用于反相离子对高效液相层析分离核酸的单片基质 【发明领域】
本发明涉及生物-有机分子的分离。具体地说，本发明提供一种单片聚合物基质，用于以反相离子对的层析分离多核苷酸。
【发明背景】
近年来，多核苷酸分离的重要性与日俱增。分离样品中所含的多核苷酸可用于，例如扩增反应产物DNA的检测和/或定量，和检测各种DNA(如多态性或突变)。然而主要由于这种分子的复杂结构和分子量大，至今没有一种分离技术是让人完全满意的。
通常，多核苷酸的分离是用电泳技术进行的，如平板凝胶电泳，或最近的毛细管电泳。一般而言，这些方法包括将电流通过，已注入含有感兴趣的物质的混合物的介质。每种分子以不相同的速度穿过该介质，取决于它的电荷数和分子大小。但这些电泳方法也有一些缺点。例如，平板凝胶电泳的缺点是速度相对慢、检出样品困难、定量差和费人力。虽然毛细管电泳的速度较快且消耗的人力也较少，但由于毛细管性能的改变，分离不能再现且定量也差。
液相层析是电泳分离方法的替代方法。通常，液相层析方法依赖于液态流动相和固定相之间分配性质的差异，据此分离混合物中的成分。由柱形管或其它支持物固定固定相，流动相则携带样品通过。被强分配入固定相的样品成分在柱中停留较多时间，并与主要呆在流动相中且较快通过柱的成分分开。各组分从柱上洗脱后，它们可用检测器定量和/或收集作进一步分析。
以下为典型地用于液相层析的固定相和它们与溶质的相互作用：名称固定相相互作用大小排阻层析多孔惰性颗粒样品按其在溶液中的大小分开；不同大小地分子通过柱的总渡越时间不同。离子交换层析树脂上的离子基样品离子与填料上已有的离子化基团上的离子交换；保留时间取决于处于该位的不同离子的亲和力和溶液的其它参数(pH、离子强度、抗衡离子类型等)反相层析树脂上的非极性基团按与固定相之间的疏水相互作用分离样品
虽然液相层析较电泳分离方法有若干优点，但它也有自己的缺陷。大小排阻层析的缺点是分离度低，如典型地为了得到可以接受的分离度，DNA分子大小的差异必须为50-100％。虽然离子交换层析的分离度较高，但它按DNA序列组成受异常洗脱顺序的影响。而且离子交换层析中，洗脱的DNA常常受不挥发的缓冲液的严重污染，使样品的回收非常复杂。反相层析的分离度相对较高，但除非用直径特别小的颗粒作为固定相，否则它不能高速进行。用于反相层析的二氧化硅基颗粒使速度非常慢，而且在高pH条件下不稳定。聚合物颗粒不能提供样品成分的高回收或高分离速度。
特别对DNA分离而言，已有的反相离子对高效液相层析(RP-IP HPLC)有限地缓解了上述部分问题。例如，RP-IP HPLC避免了带强阴离子交换剂的填料床中常常遇到的异常洗脱顺序。在RP-IP HPLC中，固定相通常是由装料到柱中的带疏水表面基团的分散颗粒形成的。洗脱液含有阳离子物质，如三乙铵离子(0.1M)，能与DNA上的带负电荷的磷酸基团相互作用，也可与柱上颗粒的疏水表面相互作用。因此，阳离子物质可视为DNA和柱之间的桥梁分子。由于流动相可制成逐渐更加有机的，如乙腈的浓度递增，可按大小洗脱DNA片段。
尽管RP-IP HPLC用于DNA的分离有优点，这种方法仍然具有所有液相层析方法(将小颗粒如小珠，装入柱管中形成柱床)通常所遇到的问题。例如，颗粒分离介质的生产是复杂而耗时的。一旦制备好，将很难以可重现的和高效的方式将颗粒装入柱中。具体地说，很难填装小直径的高效柱，如直径小于1mm的柱。具有非圆截面的柱，如多边截面(如薄层或矩形)，尤其难从颗粒填料制备出来。同样，由于填料的移动和小槽或空洞的形成，填充小珠的柱也可能失去功效。另一缺陷是，用小颗粒通常导致高的柱工作压力，使柱管、泵、进样器和其它能含流体的组件的压力达到3,000psi或以上。
最近的层析理论表明，对于装颗粒的柱床而言，分离效率由样品分子到固定相的物质转移的扩散距离决定。这种效应易于按用于该柱床的颗粒的已知的几何形状建立模型。按这种理论，当固定相的孔直径至少是待分离的分子的Stoke直径的3倍时，有最大分离度。这种理论是基于这样的假定，即分子将通过扩散过程被送递到固定相，而较小的孔会阻碍扩散。对于DNA分离而言，这意味着对于大小为1,000个碱基对的样品，将需要孔径至少为1微米。需要如此大的孔实际上免除了用多孔颗粒材料来装填分离DNA的支持物，因为这些基质缺少高效液相层析操作压力所需的物理强度。
与多孔填料相比，由于降低了扩散距离，无孔颗粒材料特别适用于DNA的分离。对于无孔填料，以填料柱床的填隙大小确定孔径。填隙大小约为球形填料颗粒直径的1/3。为了避免捕获或剪切较大DNA分子，需要对孔径的下限作出规定。当通过用较大的颗粒时，导致效率的丧失，可定出上限。用较大的颗粒进行分离是有利的，因为只需较低的操作压力，但分离效率的降低是非常显著的。
另一缺陷是，仅在密度接近约为0.4的间隙孔隙度时，才可将球形填料装成稳定的柱床。虽然更为不确定，但在孔隙度约0.4时也可将非球形填料最佳填装。此外，填装颗粒柱床有固定的表面积、固定的间隙距离和固定的压降(由填料的颗粒直径决定)。由于DNA每1,000个碱基对长度的物理大小约为0.34微米，且当间隙距离是待分离分子的Stoke直径的3-10倍时效率最高，则为1,000个碱基对DNA设计的柱所需的间隙距离为1-3微米。以3-10微米直径填料的柱可以提供这种间距。用3微米填料装填的柱使用时操作压力高，而用10微米填料装填的柱由于较长的扩散路径而效率有限，而且由于表面积的减少结合能力也较低。当柱用非常小的颗粒(如直径为1微米)填充时，可用于长度至多为300个碱基对的样品，柱操作压力会非常高，且大于300个碱基对的DNA会被剪切或捕获。典型的装填小珠的柱用直径为2.1微米的颗粒，且典型使用下的操作压力很高。
上述关于填装颗粒柱床的理论对于预测连续单片柱床中大分子的表现不是特别有用的，其中物质的转移是扩散和对流过程的组合。
本发明涉及用于分离含多核苷酸的混合物的单片柱床，它部分基于这样的发现，即单片能提供相应于使用大颗粒固定相的低压力降，同时能维持装填小球形颗粒柱的分离度。更具体地说，已发现反相单片基质能提供改良的方法来高速分离DNA分子，而且与已有的方法相比这种分离可在大大降低的操作压力下进行并得到高分离度。这一惊人的发现使得在原先不可能的条件下进行高分离度的多核苷酸分离。另外，本发明的单片柱可用几何结构明显区别于填料柱床的固定相构建。这种新型几何形状对大分子的分离作用是不能用现有层析理论来预测的。
本发明的单片柱能提供先前多核苷酸分离(即烷基化无孔聚合物小珠装填的柱床)最好技术的所有优点，且无需繁重地制备小珠并将它们装填到高效柱中。本发明的柱用简单的方法将可制备，且一旦制备好就不会因为柱床的移动而失效，因为其中没有会漂移位置的单个小珠。
除了改善的这种新型柱的易于制造和没有小珠移动以外，本文所述的单片柱比已有技术提供令人惊讶的优点，当操作压力规度化时，它们比填装小珠的柱预计的分离度至少好58％。
发明概述
本发明的一方面提供一种分离含至少一种多核苷酸(如DNA和/或RNA)混合物的方法。按本方法，将混合物通过由支持物以固定方式固定的单片聚合物基质。由离子对反相层析分离混合物。
在一实例中，单片聚合物基质带有疏水表面基团。单片聚合物基质可由(至少部分)选自以下的聚合物构成：聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯。在一实例中，聚合物是聚甲基丙烯酸酯。
在一实例中，单片聚合物基质是自聚合混合物形成的，该混合物包括疏水单体、交联剂和成孔剂(porogen)。成孔剂可以是(ⅰ)成孔(porogenic)溶剂，(ⅱ)成孔溶剂的混合物，或(ⅲ)一种或多种含至少一种形成孔形的聚合物调节剂成孔溶剂。疏水单体可以是甲基丙烯酸烷酯。
在一实例中，本方法包括将含有离子配对剂的洗脱液通过单片基质。在为合理压力的驱动力下(如约小于5,000psi)进行分离。
对于支持物，在一实例中使用带圆形截面的柱管。另一实例中使用为非圆形(如多边形截面)的柱管。
在另一实例中使用平板作为支持物。单片聚合物基质可充满在平板上形成的小槽或其可在平板上形成薄层。
另一实例中使用芯片(如用半导体领域中所用的方法制造)作为支持物。在该实例中，将基质固定在芯片上形成的微型槽中。在一相关实例中，在芯片上形成多个微型槽，且多重分离是以在芯片上的同时进行模式进行的。
本发明另一方面提供一种层析装置，包括带有大孔单片甲基丙烯酸基聚合物基质的支持物。在一实例中，聚合物基质具有能与离子配对剂的疏水基团相互作用的疏水表面，从而通过反相离子对层析分离多核苷酸。聚合物基质具有相对高的孔隙度(如约大于0.6)。
本发明的另一方面是提供一种通过反相离子对层析分离多核苷酸的试剂盒。
在一实例中，试剂盒包括：(ⅰ)聚合混合物，其包括带疏水表面基团的单体、交联剂和成孔剂；和(ⅱ)能与多核苷酸的带负电荷的磷酸根和单体的疏水表面基团相互作用的离子配对剂。
在另一实例中，试剂盒包括：(ⅰ)带疏水表面基团的单片聚合物基质由支持物固定在固定相中；和(ⅱ)能与多核苷酸的带负电荷的磷酸根和单体的疏水表面基团相互作用的离子配对剂。
从以下公开中可进一步明了本发明的这些以及其它特征和优点。
附图简述
参考以下描述以及附图将很好地理解本发明的结构、方式以及目的和优点，附图为：
图1为用按本发明实例构建的C6单片柱分离长度为12一18单元的寡胸苷酸的色谱图。
图2A为用按本发明实例构建的C12单片柱分离双链DNA片段的色谱图。
图2B为用于比较的色谱图显示的结果；在填装2.1微米无孔小珠的柱中进行与图2A类似的双链DNA片段的分离。
图3A为用按本发明实例构建的多孔单片C12柱分离长度为304碱基对的同质双链DNA片段的色谱图。
图3B为用按本发明实例构建的多孔单片C12柱回上分离含与图3A相同类型的同质双链DNA片段以及各种含单碱基对取代的序列的混合物的色谱图。
定义
本文所用的“多核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的多聚物，可以是单链或双链，可以含有能够结合入DNA或RNA聚合物的合成的、非天然的或改造过的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。多核苷酸可具有三维结构，可任选地被部分或全部变性。以下为多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段(如限制性片段)、外显子、内含子、信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
本文所用的术语“柱”指一种装置，该装置无论柱床的物理截面或尺寸为何，流动相都穿透过固定柱床。
柱床的“渗透率”是大直径孔的丰度的量度。
发明详述
本发明优选实施例的以下讨论仅起示范作用。此外，这些讨论对本发明的范围、本发明的申请或本发明的使用无任何限制。
本发明提供一种用于分离生物有机分子的单片柱床及其制造和使用方法。
本发明的柱是从聚合混合物制备的，在一实例中，其包括(1)单体、(2)交联剂和(3)成孔剂(如成孔溶剂或成孔成分的混合物)。在一实例中，将混合物置于适合形状的模具中，并用聚合引发剂作用触发聚合反应，其最终收获大孔聚合物基质，在合理压力(如小于5,000psi)的驱动力下其所含的孔隙度可使液体通过基质。
选择单体或单体组合，从而聚合基质包括可与多核苷酸相互作用的表面基团，以提供离子对层析为基础的分离。在一优选实例中，用带疏水表面基团的品种作为单体。任选地，可修饰单体以显示出所需的疏水度。例如，可用本领域已知的方法，将适合的配体共价连于单体，以改善其作为反相层析介质的有效性。另外或补充有，可处理聚合基质本身，以得到所需的疏水度。如果为聚合混合物所选的单体或单体组合不具有所需的疏水特性，则需要添加适当的配体(如脂族表面基团)进行处理，从而使柱可用于反相分离。
在一实例中，用于聚合混合物的单体至少带有一种类型能作为反相层析疏水基团的烷基。优选的烷基是含3-30个碳原子的烷基，更佳的是含4-18个碳原子的烷基。用于进行本发明的单体例子包括甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸辛酯和甲基丙烯酸十二烷酯。本发明还打算使用苯乙烯单体。
可将任何本领域技术人员已知的适当交联剂用于形成本发明的单片基质。优选的交联单体至少含有两个碳碳双键(存在引发剂时能聚合)。交联单体的例子包括二乙烯基苯、丁二烯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)等。
可以理解一种物质可既作为单体又作为交联剂。例如，疏水交联剂将可同时有这两种作用。从这一角度看，本发明的一实例打算用TRIM作为聚合混合物中唯一的单体且也是唯一的交联剂。
通常聚合混合物中存在的单体或单体组合的量约为20-80vol.％，更佳的是约为35-50vol.％。
可将常规的产游离基的聚合反应引发剂用于引发聚合反应。适合的引发剂例子包括过氧化物，如OO-t-戊基-O-(2乙基己基)单过氧化碳酸酯、二丙基过氧化二碳酸盐和过氧苯甲酰，以及偶氮化合物，如偶氮二异丁腈、2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐和2,2’-偶氮二(异丁酰胺)二水合物。引发剂在聚合化合物中存在的量通常约占单体重量的0.1-2％。
可从各种不同类型的材料中选择成孔剂。成孔剂可以是(ⅰ)单种成孔溶剂，(ⅱ)成孔溶剂的混合，或(ⅲ)一种或多种含至少一种可形成孔的聚合添加剂的溶剂。适合的液态成孔剂包括脂肪烃、芳香烃、酯、醇、酮、醚、可溶性聚合物溶液和上述的混合。成孔溶剂的例子包括异辛烷、含各种百分比2-辛酮的异辛烷，甲苯或丙酸乙酯(ethyl proprionate)。能形成孔的聚合添加剂的例子包括聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。成孔剂在聚合化合物中通常存在的量约为20-80vol％，更佳的是50-65vol％。
对于TRIM基聚合混合物，例如用纯异辛烷作为成孔溶剂将产生高度渗透单片。较低的渗透率可从，例如在异辛烷中添加5-20％其它溶剂，如2-辛酮、甲苯和/或丙酸乙酯获得。增加疏水单体与交联剂的比例，和减少混合物中成孔溶剂的比例，将降低渗透率。另外，对引发剂的选择也可作为控制孔分布的手段。
在一说明性实例中，从含有甲基丙烯酸烷酯、烷烃成孔溶剂或成孔成分混合物、和游离基引发剂的聚合混合物制备单片基质。例如，可用三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸烷酯、异辛烷和偶氮二异丁腈制备聚合混合物。将混合物倒入空的HPLC柱管中、加盖，在65-70℃聚合8-24小时。然后将端部接头安装在聚合的基质上，再用溶剂冲洗以除去未反应的成分。
按本发明构建的典型单片柱的孔范围为少于5,000-10nm。可用大DNA和/或显微镜观察测定较大孔的尺寸。例如，可用本发明的柱来分离长度为2,072、2,647和3,147碱基对的DNA产物。最大的相应于至少为1微米的分子尺寸。因此，期望用于分离这种DNA的单片柱包括直径至少为1微米的孔。这与渗透率计算相一致，其得出表观颗粒直径为6微米或孔尺寸约为2微米。显微镜观察显示本发明的典型基质包括直径约1-2微米的小珠，其融合入孔尺寸范围为1-5微米的连续结构上。这与以渗透率和DNA片段层析为基础计算的孔尺寸相一致。
也可用本发明的柱来分离小至约17个碱基对的DNA。相对较小的长度为100个碱基对的DNA的大小约为34nm。因此，对于大小为待分离DNA分子长度高达至少170倍的孔的柱，可以保持本发明可实现的高分离度。不希望束缚于具体的理论，这种不寻常的特性说明了本发明柱的低操作压力。
一旦制备，如通过梯度或等度液相层析，本发明的单片基质就可用于分离生物有机分子。在一示范使用中，将如上制备的本发明的柱用于含多核苷酸样品的分离。在一实例中，在梯度液相层析中用含离子配对剂的水和乙腈来洗脱注入柱中的多核苷酸。
本发明可用常规的能与核酸形成离子对的离子配对剂。适用于本发明的离子配对剂包括阳离子疏水品种，如有机或无机酸的烷基铵盐，例如四甲基、四乙基、四丙基和四丁基铵的乙酸盐、卤化物等。与其它相比，二甲基丁基铵、二甲基己基铵、二甲基环己基铵和二异丙基铵的乙酸盐是有效的离子配对剂。发现TEAA(三乙基乙酸铵)是甲基丙烯酸酯和苯乙烯基柱特别有用的离子配对剂。发现溴化四丁铵是分离长度至多为1,000碱基对的DNA片段的有效离子配对剂。
可将各种支持结构用于本发明的单片基质。例如，一实例打算用增长的柱管。另一实例中，将单片基质固定在毛细管的管腔上。在这些实例中，基质横穿整个管的截面。管的截面可以是任何形状，如圆形、多边形或其它形状。可在管内就地聚合单片基质，或也可在管外形成，然后再用适当的方法将其引入。
在其它实例中，单片基质是(ⅰ)固定在平板的槽或沟中的，或(ⅱ)作为薄膜施加到平板上。虽然可在任何尺寸和由任何适当的材料构成的基片或支持片上提供本发明的单片，但本发明一个实例打算使用标准尺寸的支撑片，它可用常规材料和方法制造。因此，在该实例中，优选的是注模的矩形塑料平板，其长度和宽度适合于常用的5.030"×3,365"(127.76mm和85.47mm)标准。类似地，当单个平板可支撑合理数量的位点时，相应于常规所用的“96-孔”微量滴定板模式的结构是优选的。因此，一优选的结构包括在标准尺寸的支撑板上有8×12列位点。每个位点上可支撑一个或多个独立的单片。支撑板上的位点的位置和间距也可以是标准的(如中心与中心的距离为9mm)。如果需要，底板框的标准外尺寸、以及底板上位点的标准间距，能便利用已有的装置(如自动加料器或光读出器)来使用该板。应该知道，这种装置能同时进行多个平行的分离。
另一实例中，用单片基质填装微芯片上的一个或多个槽。例如，用标准微型制造方法(如光刻法和湿化合物腐蚀法)在玻璃微芯片基片上形成多个槽。任选地，可在基片的槽上直接粘合一盖片。在单个基片芯片上可以基本平行的方式进行多重样品的多重分离。
本发明的优点并不限制于填料床的固定的表面积、压降和填隙式扩散的间距。因为单片柱的孔隙度可比本文所述高许多，所有这些因子都可由具体应用进行改善。例如，可制造具有相同孔隙度但压降大大不同的柱，或具有相同压降但间隙距离不同的柱。在具体实例中，一些本发明制造的能很好用于DNA分离的柱的孔隙度约为0.7。用非连续颗粒填料制造的无孔填料不能得到0.7的孔隙度。
实施例
实施例仅起说明作用，对本发明的范围无任何限制。
实施例1
分离单链寡核苷酸
制备含1.0ml三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、0.32ml甲基丙烯酸己酯、2.4ml异辛烷和约20mg偶氮二异丁腈的混合物，并将其注射入空的4.6mm ID×5cm长HPLC柱管(一端用端接头和塞子封住)。在另一端用端接头和塞子封住装好料的管，然后在65℃的水浴中浸泡过夜。反应后，除去塞子和端接头，装上带聚乙烯多孔片的端接头。用四氢呋喃冲洗整个柱。
图1是用上述结构的C6单片柱分离单链寡胸苷酸的色谱图。具体地说，样品是10微升长度为12-18单元之间的寡胸苷酸。以2ml/分钟的流速、0-12％乙腈(用100mM乙酸三乙铵水溶液、10mMEDTA二钠、pH7.0配制)梯度来洗脱寡核苷酸。用254nm UV吸光度测定。在分离过程中观察到的HPLC系统的压力非常低，仅150psi。
实施例2
分离双链DNA
制备含1.25ml三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、0.30ml甲基丙烯酸十二烷基酯、2.6ml 95％异辛烷和5％甲苯的混合液和17mg偶氮二异丁腈的混合物，并将其注射入空的4.6mm ID×5cm长HPLC柱管(一端用端接头和塞子封住)。在另一端用端接头和塞子封住装好料的管，然后在65℃的水浴中浸泡过夜。反应后，除去塞子和端接头，装上带聚乙烯多孔片的端接头。用四氢呋喃冲洗整个柱。
图2A是用上述结构的单片C12柱分离双链DNA片段的色谱图。具体地说，样品是3微升pUC 18 DNA(用MSP I限制性内切酶消化)。以1.0ml/分钟的流速、35-60％含20mM溴化四丙铵的乙腈(用20mM溴化四丙铵水溶液、2mMEDTA二钠、pH7.0配制)的10分钟梯度来洗脱DNA片段。用254nm UV吸光度测定。在0.5ml/分钟观察到为50psi的HPLC系统压力。计算图2A箭头处峰的分离度。
为了比较，用填装无孔聚合物球体的柱进行类似的分离。在这种情况中，图2B是在填装2.1微米无孔小珠的柱中进行的双链DNA片段的分离。在该比较实验中，样品是3微升pUC 18DNA(用MSP I限制性内切酶消化)。以0.5ml/分钟的流速、10分钟8.75-15％乙腈(用100mM乙酸三乙铵水溶液、10mMEDTA二钠、pH7.0配制)梯度来洗脱DNA片段。用254nm UV吸光度测定。在0.5ml/分钟观察到为1340psi的HPLC系统压力。计算图2B箭头处峰的分离度。
表1中列出了上述实验的色谱数据。图2A单片柱被标记峰的分离度是4.04，图2B中被标记的峰的分离度是5.83。用标准渗透率计算方法(现代液相层析导论，第二版，L.R.Snyder和J.J.Kirkland,John Wiley和Sons,NewYork,1979，第37页)，可以计算出图2A柱的操作压力与填装直径为6.22微米的球体的柱相当，而图2B中的柱则与填装直径为1.20微米的球体的柱相当。基于这些不同的有效颗粒尺寸，图2A柱的分离度比预计的大58％。色谱分离值的临界优值表示每单位压力的效率或分离度。从表1可看出，与填装无孔球体的柱相比，单片柱提供的每单位压力的分离度增大了一个数量级。
表1填装无孔颗粒的柱C12单片聚合物的柱峰1的保留时间(分钟)6.80 9.36峰1的面积(μV×秒)80678.00 85692.00峰1的高度(μV)11370.00 7438.00峰2的保留时间(分钟)7.52 10.10峰2的面积(μV×秒)103115.00 103644.00峰2的高度(μV)13348.00 9779.00分离度5.83 4.04柱压(psi)1340.00 100.00表观颗粒尺寸(μm)1.20 6.20期望分离度5.83 2.57超额分离度％0.00 58.00分离度/1,000psi4.35 40.42
实施例3
部分变性的双链多核苷酸的分离
本发明也可分离部分变性的双链多核苷酸。如图3A和3B所示，用多孔单片柱来分离长度为304个碱基对的DNA片段。在图3A中，样品含一种类型DNA，图3B中的样品含图3A中的类型和一含单个碱基取代的变异序列的混合物。在确定的温度，图3B样品显示出第二个峰，表明含单个碱基取代的部分变性DNA。
具体地说，在表3A中，长度为304个碱基对的同质双链DNA在如上制备的单片12柱上分离。表2列出了进行此分离的条件，如下：
表2流动相：A：20mM溴化四丙铵+2mMEDTA二钠(用水配制)，pH7.0B：用乙腈配制的20mM溴化四丙铵梯度：50-65％B在A中(为时7分钟)流速：0.75ml/分钟分离温度：43℃探测：UV,254nm
用类似的条件观察得到图3B的数据，但所含的样品除图3A的304碱基对的同质双链DNA外，还包括带单个碱基取代的变异异源双链DNA。图3B中的带箭头的峰表示该变异DNA的存在。
对比实施例A
Frechet等人的美国专利No.5,334,310中提示与填装有颗粒材料的柱床相关的上述问题的一个解决方法是用连续柱床来分离大分子。但，’310专利没有提供任何细节或指导能选择适当的基质，从而用最先进的方法、RP-IPHPLC分离DNA。
为了比较，按’310专利中的实施例Ⅲ和Ⅵ制备柱。简单地说，这些实施例公开了呈疏水特性的单片柱。将这些组合物聚合后，装上端接头，用甲醇冲洗柱(如’310专利所公开的)。用’310专利实施例Ⅲ制备的组合物呈半透明外观，极高的操作压力(用甲醇在0.25ml/分钟时大于2.000psi)，不能用于DNA的HPLC。用’310专利实施例Ⅵ制备的组合物是白色的，操作压力相对较低。但这种柱在反相离子配对条件下不能用于分离DNA限制性内切片段。在用本发明的基质能得到有用分离的条件下进行分离时，没有观察到典型的峰型。这些发现与上述文献中所述相一致：未修饰的聚苯乙烯/二乙烯基苯结构的柱不适用于DNA分离。
由以上所公开的本领域技术人员可理解本发明的方法可用各种形式实施。因此虽然本发明的公开附带优选实例和实施例，但并未限制本发明的真正范围。各种改变和改进都在附加权利要求书所限定的本发明范围中。