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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810532429.3 (22)申请日 2018.05.29 (83)生物保藏信息 CCTCC NO:M 2017360 2017.06.22 (71)申请人 中国科学院烟台海岸带研究所 地址 264003 山东省烟台市莱山区春晖路 17号 (72)发明人 季乃云宋银平 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 李颖 (51)Int.Cl. C07C 45/78(2006.01) C07C 45/79(2006.01) C07C 49/707。
2、(2006.01) A01N 35/06(2006.01) A01P 1/00(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12R 1/885(2006.01) (54)发明名称 一种氯代环戊烯酮类化合物及其制备和应 用 (57)摘要 本发明涉及抑菌剂领域， 具体地说是一种海 藻内生真菌来源的氯代环戊烯酮类化合物及其 制备方法和在抑菌方面的应用。 具体结构式如 (I)所示， 其制备方法为将海藻内生真菌棘孢木 霉(Trichodermaasperellum)cf44-2接种于真 菌培养基中发酵培养， 发酵产物经分离纯化后， 即为式(I)所示的氯代环戊烯酮类化合物。 本发 明获得的氯。
3、代环戊烯酮类化合物， 经抑菌活性实 验得出化合物在20微克/片时的抑菌圈直径可达 8.5毫米。 权利要求书1页 说明书4页 CN 108586218 A 2018.09.28 CN 108586218 A 1.一种氯代环戊烯酮类化合物， 其特征在于： 氯代环戊烯酮类化合物结构如式(I)所示 2.一种权利要求1所述的氯代环戊烯酮类化合物的制备方法， 其特征在于： 将棘孢木霉 cf44-2(Trichoderma asperellum cf44-2)接种于真菌培养基中发酵培养， 发酵产物经纯 化后， 即为式(I)所示的氯代环戊烯酮类化合物； 所述的棘孢木霉cf44-2(Trichoderma as。
4、perellum cf44-2)于2017年6月22日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC， 保藏编号为 CCTCC NO： M 2017360。 3.按权利要求2所述的氯代环戊烯酮类化合物的制备方法， 其特征在于具体制备步骤： 1)将棘孢木霉cf44-2(Trichoderma asperellum cf44-2)接种于真菌培养基中发酵 10-60天， 而后经有机溶剂提取并浓缩， 即为粗提物； 2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析， 用有机溶剂进行梯度洗脱， 收集洗脱液， 洗脱 液经薄层层析检测； 3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、 凝胶柱层析和制备薄层层析分离 纯化， 。
5、即得如式(I)所示的氯代环戊烯酮类化合物。 4.按权利要求3所述的氯代环戊烯酮类化合物的制备方法， 其特征在于： 步骤1)中真菌 培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基、 菊芋葡萄糖液体培养基或大米固体培养基。 有机溶剂提取液为乙酸乙酯、 石油醚、 正己烷、 环己烷、 二氯甲烷、 甲醇、 乙醇、 丙醇或异 丙醇中一种或几种。 5.按权利要求3所述的氯代环戊烯酮类化合物的制备方法， 其特征在于： 步骤2)中的有 机溶剂为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、 石油醚-乙醇、 石油醚-丙醇、 石油醚-异丙醇、 二氯甲烷-乙酸乙酯、 二氯甲烷-甲醇、 二氯甲烷-乙醇、 二氯甲烷-丙醇、 二氯甲烷-异丙醇中 。
6、的一组或几组。 6.按权利要求3所述的氯代环戊烯酮类化合物的制备方法， 其特征在于： 步骤3)所述反 相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0:1的水-甲醇或水-乙醇； 凝胶柱层析洗脱液为体积比2- 0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇； 制备薄层层析展开剂为体积比为10-0:1的二氯甲 烷-甲醇或石油醚-乙醇。 7.一种权利要求1所述的氯代环戊烯酮类化合物的应用， 其特征在于： 所述的氯代环戊 烯酮类化合物在用于制备细菌的抑菌剂中的应用。 8.按权利要求7所述的氯代环戊烯酮类化合物的应用， 其特征在于： 所述细菌为水产病 害细菌的鳗弧菌、 哈维氏弧菌、 副溶血性弧菌或灿烂弧菌。 权利要求书 1/1。
7、 页 2 CN 108586218 A 2 一种氯代环戊烯酮类化合物及其制备和应用 技术领域 0001 本发明涉及抑菌剂领域， 具体地说是一种海藻内生真菌来源的氯代环戊烯酮类化 合物及其制备方法和在抑菌方面的应用。 背景技术 0002 水产养殖业在国民经济中占有重要的比重， 目前水产养殖种类多样， 但几乎所有 养殖品种都受到疾病威胁。 水产养殖病害频发， 不仅造成重大的经济损失， 也为水产品质量 安全埋下了隐患。 据水产养殖动物病害监测结果显示， 近年来水产养殖病害种类高达200余 种， 其中细菌性疾病占48以上。 在细菌性水产动物疾病中， 由弧菌属细菌引起的弧菌病是 最主要的细菌性疾病， 该。
8、病发生范围广、 致死率高， 且能够引起人畜共患， 是水产养殖病害 防治领域的主要难题之一。 0003 近年来， 随着水产养殖规模的发展和水产养殖过程中传统型抗生素的大量使用， 水产养殖动物病原菌和养殖环境中细菌的多重耐药现象日趋普遍， 并且化学合成药物的大 量使用对水体和土壤带来了严重的污染， 对生物和人类健康都造成了直接和潜在的危害。 0004 与水产养殖业中使用的传统抗生素和化学合成药物相比， 海洋生物源天然药物具 有安全性高、 针对性强、 活性显著、 对环境友好且能够解决目前大部分水产病害细菌对传统 抗生素的耐药性问题， 为解决目前水产养殖过程中的细菌性病害防治问题提供了新的思 路。 发。
9、明内容 0005 本发明的目的是提供一种氯代环戊烯酮类化合物及其制备和应用。 0006 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为： 0007 一种氯代环戊烯酮类化合物， 氯代环戊烯酮类化合物结构如式(I)所示 0008 0009 一种氯代环戊烯酮类化合物的制备方法， 将棘孢木霉cf44-2(Trichoderma asperellum cf44-2)接种于真菌培养基中发酵培养， 发酵产物经纯化后， 即为式(I)所示的 氯代环戊烯酮类化合物； 所述的棘孢木霉cf44-2(Trichoderma asperellum cf44-2)于 2017年6月22日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC， 。
10、保藏编号为CCTCC NO:M 2017360。 0010 说明书 1/4 页 3 CN 108586218 A 3 0011 进一步的说： 0012 1)将棘孢木霉cf44-2(Trichoderma asperellum cf44-2)接种于真菌培养基中发 酵10-60天， 而后经有机溶剂提取并浓缩， 即为粗提物； 0013 2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析， 用有机溶剂进行梯度洗脱， 收集洗脱液， 洗脱液经薄层层析检测； 0014 3)收集步骤2)中洗脱组分再依次经反相硅胶柱层析、 凝胶柱层析和制备薄层层析 分离纯化， 即得如式(I)所示的氯代环戊烯酮类化合物。 0015 4.按权。
11、利要求3所述的氯代环戊烯酮类化合物的制备方法， 其特征在于： 步骤1)中 真菌培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基、 菊芋葡萄糖液体培养基或大米固体培养基。 0016 有机溶剂提取液为乙酸乙酯、 石油醚、 正己烷、 环己烷、 二氯甲烷、 甲醇、 乙醇、 丙醇 或异丙醇中一种或几种。 0017 所述步骤2)中的有机溶剂为体积比50-0:1的石油醚-乙酸乙酯、 石油醚-乙醇、 石 油醚-丙醇、 石油醚-异丙醇、 二氯甲烷-乙酸乙酯、 二氯甲烷-甲醇、 二氯甲烷-乙醇、 二氯甲 烷-丙醇、 二氯甲烷-异丙醇中的一组或几组。 0018 所述步骤3)所述反相硅胶柱层析洗脱液为体积比5-0:1的水-甲醇或水-乙。
12、醇； 凝 胶柱层析洗脱液为体积比2-0:1的二氯甲烷-甲醇或二氯甲烷-乙醇； 制备薄层层析展开剂 为体积比为10-0:1的二氯甲烷-甲醇或石油醚-乙醇。 0019 一种氯代环戊烯酮类化合物的应用， 所述的氯代环戊烯酮类化合物在用于制备细 菌的抑菌剂中的应用。 0020 所述细菌为水产病害细菌的鳗弧菌、 哈维氏弧菌、 副溶血性弧菌或灿烂弧菌。 0021 本发明具有以下优点： 本发明通过分离于海洋褐藻马尾藻的棘孢木霉cf44-2 (Trichoderma asperellum cf44-2)发酵经提取、 分离获得的氯代环戊烯酮类化合物， 经抑 菌活性实验得出化合物在20微克/片的浓度下对水产病害细。
13、菌-鳗弧菌、 哈维氏弧菌、 副溶 血性弧菌和灿烂弧菌的抑菌圈直径分别为8.5毫米、 8.0毫米、 6.7毫米和6.5毫米。 具体实施方式： 0022 下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。 0023 实施例1 0024 海藻内生真菌来源的氯代环戊烯酮类化合物结构如式(I)所示。 0025 0026 该化合物具有以下理化和波谱特性： 0027 无色油状； 比旋光度 25D+7.5(c 0.040,MeOH)； 核磁共振氢谱(溶剂为氘代甲醇) H 2.88ddd(18.6,6.3,0.9),2.30dd(18.6,1.7),5.14dd(6.3,1.5),4.97q(6.9),1.51d (6.9。
14、)； 核磁共振碳谱(溶剂为氘代氯仿)C 200.1(C) ,44.0(CH2) ,68.4(CH) ,175.4(C) , 131.5(C),66.3(CH),21.8(CH3)； 高分辨质谱M+m/z 176.0236,计算值176.0240。 说明书 2/4 页 4 CN 108586218 A 4 0028 实施例2 0029 如式(I)所示的氯代环戊烯酮类化合物的制备方法： 0030 取平板上生长良好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)cf44-2菌种， 切成小块 并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中， 每1升三角瓶中放300毫升培养基， 共200瓶， 室温静 止发酵。
15、30天， 发酵产物用乙酸乙酯提取三次， 减压浓缩， 浓缩后共得粗提物83.7克。 0031 所述马铃薯葡萄糖液体培养基组成为每升含200克马铃薯的煮汁500毫升， 葡萄糖 20克， 蛋白胨5克， 酵母粉5克， 陈海水500毫升。 0032 棘孢木霉cf44-2(Trichoderma asperellum cf44-2)菌种于2017年6月22日保存 于中国典型培养物保藏中心CCTCC， 地址： 中国武汉大学， 保藏编号为CCTCC NO:M 2017360, 分类命名为Trichoderma asperellum， 株号为cf44-2。 0033 将粗提物经100-200目的硅胶柱层析， 依。
16、次用体积比50:1、 20:1、 10:1、 5:1、 2:1、 1: 1到0:1的石油醚-乙酸乙酯和20:1、 10:1、 5:1、 2:1到1:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱， 分 别收集洗脱液， 收集的各组分再用薄层层析(TLC)检测(体积比100-1： 1的二氯甲烷-甲醇展 开， 茴香醛-硫酸显色或254nm紫外光检测),根据Rf值来判断、 合并相同或类似部分， 获得12 个组分(1-12)。 0034 将Rf值为0.6-0.7(体积比10:1的二氯甲烷-甲醇展开， 254nm紫外光检测)的组分 8， 即以体积比1:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱下的组分再依次经反相C18硅胶柱、 Sep。
17、hadex LH-20凝胶柱和制备薄层层析分离。 反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积比4:1的水-甲醇， TLC 检测(体积比10:1的二氯甲烷-甲醇展开， 254nm紫外光检测)， 收集254nm紫外光下有荧光的 组分； 收集组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液为甲醇， TLC检测(体积比10:1的二 氯甲烷-甲醇展开， 254nm紫外光检测)， 收集254nm紫外光下有荧光的组分； 收集组分再经制 备薄层层析， 用体积比10:1的二氯甲烷-甲醇为展开剂， 收集Rf值为0.60.7的组分， 即为 式(I)所示化合物(1.1毫克)。 经薄层层析检测(体积比10:1二氯甲烷-甲醇展。
18、开， 254nm紫外 光检测)， 呈单个、 均匀荧光斑点， 确定为纯化合物。 经波谱分析， 其结构鉴定为一种氯代环 戊烯酮类化合物， 结构式如(I)所示。 0035 0036 实施例3 0037 与实施例2不同之处在于 0038 取平板上生长良好的棘孢木霉cf44-2(Trichoderma asperellum cf44-2)菌种， 切成小块并接种于菊芋葡萄糖液体培养基中， 每1升三角瓶中放300毫升培养基， 共200瓶， 室温静止发酵40天， 而后用二氯甲烷提取三次， 减压浓缩， 浓缩后得粗提物80克。 0039 所述菊芋葡萄糖液体培养基组成为每升含200克菊芋块茎的煮汁500毫升， 葡萄。
19、糖 20克， 蛋白胨5克， 酵母粉5克， 陈海水500毫升。 0040 将粗提物经200-300目的硅胶柱层析， 依次用体积比50:1、 30:1、 15:1、 10:1、 5:1、 2:1、 1:1到0:1的石油醚-乙醇进行梯度洗脱， 分别收集洗脱液， 再用薄层层析检测(体积比 说明书 3/4 页 5 CN 108586218 A 5 50-0： 1的石油醚-乙醇展开， 茴香醛-硫酸显色或254nm紫外光检测),根据Rf值来判断、 合并 相同或类似部分， 获得8个组分(1-8)。 0041 将Rf值为0.6-0.7(体积比7:1的石油醚-乙醇展开， 254nm紫外光检测)的组分3， 即 以体。
20、积比15:1的石油醚-乙醇梯度洗脱下的组分再依次经反相C18硅胶柱、 Sephadex LH-20 凝胶柱和制备薄层层析分离。 反相C18硅胶柱层析洗脱液为体积比2:1的水-乙醇， TLC检测 (体积比7:1的石油醚-乙醇展开， 254nm紫外光检测)， 收集254nm紫外光下有荧光的组分； 收 集组分经Sephadex LH-20凝胶柱层析时洗脱液为乙醇， TLC检测(体积比7:1的石油醚-乙醇 展开， 254nm紫外光检测)， 收集254nm紫外光下有荧光的组分； 收集组分经制备薄层层析， 体 积比7:1的石油醚-乙醇为展开剂， 收集Rf值为0.6-0.7的组分， 得式(I)所示氯代环戊烯。
21、酮 类化合物。 0042 实施例4 0043 抑菌活性实验： 0044 具体为： 供试细菌分别接种于2216E培养基， 并于37培养24小时， 而后吸取4毫升 无菌的0.85NaCl溶液进行洗涤培养物， 并用玻璃刮刀将菌轻轻刮下， 用移液枪吸取适量 菌悬液于无菌试管中， 然后用0.85NaCl溶液将菌悬液调至0.5麦氏浊度(相当于1.5 108CFU/毫升)。 其中， 供试菌株分别为： 鳗弧菌、 哈维氏弧菌、 副溶血性弧菌或灿烂弧菌。 0045 用无菌棉签浸取菌悬液， 均匀涂于培养基上。 测试样品(上述实施例制备获得式 (I)所示氯代环戊烯酮类化合物)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中， 浓度为4.0毫克/毫升。 取5微 升样品加到直径为5毫米的无菌滤纸片上(每片20微克)， 并用加有相同体积DMSO的滤纸片 做阴性对照， 用氯霉素作为阳性对照， 各三个平行。 加有样品的平板培养基置于37静置培 养24小时， 观察实验结果， 出现抑菌圈的测量其抑菌圈直径。 0046 实验结果： 上述获得的氯代环戊烯酮类化合物对水产病害细菌-鳗弧菌、 哈维氏弧 菌、 副溶血性弧菌和灿烂弧菌的抑菌圈直径分别为8.5毫米、 8.0毫米、 6.7毫米和6.5毫米， 具有抑制鳗弧菌、 哈维氏弧菌、 副溶血性弧菌或灿烂弧菌的作用。 说明书 4/4 页 6 CN 108586218 A 6 。