技术领域
本技术涉及分子生物学、细胞生物学以及生物化学，具体涉及一种应用小RNA调节线粒体基因表达的方法及应用。
背景技术
真核生物的线粒体是一种半自主细胞器，它具有自己独特的遗传系统，即线粒体双链闭合环状DNA，以及DNA复制、转录和蛋白质翻译系统。关于线粒体基因的复制、转录和翻译的研究已经进行了35年之久，尽管领域内已经取得了一些进展，但是对于线粒体的遗传和基因表达的了解只是冰山一角。
另外，了解线粒体中特定基因的功能是相当困难的，原因在于线粒体是具有双层膜结构的细胞器，线粒体的外膜和内膜对细胞内和细胞器内的分子交换有很强的选择性，领域内现在的瓶颈是既不可能对线粒体基因进行过表达，也不可能对某个特定的线粒体基因进行基因敲除。目前对于线粒体基因组的研究主要集中于了解疾病导致的线粒体基因突变对线粒体遗传的影响以及线粒体基因组的突变对于整个细胞活动的影响。
尽管miRNA和siRNA的应用已经非常广泛，尤其是siRNA被用于基因沉默的应用已经长达10年之久。miRNA和siRNA在线粒体中的功能从来没有被报道过，因为线粒体是一种具有双层膜的具有自身遗传体系的细胞器，尽管有报道发现miRNA在线粒体中存在，但是领域内普遍认为miRNA不可能在线粒体中存在，更不可能在线粒体中调节线粒体基因的表达。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种应用小RNA调节线粒体基因表达的方法，通过该方法可以研究线粒体基因的功能及调控线粒体功能。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
小RNA转染到细胞中实现调节线粒体基因的表达。所述的小RNA包括siRNA或miRNA。
本发明针对小鼠线粒体ND1基因设计了siRNA：
ND1siRNA：UUCCUAUGGAUCCGAGCAUCTT，GAUGCUCGGAUCCAUAGGAATT。
将ND1siRNA转染到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中进行培养，提取转染siRNA的MEF的RNA，通过逆转录定量PCR和免疫印迹反应发现ND1siRNA能降低ND1mRNA的水平和蛋白水平。进一步提取细胞的线粒体，裂解线粒体，通过胶内活性反应或光谱测定法分析线粒体裂解液对复合体活性进行检测，发现ND1siRNA能够下调ND1所在的复合体I的活性。通过转染siRNA可以调节特定线粒体基因的表达。
本发明还将miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）转染到人子宫颈癌细胞（HeLa）中进行培养，通过行免疫印迹反应发现miR-1能够增强ND1基因的表达。进一步检测细胞的ATP水平发现miR-1可以显著上调细胞内ATP的水平。表明miR-1不仅可以转运到线粒体中，而且可以增强线粒体中靶基因的表达，进而增强线粒体的功能。
上述结果说明应用小RNA调节线粒体基因表达的方法可应用于调控线粒体的功能中；也可应用于研究线粒体特定基因的功能中，可以对线粒体基因更加深入的研究，甚至可以将该方法拓展到线粒体遗传疾病的分子治疗。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明发现siRNA可以有效的降低线粒体中mRNA的丰度（在一些特定基因上沉默效果可以达到85%），蛋白水平亦有所下降，但是因为线粒体自身编码蛋白均处于电子传递链的复合体中，蛋白半衰期很长，siRNA下调蛋白水平并不如mRNA的效果明显。
（2）同时发现miRNA可以在不改变线粒体中靶基因mRNA水平的情况下增强靶基因的表达翻译水平，进而上调线粒体的功能。本发明提供了一种调节线粒体特定基因的新方法，对线粒体基因更加深入的研究。
本发明首次发现了小RNA对线粒体基因的调节作用，为研究线粒体基因功能提供了新的方向。
附图说明
图1是实施例1逆转录定量PCR结果图，图中纵坐标ND1/18S是指ND1的mRNA水平相对于内参基因18SrRNA的丰度；转染ND1siRNA引起线粒体中ND1基因mRNA水平的下调。
图2是实施例1免疫印迹反应结果图，图中NC为对照RNA，siND1为ND1siRNA；转染ND1siRNA引起ND1蛋白水平的下调。
图3是实施例2中逆转录定量PCR结果图，图中纵坐标ND1/GAPDH是指ND1的mRNA水平相对于内参基因GAPDHmRNA的丰度；转染miR-1并没有引起线粒体中ND1基因mRNA水平的改变。
图4是实施例2免疫印迹反应结果图，图中Mock是空白对照，即没有转染任何核酸；HeLa细胞中转染miR-1之后，ND1的蛋白水平有明显的上升。
图5是实施例2检测细胞内的ATP水平结果图；miR-1转染HeLa细胞之后，细胞内ATP水平升高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。应理解，下面的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本技术的范围。
下述实施例中所有细胞培养之后的操作均应在低温下进行，即尽量在冰上进行。
实施例1
针对小鼠线粒体ND1基因设计siRNA。
ND1siRNA：UUCCUAUGGAUCCGAGCAUCTT，GAUGCUCGGAUCCAUAGGAATT。
（1）培养1×106小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（25平方厘米的生长面积），待其生长到95%密度。
（2）按照lipofectaminRNAimax（脂质体）的说明书配制ND1siRNA和对照RNA（CtlRNA）（上海吉玛对照RNA）转染混合物，混匀后静置20分钟。
（3）用胰酶消化MEF细胞，按照30%的密度将消化的细胞铺到24孔板，加入步骤（2）的转染混合物。转染后的细胞放置在37℃二氧化碳细胞培养箱中连续培养48小时。
（4）用PBS（pH7.4）清洗细胞两次，之后用Trizol（LifeTechnologies）试剂处理细胞5分钟，提取RNA，实施逆转录定量PCR。
逆转录反应条件为逆转录标准化流程，引物为随机引物。
定量PCR为标准SyBrGreen流程，PCR引物如下：
ND1F：TTACCAGAACTCTACTCAACT，ND1R：ATCGTAACGGAAGCGTGGATA；
18SF：GTAACCCGTTGAACCCCATT，18SR：CCATCCAATCGGTAGTAGCG。
结果见图1，转染ND1siRNA的细胞跟转染对照RNA的细胞相比，ND1siRNA显著下降了ND1mRNA的水平。
（5）用PBS（pH7.4）清洗细胞两次，再用SDS-PAGE上样缓冲液处理细胞5分钟，收集细胞裂解液沸水煮15分钟，之后对细胞裂解液进行免疫印迹反应分析。细胞裂解液用12%的SDS变形聚丙烯酰胺胶分离，将胶块上的蛋白通过转膜的方式转移到PVDF膜上，分别对转印膜进行目的蛋白ND1和内参蛋白TUBB3的杂交。结果见图2，跟对照RNA相比，ND1siRNA的转染降低了转染细胞中线粒体蛋白ND1的蛋白水平，TUBB3作为内参蛋白并没有受到siRNA的影响。针对线粒体自身编码基因设计的siRNA会下调线粒体中靶基因的蛋白水平。线粒体自身编码的蛋白均处于线粒体中的蛋白复合体中，相对很稳定，所以siRNA引起的蛋白水平较之mRNA水平的下降要小。
（6）siRNA转染之后的细胞，提取细胞中的线粒体之后，对线粒体进行裂解，之后通过胶内活性反应或光谱测定法分析线粒体裂解液对复合体活性进行检测，发现ND1siRNA会下调ND1所在的复合体I的活性。
实施例2
miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）在人子宫颈癌细胞中的转染对线粒体基因的影响
（1）培养1×106人子宫颈癌细胞（HeLa）（25平方厘米的生长面积），待其生长到100%密度。
（2）按照lipofectamin2000（脂质体）的说明书配制miR-1（miR-1的序列如上所示在takara公司合成并纯化）或对照RNA（CtlRNA）转染混合物，混匀后静置20分钟。
（3）用胰酶消化HeLa细胞，按照30%的密度将消化的细胞铺到24孔板，加入步骤（2）的转染混合物，转染后的细胞放置在37℃二氧化碳细胞培养箱中连续培养48小时。
（4）用PBS（pH7.4）清洗细胞两次，之后用Trizol（LifeTechnologies）试剂处理细胞5分钟，提取RNA，实施逆转录定量PCR。
逆转录反应条件为逆转录表转标准化流程，引物为随机引物。
定量PCR为标准SyBrGreen流程，PCR引物如下：
ND1F：TTACCAGAACTCTACTCAACT，ND1R：ATCGTAACGGAAGCGTGGATA；
GAPDHF：TTGCCATCAATGACCCCTTCA，GAPDHR：CGCCCCACTTGATTTTGGA。
结果见图3，转染miR-1的细胞跟转染对照RNA的细胞相比，ND1基因mRNA水平的没有显著差异。
（5）用PBS（pH7.4）清洗细胞两次，再用SDS-PAGE上样缓冲液处理细胞5分钟，收集细胞裂解液沸水煮15分钟，之后对细胞裂解液进行免疫印迹反应分析（说明同上）。结果见图4，转染miR-1的细胞跟空白对照和转染对照RNA的细胞相比线粒体基因ND1的表达被上调，Actin（肌动蛋白）作为内参并没有变化。miR-1在不改变线粒体中ND1基因mRNA水平的情况下增强了其表达翻译水平。
（6）用冰冷的PBS清洗细胞两次，之后用碧云天公司的ATP检测试剂盒检测细胞内的ATP水平，结果见图4，跟对照RNA相比miR-1可以显著上调细胞内ATP的水平。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCELISTING
<110>武汉大学
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<170>PatentInversion3.5
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