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1、(10)授权公告号 CN 102220196 B (45)授权公告日 2013.04.17 CN 102220196 B *CN102220196B* (21)申请号 201110123311.3 (22)申请日 2011.05.13 4792 2011.04.27 C12C 11/02(2006.01) C12C 12/00(2006.01) C12N 1/18(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (73)专利权人 中国食品发酵工业研究院 地址 100027 北京市朝阳区霄云路 32 号 (72)发明人 王德良 宋绪磊 王异静 郝建秦 王贵双 胡京奕 张五九 (54) 。
2、发明名称 一种利用特高浓啤酒酵母酿造特高浓啤酒的 方法 (57) 摘要 本发明提供一种适合特高浓啤酒酿造的菌 种和方法， 利用诱变、 驯化、 抗酒精实验、 培养、 连续分离、 筛选、 评价等步骤， 筛选出抵制 2- 脱 氧 -D- 葡萄糖并且还原双乙酰能力强， 耐酒精， 适 合 28 P 超高浓麦汁的菌种 G25(Saccharomyces cerevisiae)， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC NO.4792， 使用本发明提供的菌种及工艺方法生产特高浓啤 酒， 不但设备利用率大大提高 100-120， 生产成 本降低， 和常规浓度发酵的啤酒相比，。
3、 口感更淡 爽， 口味更干净。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 陈皓 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种利用特高浓啤酒酵母酿造特高浓啤酒的方法， 其特征在于 ： 1) 糖化， 利用麦芽和大米制成高浓原麦汁 16-18 P， 在煮沸锅中添加糖浆， 调麦汁浓 度至 28 P ； 2) 利用筛选的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 命名为特高浓啤酒酵母 G25， 保藏号为 CGMCC NO.4792， 进行发酵 ； 3) 发酵， 。
4、麦汁冷却后对其充氧并接种菌种， 酵母在接种前在 8-12.5 P 的麦汁中进行 扩培， 扩培后接种量控制在 2.5 3.0*107个 /ml， 发酵温度为 12-16， 升压糖度控制在 8 10 P ； 4) 稀释到常规啤酒浓度 10-14 P， 高浓稀释工艺稀释比在 100 120。 2. 如权利要求 1 所述的利用特高浓啤酒酵母酿造特高浓啤酒的方法， 其各步骤优选 为 ： 1) 糖化， 利用麦芽和大米制成高浓原麦汁 18 P， 在煮沸锅中添加糖浆， 调麦汁浓度至 28 P ； 2) 发酵， 麦汁冷却后对其充氧并接种菌种， 酵母在接种前在 12.5 P 的麦汁中进行扩 培， 接种量控制在 2。
5、.5*107个 /ml， 发酵温度为 14， 升压糖度控制在 9 P ； 3) 稀释， 高浓稀释工艺稀释比在 120。 3.一种用于权利要求1所述方法的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)， 命名为特 高浓啤酒酵母 G25， 保藏号为 CGMCC NO.4792， 已于 2011 年 4 月 27 日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 该菌种除 具有发酵特高浓啤酒的性质外， 还具有还原双乙酰能力强， 耐酒精的性质。 4. 权利要求 3 所述的特高浓啤酒酵母 G25 用作特高浓度啤酒酿造的用途。 权 。
6、利 要 求 书 CN 102220196 B 2 1/3 页 3 一种利用特高浓啤酒酵母酿造特高浓啤酒的方法 技术领域 0001 本发明涉及到一种利用特高浓啤酒酵母酿造特高浓啤酒的方法， 优选的该菌种适 用于特高浓啤酒为原麦汁浓度在 28 P 的啤酒酿造工艺。 背景技术 0002 随着全球的能源供应日趋紧张， 物价飞涨， 因此在传统的酿造工业也开始了关注 节能降耗， 环保高效的技术革新。在过去几年的研究中， 高浓度酿制啤酒在我国逐渐的 开始应用， 一般的啤酒高浓度酿造 (High Gravity Brewing) 是指在啤酒酿造过程中糖 化得到较高的麦芽汁浓度 (15 P-18 P)， 在糖化。
7、以后的工序中再加水稀释到正常浓度 (10-12 P)。对于 18 P 以上的麦汁称为 VHG 麦汁 (Very High Gravity)， 即超高浓度麦 汁， 目前国内应用的比较少， 但是相关的技术研究已经日趋成熟， 随着科技水平的进一步提 高和降低能源消耗的需要， 采用特高浓度酿造(28P以上)后稀释技术， 能大大提高糖化， 发酵设备的利用率， 可以在投资和运行成本降低的情况下， 增加产量 100 120。目前 国内一般的啤酒生产商的高浓酿造几乎在13-16P之间， 很少有超过18P的高浓酿造。 0003 特高浓酿造过程中， 由于发酵麦汁浓度的更大的提高， 酵母细胞所面临的渗透压 的增加、。
8、 酒精含量的提高以及营养平衡的改变， 都对啤酒酵母的性能产生较大的影响 ： 如细 胞形态的变化、 细胞活性降低， 发酵性能的降低。 啤酒企业使用中最直接的感受是存在酵母 伴随使用代数增加， 性能降低， 凝聚性变差， 酵母自溶等问题。 另外， 高浓酿造啤酒在稀释至 与常浓酿造啤酒乙醇浓度相当时酒体较淡， 因此风味难以与常浓酿造啤酒相比， 且往往比 常浓酿造啤酒的泡持性要差。 本发明提供一种筛选出的特高浓啤酒酿造菌种有益的解决了 上述问题， 改善了酿造后的特高浓啤酒的品质。 同时对特高浓酿造的糖化工艺， 发酵工艺都 进行研究和优化， 形成了一套特高浓 28 P 发酵的工艺技术和菌种应用条件。 发明。
9、内容 0004 本发明在前期筛选的 18 P 酵母菌种的基础上， 通过进一步的诱变， 长期驯化、 抗酒精驯化， 连续分离评价， 经过两年的时间筛选得到一株特高浓啤酒发酵菌种， 其能抵制 2- 脱氧 -D- 葡萄糖， 可以同时利用葡萄糖和麦芽糖， 麦芽三糖， 能够正常发酵 28 P 的特高 浓麦汁。该特高浓啤酒酵母 G25 分类命名为 “酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae” ， 已经 保存到已于 2011 年 4 月 27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地 址是 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏号为 CGMCC NO.4792， 。
10、该菌种除具有上述发 酵特高浓啤酒的性质外， 还具有还原双乙酰能力强， 耐酒精的性质。 本发明还提供一种通过 接种上述菌种酿造超高浓啤酒的方法， 其包括糖化、 发酵、 稀释步骤。 0005 正常的啤酒酵母都有一个正常的酒精耐受度， 一般的超过 12 (vol) 的酒精浓 度， 酵母的发酵就会受到抑制， 而特高浓酿造啤酒的过程中， 酒精的产生量是很高的， 对酵 母会造成很高的渗透压和高酒精压力， 因此， 如果酵母的耐酒精能力强， 就能很好的进行特 高浓度酿造。本发明在前期已经筛选的得到的具备高浓酿造的酵母菌株的基础之上， 利用 说 明 书 CN 102220196 B 3 2/3 页 4 化学诱变。
11、的手段处理酵母， 筛选出抵制2-脱氧-D-葡萄糖的酵母， 同时用酒精驯化， 酒精耐 受度能达到15， 利用双乙酰梯度平板选育出还原双乙酰能力强， 耐酒精的的酵母。 为了使 酵母能够适应高浓的发酵环境， 将筛选的酵母在 28 P 超高浓麦汁中长期驯养， 使其逐渐 适应发酵环境， 性能较出发菌株有很大的改观。 0006 本发明菌种筛选步骤为 ： 0007 (1) 诱变 ： 将出发菌株采用 EMS( 甲基磺酸乙酯 ) 进行低剂量较温和的化学诱变。 0008 (2) 培养 ： 将诱变好的培养液涂布 YPM 培养基 ： 酵母浸出物 0.5-2， 蛋白胨 1-3， 麦芽糖 0.5-2， 2- 脱氧 -D-。
12、 葡萄糖 0.02-1， 琼脂 ( 优选为酵母浸出物 1， 蛋白 胨 2， 麦芽糖 1， 2- 脱氧 -D- 葡萄糖 0.05， 琼脂 ) 平板， 30培养 7 天。 0009 (3) 分离 ： 采用梯度稀释法分离单菌落。 0010 (4) 耐酒精筛选 ： 将以上菌种接入含有不同酒精浓度 (6 -16 ) 的麦汁中， 看其发酵情况。选择能耐受高酒精浓度的菌株。 0011 (5) 长期驯化 ： 在试管中加入 50ml 高浓麦汁 (28 P)， 并在其上覆盖 2ml 矿物油 造成微厌氧环境， 将上述选出的菌种接种进行 12发酵测定， 连续传代驯养， 使其逐渐的适 应特高浓环境。 0012 (6) 。
13、评价 ： 进行小试线试验， 选出适合高浓酿造的酵母。 0013 本发明特高浓高浓啤酒的糖化发酵工艺为 ： 0014 1) 糖化， 利用麦芽和大米等制成高浓原麦汁 18 P， 在煮沸锅中添加糖浆， 调麦汁 浓度至 28 P ； 0015 2) 发酵， 麦汁冷却后对其充氧量并接种菌种， 实验发现如果在高浓麦汁中扩培酵 母， 酵母的死亡率在后期的发酵中会极大地上升， 影响使用代数， 因此经过反复的试验， 确 定， 酵 母在扩培时应在 8-12.5 P 之间的低浓麦汁中进行扩培， 酵母活力会很大的提高。 并且在实验的过程中， 对酵母的接种量进行了反复试验， 发现适当的提高接种量效果比较 理想， 因此接。
14、种量控制在 2.5 3.0*107个 /ml， 发酵温度采用较高的温度也比较好， 一般 12-14。为了避免特高浓酿造后稀释的寡淡， 对升压的糖度进行了实验， 最终升压糖度控 制在 8 10 P 效果比较理想 ； 0016 3) 稀释， 高浓稀释工艺稀释比在 100 120。 0017 利用本发明培养基筛选出的菌种酿造的啤酒， 稀释后的正常浓度的啤酒的理化指 标符合国家标准的要求。啤酒的口感和常规浓度发酵的啤酒相比， 口感更淡爽， 口味更干 净。 具体实施方式 0018 实施例 1 特高浓度酵母的选育 0019 1、 EMS 诱变育种 0020 已经具备高浓酿造性能(18P)的出发酵母(中国食。
15、品发酵工业研究院保藏F菌 株)细胞于1ml无菌磷酸缓冲液中(pH7.0)， 加30ul EMS原液， 振荡分散细胞， 置于30 摇床培养 30min ； 离心， 悬浮细胞于无菌水中， 用 5 Na2S2O3 洗涤两次， 再悬浮细胞于 1ml 无菌水中， 稀释到 10-3， 涂布于 2- 脱氧 -D- 葡萄糖平板培养 7 天， 在培养基上生长的菌株即 为目的菌株。 说 明 书 CN 102220196 B 4 3/3 页 5 0021 2、 耐酒精筛选和驯化 0022 将以上菌种接入含有不同酒精浓度(6-16)的麦汁中， 看其发酵情况， 选择能 耐受高酒精浓度的菌株。在试管中加入 50ml 高浓。
16、麦汁 (28 P)， 并在其上覆盖 2ml 矿物油 造成微厌氧环境， 将上述选出的菌种接种进行 12发酵测定， 连续传代驯养， 使其逐渐的适 应特高浓环境。 0023 3、 评价 ： 进行小试线试验， 选出适合高浓酿造的酵母。 0024 对新获得的菌株进行发酵培养， 挑取上述筛选出的菌种一环 ； 接入 10mL， 12 P 麦 汁中， 30培养 24 小时 ； 再将活化好的试管中菌液全部接入装有 300mL28 P 麦汁的三角 瓶中， 用发酵栓密封， 12发酵， 每天称重， 记录每日失重量， 当单日失重量在 0.2 克以内表 明发酵结束。待发酵结束后， 检测发酵指标。实验测定结果 ： 0025。
17、 指标 出发菌种 选育新菌种 双乙酰 0.15 0.10 降糖速度 10 天 8 天 乙醛 25 18 耐酒精度 11 15 0026 从以上指标看出， 经过本发明培养基使用以上诱变， 驯化， 选育步骤， 选育出菌株 均比出发菌株的发酵性能指标都有很大的改善。 0027 实施例 2 特高浓啤酒的发酵 0028 使用以上菌种通过以下发酵步骤发酵 ： 0029 1) 糖化， 利用 60 70麦芽和 30 40大米等制成原麦汁浓度为 18 P， 在煮 沸锅中添加糖浆， 调麦汁浓度为 28 P ； 0030 2) 发酵， 麦汁冷却后充氧量为 10 12ppm， 接种菌种， 接种量控制在 2.5*107个 / ml， 发酵温度为 14， 升压糖度控制在 9 P ； 0031 3) 稀释， 高浓稀释工艺稀释比在 100 120。 0032 发酵性能指标 0033 0034 可以看出， 特高浓发酵能够正常进行， 酵母的死亡率也没有很大的增加， 低于一般 企业的死亡率不能超过 5的规定。 说 明 书 CN 102220196 B 5 。