技术领域
本发明涉及一株鼠李糖乳杆菌及其在制备抗抑郁产品中的应用。
背景技术
抑郁症是一种常见的、复杂的、可能危及生命的精神疾病。到目前为止，抑郁症的发病机理还没有完全阐述清楚，但是经过大量科研人员的共同努力，发现抑郁症的发生是由于复杂的信号网络的改变而引起的，这些网络覆盖单胺神经递质系统、神经内分泌系统、神经营养因子、神经发生、免疫系统的改变和表观遗传修饰等等，而遗传因素对抑郁症的发病机制也有相当大的贡献。
目前临床上治疗药物的开发主要基于“单胺假说”，这类药物对部分抑郁症患者(20-30％)无疗效，因此寻找更有效、更快速的预防和辅助治疗抑郁症的方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一株鼠李糖乳杆菌及其在制备抗抑郁产品中的应用。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌TF318，全称为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)TF318，已于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018113。
本发明还保护鼠李糖乳杆菌TF318在制备抗抑郁产品中的应用。
本发明还保护鼠李糖乳杆菌TF318在制备治疗抑郁症的产品中的应用。
本发明还保护鼠李糖乳杆菌TF318在制备预防抑郁症的产品中的应用。
本发明还保护鼠李糖乳杆菌TF318在制备产品中的应用；
所述产品的功能为如下(a1)至(a20)中的至少一项：
(a1)升高单胺类神经递质含量；
(a2)升高脑组织中单胺类神经递质含量；
(a3)降低炎症因子含量；
(a4)降低血清中炎症因子含量；
(a5)降低丙二醛含量；
(a6)降低脑组织中丙二醛含量；
(a7)降低超氧化物歧化酶含量；
(a8)降低脑组织中超氧化物歧化酶含量；
(a9)降低皮质酮含量；
(a10)降低脑组织中皮质酮含量；
(a11)升高抑郁症患者单胺类神经递质含量；
(a12)升高抑郁症患者脑组织中单胺类神经递质含量；
(a13)降低抑郁症患者炎症因子含量；
(a14)降低抑郁症患者血清中炎症因子含量；
(a15)降低抑郁症患者丙二醛含量；
(a16)降低抑郁症患者脑组织中丙二醛含量；
(a17)降低抑郁症患者超氧化物歧化酶含量；
(a18)降低抑郁症患者脑组织中超氧化物歧化酶含量；
(a19)降低抑郁症患者皮质酮含量；
(a20)降低抑郁症患者脑组织中皮质酮含量。
所述单胺类神经递质为5-羟色胺和/或多巴胺和/或去甲肾上腺素。
所述炎症因子为TNF-α和/或IL-1β和/或NO。
所述产品为食品、保健品或药品。
本发明还保护一种抗抑郁产品，其活性成分为鼠李糖乳杆菌TF318。
本发明还保护一种治疗抑郁症的产品，其活性成分为鼠李糖乳杆菌TF318。
本发明还保护一种预防抑郁症的产品，其活性成分为鼠李糖乳杆菌TF318。
本发明还保护一种产品，其活性成分为鼠李糖乳杆菌TF318。
所述产品的功能为如下(a1)至(a20)中的至少一项：
(a1)升高单胺类神经递质含量；
(a2)升高脑组织中单胺类神经递质含量；
(a3)降低炎症因子含量；
(a4)降低血清中炎症因子含量；
(a5)降低丙二醛含量；
(a6)降低脑组织中丙二醛含量；
(a7)降低超氧化物歧化酶含量；
(a8)降低脑组织中超氧化物歧化酶含量；
(a9)降低皮质酮含量；
(a10)降低脑组织中皮质酮含量；
(a11)升高抑郁症患者单胺类神经递质含量；
(a12)升高抑郁症患者脑组织中单胺类神经递质含量；
(a13)降低抑郁症患者炎症因子含量；
(a14)降低抑郁症患者血清中炎症因子含量；
(a15)降低抑郁症患者丙二醛含量；
(a16)降低抑郁症患者脑组织中丙二醛含量；
(a17)降低抑郁症患者超氧化物歧化酶含量；
(a18)降低抑郁症患者脑组织中超氧化物歧化酶含量；
(a19)降低抑郁症患者皮质酮含量；
(a20)降低抑郁症患者脑组织中皮质酮含量。
所述单胺类神经递质为5-羟色胺和/或多巴胺和/或去甲肾上腺素。
所述炎症因子为TNF-α和/或IL-1β和/或NO。
所述产品为食品、保健品或药品。
以上任一所述食品可为但不限于：含有发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其它食品。所述食品具体可为功能性食品，例如功能性酸奶、功能性菌剂等。
以上任一所述药品可为但不限于如下剂型：胶囊、粉剂、片剂。所述药品还可包括其他药学上可以接受的赋形剂或稀释剂。制备粉剂的方法可为冷冻干燥或其它工艺。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌TF318具有抗抑郁功能，可作为预防和治疗抑郁症的功能性益生菌，为临床干预和控制抑郁症等相关的精神类疾病提供新的思路，具有良好的产业前景。
附图说明
图1为实施例3的步骤四的结果。
图2为实施例3的步骤五的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
清洁级ICR雄性小鼠(18-22g)：长春生物制品研究所。饲养环境：23±2℃，湿度50％-75％，自由摄取基础饲料和纯净水。基础饲料：长春生物制品研究所。
乳杆菌选择性培养基(LBS琼脂)：青岛海博生物技术有限公司，货号HB0385-1。
利血平注射液(规格1mg/ml)：广东邦民制药厂有限公司。
盐酸氟西汀胶囊：苏州中化药品工艺有限公司。
小鼠多巴胺(DA)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒：上海江莱生物科技有限公司，货号JL-F11187。小鼠去甲肾上腺素(NE)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒：上海江莱生物科技有限公司，货号JL-F13969。小鼠5-羟色胺(5-HT)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒：上海江莱生物科技有限公司，货号JL-F12087。小鼠一氧化氮(NO)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒：上海江莱生物科技有限公司，货号JL-F17342。小鼠丙二醛(MDA)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒：上海江莱生物科技有限公司，货号JL13329。小鼠超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒：上海江莱生物科技有限公司，货号：JL12237。小鼠皮质酮(CORT)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒：上海朗顿生物科技有限公司，货号：BPE30590。Mouse TNF-αELISA MAXTM Deluxe，美国biolegend公司，货号：430904。Mouse IL-1βELISA MAXTM Deluxe，美国biolegend公司，货号：432604。
鼠李糖乳杆菌JAAS8是吉林省农业科学院畜产品加工团队于2007年从酸菜中分离得到的益生菌，该菌株可以分泌大量的胞外多糖和荚膜多糖。参考文献：Capsular and slime-polysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus JAAS8isolated from Chinese sauerkraut Potential application in fermented milk products；鼠李糖乳杆菌JAAS8胞外多糖生物合成基因的克隆及生物信息学分析。
盐酸氟西汀溶液的制备方法：取盐酸氟西汀胶囊中的颗粒物，用0.5g/100ml羧甲基纤维素钠水溶液溶解。盐酸氟西汀的剂量以颗粒物计。
实施例1、菌株的分离、鉴定和保藏
一、菌株的分离
2016年8月，从吉林省长春市采集新生婴儿的新鲜粪便，挑取粪便中心样品并放入运输培养基中，加入1mL灭菌液体石蜡油密封，迅速置于冰盒内送至实验室进行分离。将酸菜样品和粪便样品梯度稀释后，分别采用MRS固体培养基、乳杆菌选择性培养基对样品中的乳杆菌进行分离，于厌氧条件下37℃培养48h，挑取平板上的典型菌落，划线培养，分离得到纯菌落。
将分离得到的各个菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定以及分子鉴定，其中2株属于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，依次命名为鼠李糖乳杆菌TF316、鼠李糖乳杆菌TF318。
二、菌株的鉴定
鼠李糖乳杆菌TF318的生理生化鉴定结果：革兰氏阳性，短杆状，在15℃及45℃环境下均能生长，过氧化氢酶阴性，接触酶阴性，无运动性，硝酸盐还原阴性，吲哚阴性，不产生硫化氢，不液化明胶。
鼠李糖乳杆菌TF318的API 50CH(法国梅里埃公司)鉴定结果：能利用利用D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、卫矛醇、甘露醇、山梨醇、甲基-αD-吡喃葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、ARBULIN、七叶灵、柠檬酸铁、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-松三糖、淀粉、糖原、D-龙胆二糖、D-土伦糖、D-塔格糖、葡萄糖酸钾；而不利用甘露醇、赤藻糖醇、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-侧金盏花醇I、甲基-βD吡喃木糖苷、肌醇、甲基-αD-吡喃甘露糖苷、菊粉、D-棉子糖、木糖醇、D-来苏糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯醇、L-阿拉伯醇、2-酮基葡萄糖酸钾、5-酮基葡萄糖酸钾。
鼠李糖乳杆菌TF318的分子鉴定结果：16S rDNA序列如序列表的序列1所示。
三、菌株的保藏
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)TF318，已于2018年03月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018113。
实施例2、鼠李糖乳杆菌TF318的抗抑郁功能
供试菌分别为：鼠李糖乳杆菌TF316(用TF316表示)、鼠李糖乳杆菌JAAS8(用JAAS8表示)和鼠李糖乳杆菌TF318(用TF318表示)。
一、菌悬液的制备
1、供试菌接种于液体MRS培养基，37℃静置培养16小时，然后4℃、6000rpm离心8min，收集菌体沉淀。
2、取步骤1得到的菌体沉淀，用无菌生理盐水悬浮，得到菌浓度为2×1010CFU/mL的菌悬液。
供试菌为TF316时，进行上述步骤得到的菌悬液命名为TF316菌悬液。
供试菌为JAAS8时，进行上述步骤得到的菌悬液命名为JAAS8菌悬液。
供试菌为TF318时，进行上述步骤得到的菌悬液命名为TF318菌悬液。
二、分组处理
试验动物为清洁级ICR雄性小鼠。
试验动物先进行连续3天的适应性饲养，然后随机分为6组，每组30只，处理如下：
对照组：连续21天每天灌胃一次生理盐水(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18小时后腹腔注射生理盐水(单只的给予量为0.1mL)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
模型组：连续21天每天灌胃一次生理盐水(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18小时后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg体重)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
阳性药物组：连续21天每天灌胃一次盐酸氟西汀溶液(单次给予盐酸氟西汀的剂量为10mg/kg体重，给予体积量为0.2mL)，末次灌胃18小时后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
TF318组：连续21天每天灌胃一次步骤一制备的TF318菌悬液(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18h后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg体重)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
TF316组：连续21天每天灌胃一次步骤一制备的TF316菌悬液(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18h后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg体重)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
JAAS8组：连续21天每天灌胃一次步骤一制备的JAAS8菌悬液(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18h后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg体重)，腹腔注射4小时后处死试验动物。
三、抗抑郁功能鉴定
1、抑郁样行为检测
抑郁样行为的评价指标为眼睑下垂、出圈率和体温。
注射利血平注射液1小时后，将小鼠放在架子上观察15s，对小鼠眼睑下垂程度并进行评分：0分，眼睑未关闭；1分，眼睑关闭1/4；2分，眼睑关闭1/2；3分，眼睑关闭3/4；4分，眼睑全部关闭。
注射利血平注射液2小时后，将小鼠放入直径7.5cm的圆形白纸中央，观察15s后留在白纸上的小鼠数量，出圈率＝(小鼠总数量-留在白纸上的小鼠数量)÷小鼠总数量。
注射利血平注射液4小时后，将小鼠体温计插入肛门1cm处测量体温。
抑郁样行为的检测结果见表1。
表1
眼睑下垂(分) 出圈率(％) 体温(℃) 模型组 96 10.8 31.9±0.61 对照组 0 100 36.9±0.37 阳性药物组 58 43.3 33.8±0.66* TF316组 82 23.3 31.8±0.84 TF318组 55 40.0 33.2±0.74* JAAS8组 68 30.0 32.4±0.67
模型组小鼠：注射利血平1小时后，小鼠出现小鼠精神萎靡、嗜睡的临床表现，眼睑下垂非常严重，眼睑睁开的程度小于1/4，眼睑下垂的分数为96分；注射利血平2h后，小鼠出现蜷缩、活动减少及腹泻现象，出圈率为10.8％；注射利血平4h后，小鼠体温下降，平均体温为31.9℃。
TF318组小鼠：注射利血平1小时后，小鼠眼睑下垂，但是与模型组小鼠相比程度有所减缓，眼睑下垂的平均分值为55分；注射利血平2h后，小鼠出现蜷缩、活动减少及腹泻现象，但与模型组相比有所减缓，出圈率为40.0％；注射利血平4h后，小鼠体温显著高于模型组小鼠，平均体温为33.2℃。
结果表明，鼠李糖乳杆菌TF318可以有效的对抗利血平诱导的抑郁样行为。鼠李糖乳杆菌TF316、鼠李糖乳杆菌JAAS8对于抑郁样行为有一定的改善作用，但效果显著劣于鼠李糖乳杆菌TF318。
2、脑组织中单胺类神经递质水平的检测
处死试验动物后，冰袋上取出脑组织，分离出海马和皮质组织，加入10倍体积的预冷的pH7.4、0.05M PBS缓冲液，匀浆，然后4℃、4000g/min离心20min，取上清液。采用试剂盒检测上清液中5-羟色胺、多巴胺和去甲肾上腺素。结果见表2。
表2
组别 5-HT(ng/ml) DA(pg/ml) NE(ng/ml) 模型组 21.03±1.15 6.13±0.01 16.46±0.03 对照组 23.23±0.69* 7.66±0.51* 26.51±7.50** 阳性药物组 25.39±0.84** 7.75±1.69* 23.15±0.56* TF316组 20.09±0.87 6.23±0.48 16.58±5.97 TF318组 23.21±2.13* 7.63±0.81* 25.73±7.85** JAAS8组 22.45±0.98 6.55±1.15 20.31±5.09
与对照组小鼠相比，模型组小鼠脑组织中5-HT、DA、NE的浓度显著减低(p<0.05)。与模型组小鼠相比，TF318组小鼠脑组织中5-HT、DA和NE浓度增高，差异显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)。鼠李糖乳杆菌TF316、鼠李糖乳杆菌JAAS8有一定的改善作用，但效果显著劣于鼠李糖乳杆菌TF318。结果表明，灌胃鼠李糖乳杆菌TF318可以有效的缓解由于利血平注射而导致小鼠脑组织中单胺类神经递质浓度的下降趋势，说明该菌株具有抗抑郁的效果。
实施例3、鼠李糖乳杆菌TF318抗抑郁功效的验证
一、菌悬液的制备
1、鼠李糖乳杆菌TF318接种于液体MRS培养基，37℃静置培养至16小时，然后4℃、6000rpm离心8min，收集菌体沉淀。
2、取步骤1得到的菌体沉淀，用无菌生理盐水悬浮，得到菌浓度为2×1010CFU/mL的TF318菌悬液。
二、分组处理
试验动物为清洁级ICR雄性小鼠。
试验动物先进行连续3天的适应性饲养，然后随机分为4组，每组30只，处理如下：
对照组：连续21天每天灌胃一次生理盐水(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18小时后腹腔注射生理盐水(单只的给予量为0.1mL)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
模型组：连续21天每天灌胃一次生理盐水(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18小时后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
阳性药物组：连续21天每天灌胃一次盐酸氟西汀溶液(单次给予盐酸氟西汀的剂量为10mg/kg，给予体积量为0.2mL)，末次灌胃18小时后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
TF318组：连续21天每天灌胃一次步骤一制备的TF318菌悬液(单次单只的给予量为0.2mL)，末次灌胃18h后腹腔注射利血平注射液(给予利血平的剂量为4mg/kg)，腹腔注射4小时后处死试验动物；
三、鼠李糖乳杆菌TF318降低小鼠血清中的炎症因子水平
处死试验动物前，摘眼球取血，分离血清，检测血清中的炎症因子(TNF-α、IL-1β和NO)。结果见表3。与对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、NO水平明显升高。与模型组相比，TF318组小鼠血清中TNF-α、IL-1β水平和NO水平均呈不同程度降低。结果表明，鼠李糖乳杆菌TF318能明显缓解利血平诱导的小鼠炎症反应，降低小鼠血清中炎症因子水平。
表3
组别 Tnf-a(ng/l) ILl-β(ng/l) NO(μmol/l) 模型组 124.51±9.80 270.41±17.90 4.79±0.16 对照组 104.13±6.21** 248.38±16.75 4.22±0.11 阳性药物组 111.30±7.03* 247.78±12.47 4.24±0.09 TF318组 119.19±3.33* 252.46±21.56 4.49±0.31
四、鼠李糖乳杆菌TF318降低小鼠脑组织中的氧化应激水平
氧化应激参与了慢性痛和抑郁的发病过程。
处死试验动物后，冰袋上取出脑组织，检测脑组织中丙二醛和超氧化物歧化酶含量。
结果见图1。与对照组相比，模型组小鼠脑组织中丙二醛和超氧化物歧化酶水平升高，差异极显著(P<0.01)。与模型组相比，TF318组小鼠脑组织中丙二醛和超氧化物歧化酶水平降低，差异极显著(P<0.01)。
五、鼠李糖乳杆菌TF318降低小鼠脑组织中的皮质酮含量
强烈刺激可使HAP轴兴奋，使得肾上腺合成分泌糖皮质激素增多，高浓度的皮质酮会诱发患者脑内海马神经元损伤，导致认知能力下降。
处死试验动物后，冰袋上取出脑组织，检测脑组织中皮质酮的含量。
结果见图2所示。与对照组相比，模型组小鼠脑组织中皮质酮水平显著升高。与模型组相比，TF318组小鼠脑组织中皮质酮水平降低。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一株鼠李糖乳杆菌及其在制备抗抑郁产品中的应用
<130> GNCYX180907
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1466
<212> DNA
<213> Lactobacillus rhamnosus
<400> 1
ttagacggct cgctccctaa aagggttacg ccaccggctt cgggtgttac aaactctcat 60
ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcggcgt gctgatccgc 120
gattactagc gattccgact tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg aactgagaat 180
ggctttaaga gattagcttg acctcgcggt ctcgcaactc gttgtaccat ccattgtagc 240
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agttagccgt ggctttctgg ttggataccg tcacgccgac aacagttact ctgccgacca 1020
ttcttctcca acaacagagt tttacgaccc gaaagccttc ttcactcacg cggcgttgct 1080
ccatcagact tgcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtttggg 1140
ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgatcaa cctctcagtt cggctacgta tcattgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat acgccgcggg tccatccaaa agcgatagct 1260
tacgccatct ttcagccaag aaccatgcgg ttcttggatt tatgcggtat tagcatctgt 1320
ttccaaatgt tatcccccac ttaagggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgcca 1380
ctcgttcaaa attaaatcaa gatgcaagca cctttcaata atcagaactc gttcgacttg 1440
catgtattag gcacgccgcc agcgtt 1466