《一种环磷酸腺苷的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种环磷酸腺苷的制备方法.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102268469 A (43)申请公布日 2011.12.07 CN 102268469 A *CN102268469A* (21)申请号 201010191523.0 (22)申请日 2010.06.04 CGMCC NO.3584 2010.01.18 C12P 19/32(2006.01) C12R 1/06(2006.01) (71)申请人 南京工业大学 地址 210009 江苏省南京市新模范马路 5 号 (72)发明人 应汉杰 柏建新 陈晓春 熊健 陈勇 (74)专利代理机构 北京泛华伟业知识产权代理 有限公司 11280 代理人 曹津燕 (54) 发明名。
2、称 一种环磷酸腺苷的制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种环磷酸腺苷的制备方法， 该 方法包括采用节杆菌为生产菌， 并且在发酵培养 基中添加前体物质、 糖酵解途径抑制剂和 / 或三 羧酸循环激活剂， 经发酵获得环磷酸腺苷。 以及前 体物质、 糖酵解途径抑制剂和 / 或三羧酸循环激 活剂在采用节杆菌为生产菌经发酵制备环磷酸腺 苷中的用途。 本发明通过添加前体物质、 糖酵解途 径抑制剂和 / 或三羧酸循环激活剂， 抑制过量的 糖酵解， 增强磷酸戊糖途径流量， 同时加强三羧酸 循环， 重新合理地分配中心代谢途径的代谢流， 使 碳流更有效的流向目的产物 - 环磷酸腺苷， 有效 地利用碳源合成环磷酸腺。
3、苷。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102268476 A1/1 页 2 1. 一种环磷酸腺苷的制备方法， 该方法包括采用节杆菌为生产菌， 并且在发酵培养基 中添加前体物质、 糖酵解途径抑制剂和 / 或三羧酸循环激活剂， 经发酵获得环磷酸腺苷。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述节杆菌的保藏编号为 CGMCC No.3584。 3.根据权利要求1或2所述的制备方法， 其特征在于， 所述前体物质选自腺嘌呤、 腺苷、 腺苷单磷酸、 腺苷三磷酸、 肌苷、 肌。
4、苷酸和次黄嘌呤中的一种或多种。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 添加所述前体物质的浓 度为每升发酵培养基 0.001 100g， 优选为 1 15g。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述糖酵解途径抑制剂 选自氟化物、 碘乙酸、 柠檬酸和柠檬酸盐中的一种或多种。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 添加所述糖酵解途径抑 制剂的浓度为每升发酵培养基 0.001 10g， 优选为 0.05 1g。 7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 所述三羧酸循环激活剂 选自生物素、 VB1、 VB2、。
5、 VB3 和氯化钴中的一种或多种。 8.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 添加所述三羧酸循环激 活剂的浓度为每升发酵培养基 0.0001 1g， 优选为 0.001 1g。 9. 前体物质、 糖酵解途径抑制剂和 / 或三羧酸循环激活剂在采用节杆菌为生产菌经发 酵制备环磷酸腺苷中的用途。 10. 根据权利要求 9 所述的用途， 其特征在于， 所述节杆菌的保藏编号为 CGMCC No.3584。 11.根据权利要求9或10所述的用途， 其特征在于， 所述前体物质选自腺嘌呤、 腺苷、 腺 苷单磷酸、 腺苷三磷酸、 肌苷、 肌苷酸和次黄嘌呤中的一种或多种。 12.根据权利要求9。
6、至11中任一项所述的用途， 其特征在于， 所述糖酵解途径抑制剂为 氟化物、 碘乙酸、 柠檬酸和柠檬酸盐中的一种或多种。 13.根据权利要求9至12中任一项所述的用途， 其特征在于， 所述三羧酸循环激活剂选 自生物素、 VB1、 VB2、 VB3 和氯化钴中的一种或多种。 权 利 要 求 书 CN 102268469 A CN 102268476 A1/3 页 3 一种环磷酸腺苷的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种环磷酸腺苷的制备方法， 具体涉及一种采用节杆菌为生产菌， 并 且向发酵培养基中添加调节物质， 经发酵高产量获得环磷酸腺苷的方法。 背景技术 0002 环磷酸腺苷 (cAMP)。
7、 是人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质， 作为细 胞内的第二信使， 它对糖、 脂肪、 核酸、 蛋白质等的代谢和合成调节起着重要的作用。 临床上 可用于治疗心绞痛、 心肌梗死、 心肌炎及心源性休克 ； 对改善风湿性心脏病的心悸、 气急、 胸 闷等症状也有一定的作用 ； 可提高急性白血病结合化疗的疗效， 亦可用于急性白血病的诱 导缓解 ； 此外， 对老年慢性支气管炎、 各种肝炎和银屑病也有一定疗效。环磷酸腺苷也可作 为药物中间体制备二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲胺， 以提高脂溶性， 从而更有效的 发挥生理及药理作用。环磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加剂， 在离体条件下模拟生长激素 的作用， 。
8、促进畜禽生长， 增加优质禽产品的产量。 0003 在之前的发酵法制备环磷酸腺苷的过程中发现， 有机酸通过糖酵解途径被大量合 成， 大大降低了 cAMP 的生产效率。为了降低有机酸的产生， 重新分配代谢流以提高目的产 物的生产效率， Palme 通过批发酵过程中的底物流加策略降低了酸的形成， 并提高了产率。 Cameron 和 Tong 用代谢工程的方法改变细胞调控机制和代谢途径来抑制糖酵解途径。最 近， Chen 通过添加柠檬酸来抑制糖酵解途径， 加大了 HMP 途径的流量， 提高了肌苷的产量。 但是， 现有的生产环磷酸腺苷的发酵方法的产量还有待于进一步提高。 发明内容 0004 因此， 本发。
9、明的目的是提供一种提高发酵法生产环磷酸腺苷产量的方法。环磷酸 腺苷的合成涉及到糖酵解途径、 磷酸戊糖途径和三羧酸循环。为了有效地利用碳源合成环 磷酸腺苷， 过量的糖酵解流量必须被抑制， 磷酸戊糖途径流量须增强， 而同时三羧酸循环也 需得到加强。本发明通过添加前体物质、 糖酵解途径抑制剂和 / 或三羧酸循环激活剂， 重新 合理地分配中心代谢途径的代谢流， 使碳流更有效的流向目的产物 - 环磷酸腺苷。 0005 本发明的目的通过以下技术方案实现 ： 0006 一种环磷酸腺苷的制备方法， 该方法包括采用节杆菌为生产菌， 并且在发酵培养 基中添加前体物质、 糖酵解途径抑制剂和 / 或三羧酸循环激活剂，。
10、 经发酵获得环磷酸腺苷。 0007 在上述制备方法中， 优选地， 节杆菌的保藏编号为 CGMCC No.3584。即节杆菌 A302(Arthrobacter sp.)， 2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心 (CGMCC)， 保藏编号为 CGMCCNo.3584。 0008 前体物质可以选自腺嘌呤、 腺苷、 腺苷单磷酸、 腺苷三磷酸、 肌苷、 肌苷酸和次黄嘌 呤中的一种或多种。添加所述前体物质的浓度可以为每升发酵培养基 0.001 100g， 优选 为 1 15g。 0009 糖酵解途径抑制剂可以选自氟化物、 碘乙酸、 柠檬酸和柠檬酸盐中的一种或多种。 说 。
11、明 书 CN 102268469 A CN 102268476 A2/3 页 4 添加所述糖酵解途径抑制剂的浓度可以为每升发酵培养基 0.001 10g， 优选为 0.05 1g。 0010 三羧酸循环激活剂可以选自生物素、 VB1、 VB2、 VB3 和氯化钴中的一种或多种。添 加所述三羧酸循环激活剂的浓度可以为每升发酵培养基 0.0001 1g， 优选为 0.001 1g。 0011 本发明还提供了前体物质、 糖酵解途径抑制剂和 / 或三羧酸循环激活剂在采用节 杆菌为生产菌经发酵制备环磷酸腺苷中的用途。 0012 在上述用途中， 优选地， 节杆菌的保藏编号为 CGMCC No.3584。 。
12、0013 前体物质可以选自腺嘌呤、 腺苷、 腺苷单磷酸、 腺苷三磷酸、 肌苷、 肌苷酸和次黄嘌 呤中的一种或多种。所述前体物质的使用浓度可以为每升发酵培养基 0.001 100g， 优选 为 1 15g。 0014 糖酵解途径抑制剂可以选自氟化物、 碘乙酸、 柠檬酸和柠檬酸盐中的一种或多种。 所述糖酵解途径抑制剂的使用浓度可以为每升发酵培养基 0.001 10g， 优选为 0.05 1g。 0015 三羧酸循环激活剂可以选自生物素、 VB1、 VB2、 VB3 和氯化钴中的一种或多种。添 加所述三羧酸循环激活剂的使用浓度可以为每升发酵培养基0.00011g， 优选为0.001 1g。 0016。
13、 本发明人通过代谢流和关键节点分析认识到， 要使环磷酸腺苷得到高产， 使副产 物有机酸的浓度降低， 必须做到以下两点 ： 1. 降低糖酵解途径通量， 一方面可使代谢流发 生迁移， 使更多碳流流向磷酸戊糖途径途径， 为环磷酸腺苷提供更多的前体。另一方面， 可缓解糖酵解途径与三羧酸循环之间存在的碳源 “溢流” 现象， 减少副产物有机酸的形成。 2. 增大三羧酸循环通量， 一方面可以为环磷酸腺苷提供更多的前体天冬氨酸 ； 另一方面， 可与高通量的糖酵解途径相匹配， 在减少有机酸的形成的同时降低葡萄糖的浪费。 0017 本发明的有益效果如下 ： 0018 1、 前体物质的添加使节杆菌通过补救合成途径合。
14、成环磷酸腺苷， 消耗了大量积累 的磷酸核糖焦磷酸， 使磷酸戊糖途径大大增强， 从而提高了环磷酸腺苷的产量。 0019 2、 糖酵解抑制剂的添加， 使该途径的众多关键酶， 如磷酸果糖激酶、 3- 磷酸甘油醛 脱氢酶、 烯醇化酶受到抑制， 糖酵解途径代谢流量降低的同时增大了磷酸戊糖途径的通量， 从而提高了环磷酸腺苷的产量。 0020 3、 三羧酸循环激活剂的添加， 使涉及该途径的众多关键酶， 如丙酮酸羧化酶、 丙酮 酸脱氢酶、 - 酮戊二酸脱氢酶等得到激活， 加速了三羧酸循环， 为 cAMP 提供更多的前体天 冬氨酸， 同时可与高通量的 EMP 途径相匹配， 减少有机酸的形成。 0021 生物材料。
15、的保藏 0022 节杆菌 A302(Arthrobacter sp.)， 2010 年 1 月 18 日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 (CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究 所 )， 保藏编号为 CGMCC No.3584。 具体实施方式 0023 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 说 明 书 CN 102268469 A CN 102268476 A3/3 页 5 0024 实施例 1 0025 发酵培养基为在普通培养基 ( 基于培养基的重量百分比计， 包含葡。
16、萄糖 5， K2HPO41， KH2PO41， MgSO41， 尿素 0.5， 蛋白胨 0.5 ) 的基础上每升培养基添加 0.1g NaF、 0.1g VB1 和 5g 次黄嘌呤。 0026 培养方法 ： 将节杆菌 A302 接入种子培养基 ( 基于培养基的重量百分比计， 包含葡 萄糖 1， 蛋白胨 1， 酵母膏 0.5， 牛肉膏 1， NaCl 0.3 ) 中， 初始 pH 为 7.0， 在 30、 240rpm下培养18小时。 10的接种量接入5L发酵罐中的发酵培养基中， 以NaOH控制pH为 7.0， 溶氧控制为 30， 400rpm、 30下发酵 72 小时。放罐时， 环磷酸腺苷的产。
17、量是 10.2g/ L， 比仅利用普通培养基时的产量 (2.4g/L) 提高了 3.25 倍。 0027 实施例 2 0028 发酵培养基为在普通培养基 ( 同实施例 1) 的基础上每升培养基添加 6g 次黄嘌 呤。培养方法同实施例 1。放罐时， 环磷酸腺苷的产量是 4.6g/L， 比仅利用普通培养基时的 产量 (2.4g/L) 提高了 0.92 倍。 0029 实施例 3 0030 发酵培养基为在普通培养基 ( 同实施例 1) 的基础上每升培养基添加 0.2g 氟化 钠。培养方法同实施例 1。放罐时， 环磷酸腺苷的产量是 3.2g/L， 比仅利用普通培养基时的 产量 (2.4g/L) 提高了。
18、 0.33 倍。 0031 实施例 4 0032 发酵培养基为在普通培养基 ( 同实施例 1) 的基础上每升培养基添加 0.1g 碘乙 酸、 0.1g VB1 和 5g 次黄嘌呤。培养方法同实施例 1。放罐时， 环磷酸腺苷的产量是 3.2g/L， 比仅利用普通培养基时的产量 (2.4g/L) 提高了 0.33 倍。 0033 实施例 5 0034 发酵培养基为在普通培养基 ( 同实施例 1) 的基础上每升培养基添加 0.5g/L 碘乙 酸、 0.1g 生物素和 3g 肌苷。培养方法同实施例 1。放罐时， 环磷酸腺苷的产量是 5.2g/L， 比 仅利用普通培养基时的产量 (2.4g/L) 提高了。
19、 1.17 倍。 0035 实施例 6 0036 发酵培养基为在普通培养基 ( 同实施例 1) 的基础上每升培养基添加 0.1g 柠檬 酸、 0.05g VB2 和 4g 腺嘌呤。培养方法同实施例 1。放罐时， 环磷酸腺苷的产量是 2.8g/L， 比仅利用普通培养基时的产量 (2.4g/L) 提高了 0.06 倍。 0037 实施例 7 0038 发酵培养基为在普通培养基 ( 同实施例 1) 的基础上每升培养基添加 0.3g 氟化 钠， 1g VB3 和 8g 腺苷。培养方法同实施例 1。放罐时， 环磷酸腺苷的产量是 9.2g/L， 比仅利 用普通培养基时的产量 (2.4g/L) 提高了 2.83 倍。 0039 实施例 8 0040 发酵培养基为在普通培养基 ( 同实施例 1) 的基础上每升培养基添加 0.6g 柠檬 酸， 0.1g 氯化钴和 10g 肌苷酸。培养方法同实施例 1。放罐时， 环磷酸腺苷的产量是 7.2g/ L， 比仅利用普通培养基时的产量 (2.4g/L) 提高了 2 倍。 说 明 书 CN 102268469 A 。