoR I 和 Hind III 酶切， 与经过同样双酶切的质粒 pET-28a(+)， 在 T4 连接酶的作用下进行连接， 得到重组质粒 pET-dabat ； 0025 (3) 将该重组质粒 pET-dabat 转化至宿主细胞中 ： 0026 将重组质粒 pET-dabat 转化至感受态大肠杆菌 BL21(DE3) 中， 涂布含有 25g/mL 说 明 书 CN 102181412 B 5 3/6 页 6 卡那霉素的 LB 固体培养基上， 37培养 18 24h 得到初步阳性克隆。
21、 ； 0027 (4) 经抗性培养基筛选得到阳性克隆 ： 0028 分别挑取初步阳性克隆于 5mL 含有 25g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37， 200rpm培养过夜， 提取质粒， 经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切质粒， 根据电泳结果判 断具有序列表 SEQ ID NO ： 1 的 DNA 片段的质粒为重组质粒 pET-dabat， 具有该质粒的菌落 为阳性克隆， 即为基因工程菌。对重组质粒 pET-dabat 进行测序， 结果表明插入片段为一个 含有 1269bp， 编码 422 个氨基酸组成的蛋白质。 0029 上述二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的表达方法。
22、 ： 将包含如 SEQ ID NO ： 1 所示的 核苷酸序列的基因工程菌接种于添加了 25g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37摇床 培养过夜 ； 再以 2 10 (v/v) 的接种量转接到含 25g/mL 卡那霉素的 LB 培养基中培养 5-7h后， 加入异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导， IPTG的终浓度为0.21mmol/ L， 降温至 25 30， 继续表达 12 20h 后， 离心收集菌体。 0030 上述基因工程菌在发酵生产 L-2， 4 二氨基丁酸中的应用。 0031 具体方法为 ： 将基因工程菌在含有 25g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中 30 。
23、40液体培养 8-20h， 按 2 10 (v/v) 的接种量转接至发酵培养基培养 5 7h 后， 加入 终浓度为 0.2 1mmol/L 的乳糖诱导， 降温至 25 30再诱导培养 12 20h。其中， 所述 的发酵培养基包含如下组分 ： 葡萄糖 10 50g/L， (NH4)2SO4 5 10g/L， NaCl 5 10g/L， KH2PO41 3g/L， MgSO4 0.1 1g/L， 溶剂为水。 0032 有益效果 ： 本发明首次从小白链霉菌 (Streptomyces albulus) 中提取、 测序、 克 隆表达的了二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶基因， 将该基因上传至 NCBI。
24、 上进行同源性比 对， 其与 Streptomyces coelicolor A3(2) 中的 Aminotransferase 基因具有最高同源性 86， 通过构建基因工程菌， 利用基因工程菌发酵生产 L-2， 4- 二氨基丁酸， 开辟了一条新 的 L-2， 4- 二氨基丁酸获取途径。 附图说明 0033 图 1 ： 是本发明的产 L-2， 4- 二氨基丁酸的大肠杆菌基因工程菌的构建示意图。 0034 图 2 ： 是本发明重组表达质粒 pET-dabat 的构建示意图。 0035 图 3 ： 是重组的 DABAT 酶 SDS-PAGE 图谱， 最左边泳道为标准蛋白分子量， 自上向下 的条带分。
25、别为 (kDa) ： 116， 66， 45， 35， 25。其中， 第 1、 2 泳道是工程菌， 3、 4 泳道是对照菌。 具体实施方式 0036 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的内容仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。 0037 实施例 1 ： 小白链霉菌 (Streptomyces albulus)PD-1 基因组 DNA 的提取。 0038 按照生产商提供的使用说明书， 用 Genomic DNA Purification Kit(Takara， 大 连 ) 抽提处于对数生长期的小白链霉菌 。
26、PD-1(Streptomyces albulus PD-1， CCTCC NO ： M2011043) 的基因组 DNA， 并用 8g/L 琼脂糖凝胶电泳对获得的细菌基因组进行检测。 0039 实施例 2， 二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的基因 (dabat) 的克隆和重组菌构建。 说 明 书 CN 102181412 B 6 4/6 页 7 0040 2.1dabat 的 PCR 扩增 ： 0041 根据GeneBank公布的Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组序列， 设计如下 一对引物 ： 0042 引物 1 ： 5 -CCGGAATTCATGACCAT。
27、CACCCAGCCCGA-3 0043 引物 2 ： 5 -CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3 0044 在上述引物的 5 端的下划线部分分别引入 EcoR I 和 Hind III 酶切位点， 以小白 链霉菌 PD-1(Streptomyces albulus PD-1， CCTCC NO ： M2011043) 总 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增， PCR 反应物组成如下 (25l 体系 ) ： 2.5l 10Ex Taq Buffer， 2l dNTP， 2.5l MgCl2， 2l DMSO， 2l 模板， 引物 1 和引物 2 各 2l， 0.5l 。
28、Ex Taq， 9.5l ddH2O， PCR 反应程序为 ： 95变性 5min， 然后 94 30s， 58 60s， 72 90s， 共 30 个循环， 72延续 10min。将扩增条带切胶后用 Axygen 公司柱式割胶回收试剂盒纯化回收， 连接于 Takara 公 司pMD18-T载体上并转化大肠杆菌JM109。 通过在氨苄青霉素LB平板上结合质粒单双酶切 验证， 鉴定出阳性克隆， 并在南京金斯瑞生物科技公司进行序列测定。 0045 2.2dabat 基因的表达 0046 利用 pET-28a(+) 质粒 (Novagen)， 构建表达载体， 表达目的基因， 进一步确认基因 克隆的正。
29、确性。 0047 2.2.1 限制性酶切反应， 纯化及连接反应 0048 将 PCR 产物纯化， 用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的内切酶进行酶切 反应， 同时， 将 pET-28a(+) 质粒 (Novagen) 进行酶切反应。本实验中， 所用的酶是 EcoRI 和 Hind III。酶切体系为 ： PCR 产物或 pET-28a(+) 质粒溶液 50L， EcoRI 3L， Hind III3L， 10 缓冲液 10L， ddH2O 34L， 总体积 100L。 0049 由于所选用的两个酶切位点在pET-28a(+)空质粒上相距很近(约20bp)， 因此， 酶 切之后的 PCR 产物。
30、和质粒载体只需要经过 PCR 清洁试剂盒即可达到纯化的目的。 0050 经酶切纯化后的PCR产物和质粒载体， 可以用于连接反应。 连接反应体系为 ： 酶切 纯化的 PCR 产物 4L， 酶切纯化的质粒 4L， T4 连接酶 1L， 10 连接酶缓冲液 1L。连 接后获得重组质粒 pET-dabat， 其主要结构如图 2 所示。 0051 2.2.2 质粒制备与转化 0052 质粒抽提采用 Axyprep plasmid miniprep Kit(Axygen， 杭州 )， 参照生产商的说 明书进行操作。质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3) 细胞使用热激法。 0053 2.2.3 重组质粒 pE。
31、T-dabat 的转化 0054 (1) 取 0.1-1g 重组质粒 pET-dabat DNA 于 200L 大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态 细胞中， 冰浴 30 分钟。 0055 (2)42水浴热激 90 秒， 快速置于冰上 1-3 分钟。 0056 (3) 加入新鲜 LB 液体培养基 800L， 于 37振荡培养 45 分钟。 0057 (4)取200L菌体涂布于含有25g/mL卡那霉素的LB平板表面。 37培养12-16 个小时至单菌落出现。 0058 2.2.4 重组子的鉴定 0059 将阳性菌落接种于含有卡那霉素(25g/mL)的LB液体培养基中进行培养并提取 质粒， 按照实。
32、施例 2.2.1 中的酶切体系和条件分别用 EcoRI 和 Hind III 对重组质粒进行 说 明 书 CN 102181412 B 7 5/6 页 8 单 - 双酶切鉴定， 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。经电泳结果证实， 该阳性克隆菌落含 有 DNA 片段插入质粒 pET-dabat， 含此重组质粒 pET-dabat 的重组大肠杆菌， 即为转化的重 组工程菌E.coli BL21-pET-dabat。 测序结果显示插入片段含有一个长1269bp的开放阅读 框架。 0060 实施例 3 ： 二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的诱导表达。 0061 将重组大肠杆菌 BL21-pET-dab。
33、at 接种于 5mL 添加了 25g/mL 卡那霉素的 LB 液 体培养基中， 37摇床培养过夜 ； 再以5(v/v)的接种量转接到装有100mL LB培养基(含 25g/mL 卡那霉素 ) 的 500mL 摇瓶中， 37摇床培养至 OD600 约为 0.6 时加入 IPTG 进行诱 导 (IPTG 终浓度 1mmol/L)， 降温至 25 30， 继续表达 12 小时后， 离心收集菌体。 0062 实施例4、 工程菌E.coli BL21-pET-dabat中二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的表 达分析。 0063 1、 SDS-PAGE 分析 0064 如实施例2.2.2-2.2.4所述步骤。
34、， 将没有经过酶切的空质粒pET-28a(+)转化大肠 杆菌BL21(DE3)感受态细胞， 筛选得到包含pET-28a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)， 将该菌作为 对照菌， 命名为 E.coli BL21-pET。 0065 将重组大肠杆菌 BL21-pET-dabat 和对照菌 E.coli BL21-pET 接种于 5mL 添加了 25g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37摇床培养过夜 ； 再以 5 (v/v) 的接种量转接 到装有 100mL LB 培养基 ( 含 25g/mL 卡那霉素 ) 的 500mL 摇瓶中， 37摇床培养至 OD600 约为 0.6 时加入 IPT。
35、G 进行诱导 (IPTG 终浓度 1mmol/L)， 降温至 25 30， 继续表达 12 小 时后， 各取样 1.5mL， 离心， TE 溶液 (Tris-HCl 10mM， EDTA 1mM) 洗涤两次， 再加入 100l TE 溶液和 20l 10mg/ml 的溶菌酶 ( 购自华美生物工程公司 ) 处理 1 个小时， 煮沸 3min， 离心， 取上清即可使用。SDS-PAGE 凝胶制备好后点样， 每个点 5-15l， 然后电泳、 染色及脱 色， SDS-PAGE结果表明 ： 二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶在工程菌E.coli BL21-pET-dabat 中获得了可溶性表达， 而对照菌 。
36、E.coli BL21-pET 则没有。 0066 2， 二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶的酶活测定 0067 将重组大肠杆菌 BL21-pET-dabat 接种于 5mL 添加了 25g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中， 37摇床培养过夜 ； 再以 5 (v/v) 的接种量转接到装有 100mL LB 培 养基 ( 含 25g/mL 卡那霉素 ) 的 500mL 摇瓶中， 37摇床培养至 OD600约为 0.6 时加 入 IPTG 进行诱导 (IPTG 终浓度 1mmol/L)， 降温至 25 30， 继续表达 12 小时后， 各 取样 1.5mL， 离心， TE 溶液 (Tris-。
37、HCl 10mM， EDTA 1mM) 洗涤两次， 再加入 100l TE 溶液和 20l 10mg/ml 的溶菌酶 ( 购自华美生物工程公司 ) 处理 1 个小时， 离心后去 上清液作为酶液， 参照 Hisato Ikai 等报道的方法进行二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨 酶 酶 活 测 定 (Ikai， H， and S.Yamamoto.Identification and analysis of a gene encoding L-2， 4-diaminobutyrate ： 2-ketoglutarate 4-aminotransferase involved in the1， 3-。
38、diaminopropane production pathway in Acinetobacter baumannii. J.Bacteriol.1997(179) ： 5118-5125.)， 重复测定酶活三次。结果显示， 本发明克隆的基因 工程菌的酶活为 5.6U/mg， 而对照菌 E.coli BL21-pET 几乎检测不到酶活， 说明本发明克隆 的二氨基丁酸 -2- 酮戊二酸转氨酶基因在大肠杆菌中得到了活性表达。 0068 3， 本发明的基因工程菌 BL21-pET-dabat 的发酵性能测试 说 明 书 CN 102181412 B 8 6/6 页 9 0069 将活化好的工程菌B。
39、L21-pET-dabat接种到装有100mL LB培养基(含25g/mL卡 那霉素 ) 的 500mL 摇瓶中， 37摇床培养过夜， 按 5 (v/v) 的接种量转接至装有 100mL 发 酵培养基的 500mL 摇瓶中 ( 葡萄糖 50g/L， (NH4)2SO4 8g/L， NaCl 10g/L， KH2PO4 2g/L， MgSO4 0.5g/L， 溶剂为水。) 培养 5-7h 后， 加入终浓度为 1mmol/L 的乳糖诱导， 降温至 25 30， 继续培养 12h。离心弃去菌体， 收集培养液。参照沈黎明等改进的方法测定培养液中 L-2， 4- 二氨基丁酸含量 ( 沈黎明， 吴显荣， 。
40、林生山黧豆体内的一种特异游离氨基酸 - 丁二氨酸， 北京农业大学学报， 1992， 18(4) ： 347-351)， 结果表明， 摇瓶培养液中 L-2， 4- 二氨基丁酸含 量达 5.6g/L， 相信经过发酵条件优化， 有望实现二氨基丁酸的工业化发酵生产。 说 明 书 CN 102181412 B 9 1/10 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102181412 B 10 2/10 页 11 0003 序 列 表 CN 102181412 B 11 3/10 页 12 0004 序 列 表 CN 102181412 B 12 4/10 页 13 0005 序 列 表 CN 1。
41、02181412 B 13 5/10 页 14 0006 序 列 表 CN 102181412 B 14 6/10 页 15 0007 序 列 表 CN 102181412 B 15 7/10 页 16 0008 序 列 表 CN 102181412 B 16 8/10 页 17 0009 序 列 表 CN 102181412 B 17 9/10 页 18 0010 序 列 表 CN 102181412 B 18 10/10 页 19 序 列 表 CN 102181412 B 19 1/3 页 20 图 1 说 明 书 附 图 CN 102181412 B 20 2/3 页 21 图 2 说 明 书 附 图 CN 102181412 B 21 3/3 页 22 图 3 说 明 书 附 图 CN 102181412 B 22 。