《具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103451258 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451258 A *CN103451258A* (21)申请号 201310243516.4 (22)申请日 2013.06.19 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (71)申请人 浙江海洋学院 地址 316000 浙江省舟山市定海区海院路 18 号 (72)发明人 丁国芳 吴飞红 徐敏 张海龙 王立博 杨最素 李荣 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏 (54) 发明名称 具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋。
2、白的制 备工艺 (57) 摘要 本发明提供了一种具有高抗疲劳活性的梅 鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺， 采用海产品加工废 料梅鱼鱼鳔作为提取原料， 先将梅鱼鱼鳔除杂 蛋白、 脱脂， 然后先用胃蛋白酶提取胶原蛋白， 再 将胃蛋白酶提取胶原蛋白后所得沉淀用复合酶提 取胶原蛋白， 合并提取到的胶原蛋白， 离心干燥后 得到具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白。胶 原蛋白提取率高， 能够有效利用废弃的梅鱼鱼鳔， 提高了经济效益， 制得的胶原蛋白常温下可溶于 蒸馏水， 无异味， 苦味， 抗疲劳活性好， 无明显毒副 作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 1 页 (19)中华人民共。
3、和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103451258 A CN 103451258 A *CN103451258A* 1/1 页 2 1. 一种具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺， 其特征在于 ： 包括如下步 骤 ： （1） 梅鱼鱼鳔去除内壁薄膜及血管， 清水洗净， 接着将梅鱼鱼鳔除杂蛋白及脱脂 ； （2） 将步骤 （1） 处理得到的梅鱼鱼鳔按照 1:30-40(m/v) 的料液比加入 pH 为 1.9-2.1 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液， 再加入梅鱼鱼鳔重量1%-1.5%的胃蛋白酶， 在40.5下酶 解 24-。
4、36h， 加入终浓度为 201mmol/L 的 EDTA 灭酶， 室温离心 15-20min， 取上清液用活性 炭除色素后， 在 40.5下离心 30-40min， 收集上清液， 先于 pH 为 3.5-4.0 的的磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液中透析121h， 再于pH为5.5-6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中透析 121h， 最后于蒸馏水中透析至中性， 得到梅鱼鱼鳔胶原蛋白 A 提取液 ； （3） 收集步骤 （2） 两次离心产生的沉淀， 将沉淀按照 1:40-45(m/v) 的料液比加入 pH 为 8.4-8.6 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液， 加入沉淀重量 1%-1.5% 的复合酶， 在。
5、 40.5下酶 解 24-36h， 加入终浓度为 201mmol/L 的 EDTA 灭酶， 在 40.5下离心 30-40min， 取上清 液用活性炭除色素后， 先于 pH 为 7.9-8.0 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液中透析 121h， 再 于 pH 为 7.5-7.7 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液中透析 121h， 最后于蒸馏水中透析至中 性， 得到梅鱼鱼鳔胶原蛋白 B 提取液 ； （4） 合并梅鱼鱼鳔胶原蛋白 A 提取液和梅鱼鱼鳔胶原蛋白 B 提取液， 40.5下离心 15-20min， 浓缩后冷冻干燥。 2. 根据权利要求 1 所述的具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺，。
6、 其特征 在于 ： 步骤 （1） 中梅鱼鱼鳔除杂蛋白及脱脂具体步骤为 ： 将梅鱼鱼鳔浸泡在 0.1-0.2mol/L NaOH溶液中搅拌4-6h， 至少连续重复6次， 然后用蒸馏水反复清洗至中性 ； 再用质量分数为 10-15% 的正丁醇溶液浸泡 4-6h， 至少连续重复 6 次， 然后用蒸馏水反复清洗至无正丁醇。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺， 其 特征在于 ： 步骤 （3） 中所述复合酶由胰蛋白酶和碱性蛋白酶组成。 4. 根据权利要求 3 所述的具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺， 其特征 在于 ： 胰蛋白酶与碱性蛋白酶的的重。
7、量比为 1:1-2。 5. 根据权利要求 1 或 2 所述的具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺， 其 特征在于 ： 步骤 （4） 中离心速度为 10000-12000r/min。 权 利 要 求 书 CN 103451258 A 2 1/8 页 3 具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺 技术领域 0001 本发明涉及海洋鱼类胶原蛋白提取技术领域， 特别涉及一种具有高抗疲劳活性的 梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺。 背景技术 0002 梅鱼 (Pseudosciaena polyactis) 属于脊索动物门硬骨鱼纲鲈形目鲈总科， 是温 水性近底层的小型经济鱼类， 产量较大， 在我国近。
8、海尤其是舟山海域一带均有出产。 梅鱼亦 称 “梅大头” 、“梅头” ， 形状像黄鱼而小， 头大， 尾柄细， 腹背和鳍都呈黄色。梅鱼作为我国海 洋捕捞的重要品种， 其分布广、 产量高、 价格便宜而为广大渔民所知。梅鱼加工后能获得大 量的鱼鳔， 现有处理方法常作为废料处理， 无法有效利用。 0003 梅鱼鱼鳔内富含有大量的生物大分子物质胶原蛋白， 它具有支撑器官和保护肌体 的功能， 也是组成细胞间质的最重要功能蛋白质。 人体对胶原蛋白的吸收和利用能力强， 它 主要以水溶液的形式贮存于组织中， 是人体补充和合成蛋白质的原料， 具有改善组织的营 养状况和促进机体新陈代谢的作用。现有研究中对胶原蛋白的注。
9、意力越来越多， 但未见关 于梅鱼鱼鳔胶原蛋白的相关报道。胶原蛋白的提取方法依据提取介质的不同可分为 5 类， 即酸法、 碱法、 酶法、 盐法以及热水浸提法等。把酶提法和其他提取方法相比， 酶提法得率 显著高于酸提法 （郑淼 . 中国林蛙皮肤胶原蛋白的提取纯化及性质研究 J .2008.6） 。酶 法提取胶原蛋白是利用蛋白酶将胶原迸行限制性降解， 将末端肽切割下来， 由于胶原肽链 间的共价交联键都是分子末端里的赖氨酸或羟赖氨酸的相互作用形成的， 末端肽被切下来 后。含三螺旋结构的主体部分可溶于低浓度有机酸或中性溶液中被提取出来。 0004 CN101234126A 的发明公开了一种霞水母来源的具。
10、有抗疲劳活性的胶原蛋白活性 肽及其制备工艺， 将霞水母脱除盐分， 再熔融处理， 最后经均质、 脱色、 脱盐和干燥后获得具 有抗疲劳活性的胶原蛋白活性肽。该方法不适用于梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺， 工艺简单易行， 胶原蛋白提取率高， 能够有效利用废弃的梅鱼鱼鳔， 提高了经济效益， 制得 的胶原蛋白常温下可溶于蒸馏水， 无异味， 苦味， 抗疲劳活性好， 无明显毒副作用。 0006 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 一种具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶原蛋白的制备工艺， 包括如下步骤 ： （1） 梅鱼鱼鳔去。
11、除内壁薄膜及血管， 清水洗净， 接着将梅鱼鱼鳔除杂蛋白及脱脂。 0007 （2）将步骤 （1）处理得到的梅鱼鱼鳔按照 1:30-40(m/v) 的料液比加入 pH 为 1.9-2.1 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液， 再加入梅鱼鱼鳔重量 1%-1.5% 的胃蛋白酶， 在 40.5下酶解 24-36h， 加入终浓度为 201mmol/L 的 EDTA 灭酶， 室温离心 15-20min， 取 上清液用活性炭除色素后， 在 40.5下离心 30-40min， 收集上清液， 先于 pH 为 3.5-4.0 的的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中透析121h， 再于pH为5.5-6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸 说。
12、 明 书 CN 103451258 A 3 2/8 页 4 缓冲液中透析 121h， 最后于蒸馏水中透析至中性， 得到梅鱼鱼鳔胶原蛋白 A 提取液。 0008 （3） 收集步骤 （2） 两次离心产生的沉淀， 将沉淀按照 1:40-45(m/v) 的料液比加入 pH为8.4-8.6的磷酸氢二钠-碳酸盐缓冲液， 加入沉淀重量1%-1.5%的复合酶， 在40.5 下酶解 24-36h， 加入终浓度为 201mmol/L 的 EDTA 灭酶， 在 40.5下离心 30-40min， 取上清液用活性炭除色素后， 先于 pH 为 7.9-8.0 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液中透析 121h， 再于 pH。
13、 为 7.5-7.7 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液中透析 121h， 最后于蒸馏水中 透析至中性， 得到梅鱼鱼鳔胶原蛋白 B 提取液。 0009 （4） 合并梅鱼鱼鳔胶原蛋白A提取液和梅鱼鱼鳔胶原蛋白B提取液， 40.5下离 心 15-20min， 浓缩后冷冻干燥。 0010 本发明采用海产品加工废料梅鱼鱼鳔作为提取原料， 先将梅鱼鱼鳔除杂蛋白、 脱脂， 然后先用胃蛋白酶提取胶原蛋白， 再将胃蛋白酶提取胶原蛋白后所得沉淀用复合酶 提取胶原蛋白， 合并提取到的胶原蛋白， 离心干燥后得到具有高抗疲劳活性的梅鱼鱼鳔胶 原蛋白。胶原蛋白提取率高， 能够有效利用废弃的梅鱼鱼鳔， 提高了经济效益， 制得。
14、的胶原 蛋白常温下可溶于蒸馏水， 无异味， 苦味， 抗疲劳活性好， 无明显毒副作用。 0011 本发明针对梅鱼鱼鳔的特性， 开发了有效的提取工艺， 在一次提取时 （即步骤 （2） ） ， 采用胃蛋白酶提取， 酶解温度低， 优化了胃蛋白酶的使用量和酶解温度及时间， 控制 了合适的料液比， 获得了较好的提取效果。 梅鱼鱼鳔与pH 为1.9-2.1的磷酸氢二钠-柠檬 酸缓冲液的料液比控制在 1:30-40(m/v)， 当料液比控制在 1:30-40 时， 随着料液比的增加， 提取率增大， 到料液比为1: 40提取率最佳， 料液比超过1: 40， 提取率反而会下降。 一次提 取时采用胃蛋白酶而非中性蛋。
15、白酶、 碱性蛋白酶等， 实验发现， 胃蛋白酶更适合梅鱼鱼鳔的 提取， 提取效果好。pH 为 1.9-2.1 缓冲液与胃蛋白酶配合提取， 提取效果好。酶解温度采 用40.5。 而非常规的37左右的温度， 这样提取效果好， 酶解温度在37左右时， 易于 导致梅鱼鱼鳔胶原蛋白变性， 抗疲劳活性差。采用 EDTA 灭酶， 而非常规的高温加热灭酶， 这 样梅鱼鱼鳔胶原蛋白不会变性， 抗疲劳活性好。 0012 一次提取后， 剩余的沉淀废渣， 本发明还进行了再提取， 开发了适合的提取条件， 采用复合酶提取， 优化复合酶使用量和酶解温度及时间， 控制了合适的料液比， 获得了较好 的提取效果。 0013 作为优。
16、选， 步骤 （1） 中梅鱼鱼鳔除杂蛋白及脱脂具体步骤为 ： 将梅鱼鱼鳔浸泡在 0.1-0.2mol/L NaOH 溶液中搅拌 4-6h， 至少连续重复 6 次， 然后用蒸馏水反复清洗至中性 ； 再用质量分数为 10-15% 的正丁醇溶液浸泡 4-6h， 至少连续重复 6 次， 然后用蒸馏水反复清 洗至无正丁醇。 0014 作为优选， 步骤 （3） 中所述复合酶由胰蛋白酶和碱性蛋白酶组成。 0015 作为优选， 胰蛋白酶与碱性蛋白酶的的重量比为 1:1-2。这样提取效果好。 0016 作为优选， 步骤 （4） 中离心速度为 10000-12000r/min。 0017 本发明的有益效果是 ： 工。
17、艺简单易行， 胶原蛋白提取率高， 能够有效利用废弃的梅 鱼鱼鳔， 提高了经济效益， 制得的胶原蛋白常温下可溶于蒸馏水， 无异味， 苦味， 抗疲劳活性 好， 无明显毒副作用。 附图说明 说 明 书 CN 103451258 A 4 3/8 页 5 0018 图 1 是羟脯氨酸标准曲线。 0019 图 2 梅鱼胶原蛋白及标准泳道的电泳图。 具体实施方式 0020 下面通过具体实施例， 并结合附图， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 0021 本发明中， 若非特指， 所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法， 如无特别说明， 均为本领域的常规方法。 0022 实。
18、验材料 新梅鱼鱼鳔购于舟山南珍菜市场。 0023 主要试剂 胃蛋白酶 （1:3000） ； 胰蛋白酶 （1:250） ； 碱性蛋白酶 （200000U/g） ； L- 羟脯氨酸 ： 上海朝晖生物科技有限公司 ； 次高分子量 Marker(43000 200000D) ： 中国科学院上海生命科学研究院 ； 血清尿素氮试剂盒， 肝糖原试剂盒， 肌糖原试剂盒 （均购自南京建成生物工程研究所） 。 0024 乙二醇独甲醚 ； 十二烷基磺酸钠 （SDS） ； 巯基乙醇 ； 丙烯酰胺 （Acr） ； N， N - 甲叉双 丙稀酰胺 （Bis） ； 对二甲氨基苯甲醛 ； 高氯酸 ； 氯胺 T ； 冰醋酸 ；。
19、 柠檬酸等均为分析纯试剂。 0025 主要仪器 RE-2000 型旋转蒸发仪 ： 上海亚荣生化仪器厂 ； CF16RX 型高速冷冻离心机 ； LGJ-18 冷冻干燥机 ： 北京松源科技有限公司 ； SSW-420-2S 型电热恒温水浴箱 ： 上海博讯实业有限公司 ； 752N 型紫外分光光度计 ： 上海精科电子有限公司 ； DS-1 组织捣碎机 ； 041BR 型电泳仪 ； 透析袋 （截留分子量 14000200D） ； HDM-500mL 型数显恒温搅拌电热套等。 0026 pH 1.9-2.1 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液 ： 先配制磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液 (pH4.0) ： 甲液。
20、 ： 取柠檬酸 21g， 加蒸馏水水使溶解 成 1000ml， 置冰箱内保存。乙液 ： 取磷酸氢二钠 71.63g， 加水使溶解成 1000ml。取上述甲 液 61.45ml 与乙液 38.55ml 混合， 摇匀， 即得。 0027 然后加入冰醋酸调节 pH 为 1.9-2.1 得 pH 1.9-2.1 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲 液。 0028 pH为5.5-6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液可在pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓 冲液加氢氧化钠调节。 0029 pH 为 8.4-8.6 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液 ： 0.05mol/L PBS( 磷酸缓冲液， PBS) 的配制 ： 甲液。
21、 ： 0.05mol/L Na2HPO4溶液 ： 称取磷酸氢二钠7.099g， 加蒸馏水至1000ml。 乙液 ： 0.05mol/L KH2PO4溶液 : 称取磷酸二氢钾 6.803g， 加蒸馏水至 1000m1。将甲乙液分装在 说 明 书 CN 103451258 A 5 4/8 页 6 棕色瓶内， 于 4冰箱中保存， 用时甲、 乙两液各按 1:1 比例混合， 即得 pH 为 6.81 的磷酸缓 冲液。 0030 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液 ： 称取Na2CO3 1.59g， NaHCO32.93g加蒸馏水至1000ml。 0031 将 0.05mol/L PBS 与 0.05 mo。
22、l/L 碳酸盐缓冲液 1:1 混匀后， 用氢氧化钠调节 pH 到 8.4-8.6， 得 pH 为 8.4-8.6 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液。 0032 7.9-8.0 的磷酸氢二钠 - 碳酸钠缓冲液、 pH 为 7.5-7.7 的磷酸氢二钠 - 碳酸钠缓 冲液根据 pH 做适应性调节。 0033 实施例 1 ： （1）梅鱼鱼鳔去除内壁薄膜及血管， 清水洗净， 接着将将梅鱼鱼鳔浸泡在 0.2mol/L NaOH 溶液中搅拌 4h， 至少连续重复 6 次， 然后用蒸馏水反复清洗至中性 ； 再用质量分数为 15% 的正丁醇溶液浸泡 4h， 至少连续重复 6 次， 然后用蒸馏水反复清洗至无正丁醇。
23、。 0034 （2）将步骤 （1）处理得到的梅鱼鱼鳔按照 1:30 (g/ml) 的料液比加入 pH 为 1.9-2.1 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液， 再加入梅鱼鱼鳔重量 1.5% 的胃蛋白酶， 在 40.5下酶解36h， 加入终浓度为201mmol/L的EDTA灭酶， 5000r/min室温离心20min， 取上清液用活性炭除色素后， 在 40.5下 10000r/min 离心 40min， 收集上清液， 先于 pH 为 3.5-4.0 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液中透析 121h， 再于 pH 为 5.5-6.0 的磷酸氢二 钠-柠檬酸缓冲液中透析121h， 最后于蒸馏水中透析至中性。
24、， 得到梅鱼鱼鳔胶原蛋白A提 取液。 0035 利用不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液梯度透析， 梅鱼鱼鳔胶原蛋白纯化效果 好。 0036 （3） 收集步骤 （2） 两次离心产生的沉淀， 将沉淀按照 1:45 (g/ml) 的料液比加入 pH 为 8.4-8.6 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液， 加入沉淀重量 1.5% 的复合酶， 所述复合酶由 胰蛋白酶和碱性蛋白酶组成， 胰蛋白酶与碱性蛋白酶的的重量比为 1: 2 ； 在 40.5下酶 解 36h， 加入终浓度为 201mmol/L 的 EDTA 灭酶， 在 40.5下离心 30min， 取上清液用活 性炭除色素后， 先于pH为7.9-8.0。
25、的磷酸氢二钠-碳酸盐缓冲液中透析121h， 再于pH为 7.5-7.7的磷酸氢二钠-碳酸盐缓冲液中透析121h， 最后于蒸馏水中透析至中性， 得到梅 鱼鱼鳔胶原蛋白 B 提取液。 0037 利用不同pH的磷酸氢二钠-碳酸盐缓冲液梯度透析， 梅鱼鱼鳔胶原蛋白纯化效果 好。 0038 （4） 合并梅鱼鱼鳔胶原蛋白 A 提取液和梅鱼鱼鳔胶原蛋白 B 提取液， 40.5下， 10000r/min 离心 20min， 浓缩后冷冻干燥， 得梅鱼鱼鳔胶原蛋白。 0039 实施例 2 ： （1）梅鱼鱼鳔去除内壁薄膜及血管， 清水洗净， 接着将将梅鱼鱼鳔浸泡在 0.1mol/L NaOH 溶液中搅拌 6h， 至。
26、少连续重复 6 次， 然后用蒸馏水反复清洗至中性 ； 再用质量分数为 10% 的正丁醇溶液浸泡 6h， 至少连续重复 6 次， 然后用蒸馏水反复清洗至无正丁醇。 0040 （2）将步骤 （1）处理得到的梅鱼鱼鳔按照 1: 40(g/ml) 的料液比加入 pH 为 1.9-2.1 的磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液， 再加入梅鱼鱼鳔重量 1% 的胃蛋白酶， 在 40.5 下酶解24h， 加入终浓度为201mmol/L的EDTA灭酶， 5000r/min室温离心15min， 取上清液 用活性炭除色素后， 在40.5下10000r/min离心30min， 收集上清液， 先于pH为3.5-4.0 说 明 。
27、书 CN 103451258 A 6 5/8 页 7 的的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中透析121h， 再于pH为5.5-6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸 缓冲液中透析 121h， 最后于蒸馏水中透析至中性， 得到梅鱼鱼鳔胶原蛋白 A 提取液 ； （3） 收集步骤 （2） 两次离心产生的沉淀， 将沉淀按照 1:40 (g/ml) 的料液比加入 pH 为 8.4-8.6的磷酸氢二钠-碳酸盐缓冲液， 加入沉淀重量1%的复合酶， 所述复合酶由胰蛋白酶 和碱性蛋白酶组成， 胰蛋白酶与碱性蛋白酶的的重量比为 1:1 ； 在 40.5下酶解 24h， 加 入终浓度为 201mmol/L 的 EDTA 灭酶， 在 4。
28、0.5下离心 40min， 取上清液用活性炭除色 素后， 先于 pH 为 7.9-8.0 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液中透析 121h， 再于 pH 为 7.5-7.7 的磷酸氢二钠 - 碳酸盐缓冲液中透析 121h， 最后于蒸馏水中透析至中性， 得到梅鱼鱼鳔 胶原蛋白 B 提取液 ； （4）合并梅鱼鱼鳔胶原蛋白 A 提取液和梅鱼鱼鳔胶原蛋白 B 提取液， 40.5下， 12000r/min 离心 15min， 浓缩后冷冻干燥， 得梅鱼鱼鳔胶原蛋白。 0041 试验部分 ： 1、 胃蛋白酶酶解条件的确定 对梅鱼鱼鳔， 选取胃蛋白酶添加量 （A） ， 料液比 （B） ， 酶解温度 （C） 和酶。
29、解时间 （D） 为影 响因素， 以胶原蛋白的提取率为指标， 采用 L9（34） 正交实验设计， 进行提取工艺研究， 确定 酶法提取的最佳工艺条件， 正交设计表见表 1。 0042 2、 胃蛋白酶酶解条件的确定 按照上述方法和 L9（34） 正交表进行正交实验， 梅鱼正交结果见表 2。对表 2 的的实验 数据进行 SPSS 分析发现 ： 各因素对胶原蛋白提取率的影响程度依次为 ： 酶解时间 酶解温 度加酶量料液比。 确定的梅鱼鱼鱼鳔胶原蛋白的最佳提取工艺条件为以1.0%的胃蛋白 酶， 采用 1:40 的料液比， 在 4条件下酶解 24h， 其提取率最高， 经验证实验确定为 63.96%。 004。
30、3 根据正交分析发现， 酶解时间在 24h 处提取率最高， 加酶量和酶解温度都有上升 趋势， 胶原蛋白的提取受温度的影响， 为了避免胶原蛋白变性或酶解成肽， 我们不再增加加 酶量和提高温度。 0044 说 明 书 CN 103451258 A 7 6/8 页 8 3、 胶原蛋白含量的测定 3.1 羟脯氨酸标准曲线的测定 分别取浓度为1.0ug/ml、 2.0 ug/ml、 2.5 ug/ml、 3.0 ug/ml、 3.5 ug/ml、 4.0 ug/ml、 4.5 ug/ml 的羟脯氨酸标准溶液 1mL 于试管中， 相继加入氯胺 T 溶液以及柠檬酸缓冲液 （pH6.0） 各 1mL， 混匀后。
31、在室温下放置 10min， 加入配好的高氯酸 （3.5mol/L） lmL， 混匀后在室温下放 置 10min， 加入 lmL 对二甲基氨基苯甲醛溶液显色， 混匀后将其迅速转移至 65水浴锅中， 保温 20min 后于 560nm 处测各组吸光值， 用蒸馏水作空白对照。以吸光值作为纵坐标， 羟脯 氨酸的浓度作为横坐标， 绘制羟脯氨酸的标准曲线并建立线性回归方程。 0045 3.2 梅鱼鱼鳔和胶原蛋白中羟脯氨酸含量的测定 取梅鱼鱼鳔1 g， 加入50 mL 6 mol/L的盐酸， 置于120 电热套中水解10 h。 水解液 冷却后定容至 100 mL 后抽滤， 取滤液 1 mL， 稀释 50 倍。
32、后调节 PH 值至 7.0， 转移到容量瓶中 说 明 书 CN 103451258 A 8 7/8 页 9 并定容至 100 mL。 0046 取冷冻干燥好的胶原蛋白粗品 0.01g， 加入 20ml 6 mol/L 的盐酸和 20ml 蒸馏水， 置于 120的电热套中水解 7.5h。鱼鳔和胶原蛋白水解液均按 3.1 的方法测其吸光值， 根 据标准曲线回归方程和吸光值计算原料中羟脯氨酸的含量和胶原蛋白的提取率。 0047 。 0048 4、 羟脯氨酸含量的测定 4.1 羟脯氨酸标准曲线的测定 图 1 显示了羟脯氨酸标准曲线的测定结果， 羟脯氨酸标准曲线的线性回归方程为 ： Y=0.0581X+。
33、0.0024。 羟脯氨酸质量浓度与吸光度之间的相关系数为R2=0.9987， 这一结果表 明吸光度值与羟脯氨酸浓度之间有着良好的相关性。 0049 4.2 鱼鳔羟脯氨酸含量的测定 经计算得新鲜梅鱼鱼鳔中羟脯氨酸的含量为 1.16%。干重梅鱼鱼鳔羟脯氨酸的含量为 3.47%。 0050 5、 SDS-PAGE 凝胶电泳 采用 SDS-PAGE 垂直电泳， 用 7.5% 的分离胶和 5% 浓缩胶， 电泳缓冲液为 Tris- 甘氨酸 缓冲液。取 1mg 胶原蛋白的样品溶解于 150uL 醋酸 - 醋酸钠缓冲液 （PH4.8） 与 30uL 样品 缓冲液 （6） 混匀， 100沸水浴煮沸 5min， 。
34、浓缩胶电压 80V， 分离胶电压所加大到 100V。电 泳时间为 2 3h。电泳结果见图 2， 其中， 第一泳道 （左） 为次高分子量的 marker， 第二泳道 （右） 为梅鱼鱼鳔提取的胶原蛋白。 0051 抗疲劳动物实验部分 1 动物与分组 将实验小鼠适应性喂养 4 天后， 剔除不合格者。对小鼠进行随机分组 ： 每组 8 只， 空白 对照、 梅鱼低剂量、 梅鱼中剂量、 梅鱼高剂量共4组。 生理盐水作为空白对照组 ； 梅鱼鱼鳔胶 原蛋白均分低、 中、 高三组， 灌胃剂量从低到高分别为 50 mg/kg 、 100 mg/kg 、 200mg/kg， 喂 食剂量均为 0.2ml。每天下午 2 。
35、点灌胃给药 1 次， 连续 4 周。实验期间， 小鼠自由摄食及饮 水。 0052 2 小鼠负重游泳实验 给药第28d， 末次灌胃30min后， 将小鼠称重， 置小鼠在游泳箱中游泳。 在鼠尾根部负体 重 5% 的铅皮， 放入水温为 251 、 水深 30 1cm 的游泳箱中进行负重游泳实验。不断 轻轻搅动水面使之不停游动。用秒表记录小鼠从入水至疲劳力竭时的游泳时间。以小鼠头 部沉入水中 10s 不浮出水面者为体力耗竭。 0053 3 小鼠肝糖原、 肌糖原及血清尿素氮的测定 给药第 28d ， 末次灌胃 30min 后 ， 将小鼠置于水温为 301 的游泳箱中不负重游 泳 60min 后， 休息 。
36、45min 后活体取血， 在 3500r/min 离心取血清以及解剖得到小鼠的肝、 肌 肉、 心、 脾、 肾、 胸腺， 用生理盐水清洗各脏器， 将其称量。按照肝糖原、 肌糖原和血清尿素氮 试剂盒说明书进行测定。具体操作参考试剂盒说明。 0054 2 结果与分析 2.1 小鼠负重游泳 说 明 书 CN 103451258 A 9 8/8 页 10 表 3 梅鱼鱼鳔胶原蛋白对小鼠负重游泳时间的影响 （xSD， n=8） 组别小鼠体重 （g）给药剂量 （mgkg-1d-1）游泳时间 （min） 空白对照组36.042.24-11.063.88 梅鱼低剂量组37.363.085016.453.87 梅。
37、鱼中剂量组36.554.5610019.166.87 梅鱼高剂量组36.643.2020021.206.85* 注 ： 与空白对照组相比， *p0.05 由表 3 可知， 梅鱼鱼鳔胶原蛋白具有延长小鼠负重游泳时间的作用。其中， 梅鱼高剂量 组效果最显著。 0055 2.2 小鼠肝糖原、 肌糖原含量的变化 表 4 梅鱼鱼鳔胶原蛋白对小鼠肝糖原、 肌糖原含量的影响 （xSD， n=8） 组别给药剂量 （mgkg-1d-1）肝糖原 (mgg-1)肌糖原 (mgg-1) 空白对照组-7.794.462.520.81 梅鱼低剂量组5010.225.763.551.50 梅鱼中剂量组10011.122.7。
38、53.931.40 梅鱼高剂量组20016.705.53*5.641.60* * 与空白对照组相比注 ：P0.05 由表 4 可知， 梅鱼鱼鳔胶原蛋白均能够增加肝糖原的含量和肌糖原的含量。梅鱼高剂 量组活性最好。 0056 2.3 小鼠血清尿素氮含量的变化 表 5 鳗鱼和梅鱼鱼鳔胶原蛋白对小鼠血清尿素氮含量的影响 （xSD， n=8） 组别给药剂量 （mgkg-1d-1）血清尿素氮 （mmol/L） 空白对照组-10.721.92 梅鱼低剂量组508.731.99 梅鱼中剂量组1008.161.03* 梅鱼高剂量组2008.141.15* * 注 ： 与空白对照组相比P0.05 由表 5 可知。
39、， 梅鱼鱼鳔胶原蛋白均能降低血清尿素氮含量。其中梅鱼高剂量组减少或 抑制疲劳小鼠血清尿素氮产生作用最明显。 0057 3 结论 本实验研究首先通过负重游泳持续时间直接观察到了梅鱼鱼鳔胶原蛋白能延长小鼠 的游泳时间， 然后通过测定肝糖元、 肌糖原和血清尿素氮的生化指标， 研究了梅鱼鱼鳔胶原 蛋白的抗疲劳作用。 根据功能学评价检验方法， 实验小鼠负重游泳实验结果阳性， 肝糖原、 肌糖原、 血清尿素三项生化指标中任二项指标阳性， 可判定该受试样品具有缓解体力疲劳 功能的作用。 本实验在实验小鼠负重游泳实验结果阳性基础上， 其余三项生化指标均阳性， 因此可判定梅鱼鱼鳔胶原蛋白能改善机体能量代谢， 加速肝糖原分解供能， 减少蛋白质和 含氮化合物分解， 从而降低血尿素氮， 具有抗疲劳作用。 0058 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上的 限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 说 明 书 CN 103451258 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103451258 A 11 。