技术领域
本发明属于生物荧光探针技术领域，具体涉及一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针及其 制备方法。
背景技术
荧光探针是在一定体系内，当一种物质或体系中某一物质性质发生变化时，荧光信号能 发生相应改变的分子。荧光光谱由于其检测方便、灵敏度高等优点而展现出优越的性能。
目前，人们研究较多的是单光子荧光探针。该类探针的激发波长在350-560nm，处于紫 外-可见光区，光损伤和光漂白较大；并且样品在这个区域内存在光吸收和光散射，背景光会 产生干扰，而且会影响检测深度。建立在双光子荧光显微探测技术基础上的新型双光子生物 荧光探针在离子检测、分子识别、大分子标记及生物成像等领域具有不可比拟的优点，可有 效避免单光子荧光探针的缺点。
新型双光子生物荧光探针的激发波长在700-900nm范围内，避开了生命体系所不能承受 的紫外光损伤以及细胞组织自发荧光的干扰；由于荧光激发只发生在聚焦点，消除了不必要 的光漂白和光毒化，可实现在不伤害或杀死细胞下对金属离子进行长时间的观察；而且，双 光子激发产生的荧光强度与入射光强度成二次方关系，这使得荧光发射集中在更小的空间区 域，有效的提高了空间分辨率，解决了生物组织中深层物质的成像问题，因此双光子技术为 生物成像提供了一个崭新的平台。而基于荧光共振能量转移特性的有机染料-量子点新型生物 荧光探针还相对较少，开发能量转移效率较高的双光子荧光探针也显得尤为重要。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针及 其制备方法，有利于解决单一荧光探针的缺点，能够在红外光下激发，荧光共振能量转移效 率高，充分体现有机染料和量子点的双重性质。
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，由罗丹明水溶液和量子点水溶液组成；
所述的罗丹明水溶液摩尔浓度在5.5×10-6-7.5×10-5mol/L；所述的量子点水溶液的摩尔浓 度在5.0×10-6-6.0×10-6mol/L；且罗丹明水溶液和量子点水溶液的体积比在(1-1.5)：1之间。
按上述方案，所述的罗丹明水溶液选用罗丹明B或罗丹明6G。
按上述方案，所述的量子点水溶液选用CdTe量子点或CdSe量子点。
上述罗丹明-量子点新型生物荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
1)将罗丹明粉末溶于去离子水中，制得摩尔浓度为5.5×10-6-7.5×10-5mol/L的罗丹明溶液；
2)将固体量子点溶于去离子水中，制得摩尔浓度为5.0×10-6-6.0×10-6mol/L量子点溶液；
3)将罗丹明溶液和量子点溶液按体积比(1-1.5)：1充分混合，在20-27℃条件下超声波 振荡10-15min，得到罗丹明-量子点生物荧光探针。
按上述方案，所述的罗丹明水溶液选用罗丹明B或罗丹明6G。
按上述方案，所述的量子点水溶液选用CdTe量子点或CdSe量子点。
本发明的有益效果如下：
1.本发明生物荧光探针的制备方法简单，将有机染料罗丹明容易的引入量子点。
2.本发明所述的罗丹明-量子点新型生物荧光探针是双光子荧光探针，在激发波长为 800nm、罗丹明浓度7.5×10-5mol/L、激发光功率500mW条件下，所构成的罗丹明-量子点新 型生物荧光探针的能量转移效率可以达到41.36％。
3.本发明反应介质为去离子水，不使用有机溶剂，反应条件温和，后期处理简单，并且 大大降低了运行成本。
附图说明
图1为本发明生物荧光探针构建示意图。
图2为罗丹明的吸收谱和CdTe量子点的发射谱。
图3为实施例1、3、5和对比例的荧光光谱。
图4为800nm双光子激发下，实施例1-6所制备的罗丹明-量子点光敏剂和对比例的荧光 衰减曲线。
图5为摩尔浓度5.0×10-6mol/L的CdTe量子点溶液及实施例7制备罗丹明-量子点新型 生物探针的荧光光谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述，所述的实施例有助于本发明的理解和实 施，并非构成对本发明的限制。
本发明罗丹明-量子点新型生物荧光探针，是由罗丹明水溶液和量子点水溶液组成的体 系；其中罗丹明水溶液摩尔浓度在5.5×10-6-7.5×10-5mol/L；量子点水溶液的摩尔浓度在 5.0×10-6-6.0×10-6mol/L；且罗丹明水溶液和量子点水溶液的体积比在(1-1.5)：1之间。本发 明罗丹明-量子点新型生物荧光探针具有荧光共振能量转移的性质，并且具有有机染料和量子 点的双重性质，对于荧光探针在生命科学领域的实际应用具有一定的意义。其构建示意图如 图1所示。
其制备过程如下：
1)将罗丹明粉末溶于去离子水中，制得摩尔浓度为5.5×10-6-7.5×10-5mol/L的罗丹明溶液；
2)将固体量子点溶于去离子水中，制得摩尔浓度为5.0×10-6-6.0×10-6mol/L量子点溶液；
3)将罗丹明溶液和量子点溶液按体积比(1-1.5)：1充分混合，在20-27℃条件下超声波 振荡10-15min，得到罗丹明-量子点生物荧光探针。
优选地，罗丹明水溶液选用罗丹明B或罗丹明6G。
优选地，量子点水溶液选用CdTe量子点或CdSe量子点。
以下实施例中，对本发明所述罗丹明-量子点新型生物荧光探针的制备和表征作出详细说 明。实施例中所述罗丹明粉末是由上海三爱思试剂有限公司提供。下述实施例中所述CdTe 量子点，是由中国专利(专利号：CN1693208A)所提供的方法制得。检测过程中，实施例 中罗丹明B溶液用紫外-可见分光光度计(HITACHIU-3310,日本)观测其吸收光谱；CdTe量 子点溶液用荧光光谱仪(JascoFP-6500，日本)观测其发射光谱；双光子激发光源用波长为 800nm的飞秒激光器(Mira900,Coherent,76MHz,130fs)激发；荧光寿命用时间相关的单 光子计数器测量。
罗丹明B溶液的制备：取罗丹明固体粉末13.54mg溶于10mL去离子水中，可得罗丹明 原液，其浓度为2.8211×10-3mol/L，用去离子水将罗丹明原液进行稀释，得到罗丹明的浓度为 5.5×10-6mol/L、1.5×10-5mol/L、2.8211×10-5mol/L、4.5×10-5mol/L、6.0×10-5mol/L和7.5×10-5mol/L。
CdTe量子点溶液的制备：取固体CdTe6.77×10-3mg溶于10mL去离子水中，可得CdTe 量子点溶液，其浓度为2.8211×10-5mol/L。取20uLCdTe量子点，以去离子水为溶剂，将QDs 进行5倍稀释，得到CdTe量子点的浓度为5.642×10-6mol/L。
参照附图2可知：罗丹明的最大吸收波长为554nm，量子点的发射光谱与罗丹明的吸收 光谱有较大程度的重叠，即量子点可作为能量供体与罗丹明构建荧光共振能量转移体系(即 新型生物荧光探针)，并产生能量转移。
实施例1
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为5.5×10-6mol/L，体积为750uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为 5.642×10-6mol/L，体积为750uL。
上述罗丹明-量子点新型生物荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将罗丹明固体粉末溶于去离子水中，其摩尔浓度为5.5×10-6mol/L，制得罗丹明溶液；
(2)将固体CdTe溶于去离子水中，其摩尔浓度为5.642×10-6mol/L，制得CdTe量子点 溶液；
(3)将罗丹明溶液和CdTe量子点溶液按照体积比1:1充分混合，在27℃条件下超声波 振荡15min，所得溶液体系，即所述罗丹明-量子点新型生物荧光探针。
实施例2
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为1.5×10-5mol/L，体积为750uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为 5.642×10-6mol/L，体积为750uL。
实施例3
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为2.8211×10-5mol/L，体积为750uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为 5.642×10-6mol/L，体积为750uL。
实施例4
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为4.5×10-5mol/L，体积为750uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为 5.642×10-6mol/L，体积为750uL。
实施例5
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为6.0×10-5mol/L，体积为750uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为 5.642×10-6mol/L，体积为750uL。
实施例6
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为7.5×10-5mol/L，体积为750uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为 5.642×10-6mol/L，体积为750uL。
对比例
CdTe量子点溶液，所述CdTe量子点溶液的浓度为5.642×10-6mol/L。
数据测试(一)
在此数据测试中，实施例1、3、5和对比例所述溶液，用荧光光谱仪(波长400nm)观测荧光光谱，参照附图3所示。用飞秒激光(波长800nm)作为双光子激发光源、激发光功率500mW，用时间相关单子计数器(检测波长530nm)测定CdTe量子点的荧光寿命，参照附图4所示。荧光共振能量转移效率根据以下方程计算：
下表1给出了实施例1-6中制备的罗丹明-量子点新型生物荧光探针的能量转移效率。
表1
参照附图3可知：530nm处是CdTe量子点发射峰，575nm处是罗丹明发射峰。随着罗 丹明溶液浓度的增大，CdTe量子点在530nm处的发射峰光强减小，而罗丹明在575nm处发 射峰光强显著增大。因此，CdTe量子点的能量通过无辐射的形式转移给罗丹明，即发生了荧 光共振能量转移。
参照附图4可知：实施例1中，罗丹明-量子点生物荧光探针中CdTe量子点的荧光寿命 为2.82445ns；实施例2中，罗丹明-量子点生物荧光探针中CdTe量子点的荧光寿命为 2.68625ns；实施例3中，罗丹明-量子点生物荧光探针中CdTe量子点的荧光寿命为2.36852ns； 实施例4中，罗丹明-量子点生物荧光探针中CdTe量子点的荧光寿命为2.33226ns；实施例5 中，罗丹明-量子点生物荧光探针中CdTe量子点的荧光寿命为2.28893ns；实施例6中，罗丹 明-量子点生物荧光探针中CdTe量子点的荧光寿命为1.73765ns；而对比例中，即不存在荧光 共振能量受体罗丹明时，CdTe量子点的荧光寿命为2.9633ns。
由表1可知：随着罗丹明浓度的增加，荧光共振能量转移的效率也相应的增大，当罗丹 明浓度为7.5×10-5mol/L、激发光功率500mW条件下，所构成的罗丹明-量子点新型生物荧 光探针能量转移效率最高，可以达到41.36％。
表2给出了实施例1-6中制备的罗丹明-量子点新型生物荧光探针中罗丹明的荧光寿命。
表2
实施例 实施例6 实施例5 实施例4 实施例3 实施例2 实施例1 荧光寿命(ns) 2.25348 2.19676 2.00472 1.95579 1.80996 1.7068
由表2可知：随着罗丹明浓度的增加，其在575nm(即荧光峰)处荧光寿命逐渐增大， 参照附图4，CdTe量子点寿命缩短，表明量子点将能量转移给了罗丹明，即发生了荧光共振 能量转移。
通过研究发现，在一定量的量子点溶液中，改变罗丹明溶液浓度，量子点的荧光寿命会 发生相应改变，通过与不加入罗丹明的等量量子点溶液的荧光寿命进行比较，可计算不同罗 丹明浓度下的荧光共振能量转移效率，从而得到制备罗丹明-量子点新型生物荧光探针的最佳 罗丹明浓度。
实施例7
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为7.5×10-5mol/L，体积为150uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为5.0 ×10-6mol/L，体积为100uL。将两种溶液按照体积比1.5:1充分混合，在20℃条件下超声波 振荡10min，所得到溶液体系，即所述罗丹明-量子点新型生物荧光探针。
实施例8
一种罗丹明-量子点新型生物荧光探针，它是由罗丹明溶液和CdTe量子点溶液组成的体 系，罗丹明的摩尔浓度为7.5×10-5mol/L，体积为150uL，CdTe量子点溶液的摩尔浓度为6.0 ×10-6mol/L，体积为100uL。将两种溶液按照体积比1.5:1充分混合，在20℃条件下超声波 振荡10min，所得到溶液体系，即所述罗丹明-量子点新型生物荧光探针。
数据测试(二)
在此数据测试中，实施例7制备罗丹明—量子点新型生物荧光探针，用荧光光谱仪(波长 400nm)观测荧光光谱，曲线参照附图5所示，可知：罗丹明—量子点光敏剂在525nm处的 强度低于纯量子点的强度，说明此过程中，CdTe量子点的能量通过无辐射形式能量转移传递 给了罗丹明。