技术领域
本发明涉及一种人原代角质细胞分离制备的方法。
背景技术
人角质细胞是组成人表皮的主要细胞，由于培养的表皮细胞膜片可以用于临 床移植治疗烧伤、白癜风等多种皮肤疾病，获得稳定高存活率的人表皮角质细胞 对于基础和临床研究都十分重要。目前普遍的角质细胞分离和培养体系大多会引 入非人源的成分，比如使用血清和滋养层细胞，大大带来安全风险。同时角质细 胞是一种非常容易终末分化的原代细胞，而作为研究对象，往往需要比较好的稳 定性和传代能力，这就需要对分离和培养体系进行改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种角质细胞分离制 备的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明一种人原代角质细胞分离制备的方法，其包括以下步骤：
(1)原代角质细胞分离：取新鲜皮肤样本经乙醇消毒，去除皮肤表面微生 物的污染，之后用磷酸盐缓冲液清洗若干次，去除样本上的残余乙醇，将样本切 割成1.8～2.2mm直径的微小颗粒；用35～45mL酶活为150-300U/mL的胶原蛋 白酶处理所得微小颗粒，4℃过夜放置；过滤收集含角质细胞的表皮组织，并放 入胰酶-EDTA中35～40℃处理1-3小时，分离角质细胞；在转速为1800rpm下离 心收集细胞沉淀；用40mLDMEM细胞培养基洗涤细胞2次；收集到的皮肤细 胞用角质细胞专用培养液DKSFM重悬，使用血细胞计数仪对细胞数量及活性进 行计算；按照5×104cells/cm2接种在直径为100mm细胞培养皿；
(2)原代角质细胞培养：接种后第2天，倒置显微镜下观察细胞贴壁生长 状态，记录生长状态；细胞接种后每天更换新鲜培养基；细胞接种后每天观察记 录细胞贴壁生长情况；
(3)原代角质细胞冻存：细胞接种培养3-7天后达到60-90％的汇合度，弃 去培养基，用磷酸盐缓冲液清洗数遍；用5mLTrypLE处理细胞，在37℃，5-10 分钟；显微镜下观察细胞收缩情况，待所有细胞变圆后加入10mLDKSFM，轻 微吹打使细胞分散成悬液，取出100ul细胞进行细胞计数，在1800rpm下离心收 集细胞沉淀；90％DKSFM+10％DMSO配置细胞冻存液，根据细胞计数结果， 按照1×106cells/mL添加细胞冻存液，重悬细胞，置入程序性降温盒，放入零下 80℃超低温冰箱过夜冻存细胞；从上步冻存盒中取出细胞，放入液氮罐中长期保 存，并记录保存批次及数量；
(4)原代角质细胞活性检测：从同一批冻存的原代角质细胞中任意选取1 管，37摄氏度水浴中迅速融化细胞，加入不含抗生素的DKSFM细胞培养液， 取出100ul进行细胞数量和存活率的计算；细胞悬液1800rpm离心，收集细胞沉 淀；DKSFM重悬细胞，使细胞均匀分散，接种细胞培养皿；之后在37℃下采用 5％的CO2培养；隔天更换培养基，至细胞汇合度达到40-60％时，改为每天更换 培养基；每天用倒置显微镜观察细胞生长状态及有否细菌感染情况，并拍照记录； 细胞汇合度达到60-90％时，传代细胞；细胞持续培养至完全分化，停止增殖时， 根据最终细胞数量及复苏时起始细胞数量，计算倍增周期及次数。
本发明所达到的有益效果是：
(1)采用DKSFM(Definedkeratinocyte－SFM)成分限定的无血清角质细 胞专用培养体系，不含牛血清成分及滋养层细胞，避免了非人源活性蛋白及其它 生物成分的引入，使下游研究体系更单一；
(2)直接冻存原代细胞，复苏后细胞具有更高的存活率，可以高达75％以 上，同时由于采用成分限定的无血清角质细胞专用培养基，减少了促进细胞分化 的因子含量，有利于角质细胞体外培养周期的延长，表现出更多的倍增次数，大 于26次，使下游研究体系更稳定。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例 仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明一种角质细胞分离制备的方法，其包括以下步骤：
(1)原代角质细胞分离：取新鲜包皮环切术后皮肤样本经乙醇消毒，去除 皮肤表面微生物的污染，之后用磷酸盐缓冲液清洗若干次，去除样本上的残余乙 醇，将样本切割成2mm直径的微小颗粒；用35～45mL酶活为150-300U/mL的 胶原蛋白酶处理所得微小颗粒，4℃过夜放置；过滤收集含角质细胞的表皮组织， 并放入胰酶-EDTA中35℃处理1小时，分离角质细胞；在转速为1800rpm下离 心收集细胞沉淀；用40mLDMEM(高糖)细胞培养基洗涤细胞2次；收集到的 皮肤细胞(含大量角质细胞，少量黑素细胞和成纤维细胞等)用角质细胞专用培 养液DKSFM(Gibco，ThermoFisher，USA)重悬，使用血细胞计数仪对细胞数 量及活性进行计算；按照5×104cells/cm2接种在直径为100mm细胞培养皿 (Corning，USA)；
(2)原代角质细胞培养：接种后第2天起，在倒置显微镜下观察并记录细 胞贴壁生长状态；细胞接种后每天更换新鲜培养基；细胞接种后每天观察记录细 胞贴壁生长情况；
(3)原代角质细胞冻存：细胞接种培养3-7天后达到60％的汇合度，弃去 培养基，用磷酸盐缓冲液清洗数遍；用5mLTrypLE(Gibco，ThermoFisher，USA) 处理细胞，在37℃，5-10分钟；显微镜下观察细胞收缩情况，待所有细胞变圆 后加入10mLDKSFM，轻微吹打使细胞分散成悬液，取出100ul细胞进行细胞计 数，在1800rpm下离心收集细胞沉淀；90％DKSFM+10％DMSO配置细胞冻存 液，根据细胞计数结果，按照1X106cells/mL添加细胞冻存液，重悬细胞，置入 程序性降温盒，放入零下80℃超低温冰箱过夜冻存细胞；从上步冻存盒中取出 细胞，放入液氮罐中长期保存，并记录保存批次及数量；
(4)原代角质细胞活性检测：从同一批冻存的原代角质细胞中任意选取1 管，37摄氏度水浴中迅速融化细胞，加入不含抗生素的DKSFM细胞培养液， 取出100ul进行细胞数量和存活率的计算(活细胞/细胞总数)；细胞悬液 1800rpm离心，收集细胞沉淀；DKSFM重悬细胞，使细胞均匀分散，接种细胞 培养皿；之后在37℃下采用5％的CO2培养；隔天更换培养基，至细胞汇合度达 到40-60％时，改为每天更换培养基；每天用倒置显微镜观察细胞生长状态及有 否细菌感染情况，并拍照记录；细胞汇合度达到60％时，传代细胞；细胞持续培 养至完全分化，停止增殖时，根据最终细胞数量及复苏时起始细胞数量，计算倍 增周期及次数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本 发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员 来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分 技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同 替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。