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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710860293.4 (22)申请日 2017.09.21 (71)申请人 云南中烟工业有限责任公司 地址 650231 云南省昆明市五华区红锦路 367号云烟科技园C区 (72)发明人 管莹米其利巩效伟洪鎏 朱洲海徐玉琼陆舍铭高茜 李雪梅夭建华 (74)专利代理机构 昆明协立知识产权代理事务 所(普通合伙) 53108 代理人 谢嘉 (51)Int.Cl. C12Q 1/02(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 一种针对电子烟气溶胶。
2、水提物的细菌回复 突变试验 (57)摘要 本发明公开了一种针对电子烟气溶胶水提 物的细菌回复突变试验。 包括样品前处理、 受试 菌培养、 受试菌浓度的确定、 S9混合液的配制、 受 试物的分组、 受试物的培养、 结果判定等步骤。 本 发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用 方式， 建立了全新的电子烟烟雾样品前处理方法 (捕集瓶捕集法)， 并确定了样品检测剂量， 形成 了适合电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试 验方法。 样品的有效处理、 检测剂量的优化设定， 使得本发明方法能够准确有效的检测电子烟气 溶胶水提物的遗传毒性。 权利要求书2页 说明书6页 CN 107746872 A 2018.0。
3、3.02 CN 107746872 A 1.一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验， 具体为以下步骤： (1)样品前处理： 采用直线型吸烟机， 在抽吸容量为55.0ml， 抽吸持续时间3s， 抽吸频率30s的条件下， 连 续抽吸100口电子烟， 用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾， 捕集浓度为20口/mL， 捕集液 用0.22 m无菌过滤器过滤除菌， 得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液， -80保存待 用； (2)受试菌的培养： 将TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌分别加入到装有培养基的无菌三角瓶中， 置于37 条件下， 静置培养16h或100次/min振荡培养10h； (3)。
4、受试菌浓度的确定： 用紫外分光光度计分别测定培养所得TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌在600nm下的 OD值， 然后用培养基稀释菌液至其OD600值为0.5； (4)S9混合液的配制： 将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照1:1的体积比混合后配制成 氯化钾-氯化镁溶液； 取磷酸缓冲液、 氯化钾-氯化镁溶液、 0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸钠盐 缓冲液和0.025mol/L的辅酶-溶液， 按照30:2:5:8的体积比混合， 用0.22 m无菌过滤器过 滤除菌后， 与S9代谢活化液按照9:1的体积比混合， 配制成S9混合液备用； (5)受试物的分组 将受试物。
5、分为四组： 自发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组和样品测试组； 其中， 样品测 试组按表1所示的不同剂量将待测液加入培养中； 自发回变组、 溶剂对照组和阳性对照组则 按表2所示的不同剂量将待测液加入培养中； 将自发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组、 样品 测试组样品分别按表3所示的4个检测体系加样； 表1 Ames细菌回复突变试验样品测试组加样表 表2 Ames细菌回复突变试验自发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组加样表 权利要求书 1/2 页 2 CN 107746872 A 2 表3 Ames细菌回复突变试验4个检测体系加样表 (6)受试物的培养 将各组受试物分别加入到2.0mL， 4。
6、0水浴保温的0.6(W/V)琼脂顶层培养基中， 混匀 后迅速倒入1.8(W/V)琼脂底层培养基中， 转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上， 平 放固化， 每个剂量设3个复皿， 置于37、 5CO2培养箱中培养48h， 观察结果； (7)结果判定 计算培养长出的回变菌落数， 在背景生长良好的条件下， 样品测试组诱发的回变菌落 数等于或大于自发回变组菌落数的2倍以上， 并有剂量效应关系， 即认为样品测试组试验结 果为阳性。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107746872 A 3 一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验 技术领域 0001 本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领。
7、域， 具体是涉及一种针对 电子烟烟雾的气溶胶水提物进行的细菌回复突变试验方法。 背景技术 0002 现今， 化学物质及其污染物对人体的潜在危害越来越受到社会的普遍关注与重 视。 B.N.Ames等于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)被世界 各国及组织广为采用， 是目前国际公认的检测新药、 食品添加剂,食品包装材料及化妆品等 的致突变性、 致癌性的首选试验方法。 国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成 立了卷烟烟气体外毒理测试工作组， 经过工作组大量的文献调研及研究工作， 该工作组推 荐采用细菌回复突变试验(Ames试验)对卷烟烟气冷凝物潜在的致。
8、突变性进行检测。 该检测 方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。 0003 烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入， 导致了烟草公司寻求风险 更低、 无环境烟气的新型烟草制品， 电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混 合物所带来的危害， 现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。 电子 烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、 香味物质等组成的液体转化 为类似于卷烟烟雾的混合物， 再将汽化丙三醇/尼古丁等混合 “烟雾” 传送至消费者， 使人吸 入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。 使用过程中不产生烟气， 其 使用方式显著有别于传统卷。
9、烟， 检测对象的改变导致样品前处理方法、 检测剂量也有所不 同， 用于检测传统卷烟致突变性的细菌回复突变试验(Ames试验)已不能满足电子烟制品致 突变性检测的需要， 且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定电子烟气溶胶水提物细菌 回复突变试验的标准方法。 0004 电子烟制品通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、 香味物质等组成的烟液转化 为类似于卷烟烟雾的混合物， 再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合 “烟雾” 传送至消费者， 使 人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。 电子烟烟液经雾化后进 入口腔和呼吸道， 经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。 而现有技术通常是直接对电子 烟。
10、液本身进行分析测试， 未考虑其抽吸时的形态、 迁移等过程， 导致分析测试的结果不能准 确反应电子烟烟雾真实的遗传毒性。 发明内容 0005 本发明的目的在于针对现有技术的不足， 提供一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提 物进行的细菌回复突变试验方法， 以满足电子烟制品致突变性检测的需要， 增强检测结果 的准确性， 进而更为有效地评价电子烟制品的安全性。 0006 本发明的目的通过以下技术方案予以实现。 0007 除非另有说明， 本发明所采用的百分数均为体积百分数。 0008 一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验， 具体为以下步骤： 说明书 1/6 页 4 CN 107746872 A 4 0。
11、009 (1)样品前处理： 0010 采用直线型吸烟机， 在抽吸容量为55.0ml， 抽吸持续时间3s， 抽吸频率30s的条件 下， 连续抽吸100口电子烟， 用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾， 捕集浓度为20口/mL， 捕集液用0.22 m无菌过滤器过滤除菌， 得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液， -80 保存待用； 0011 (2)受试菌的培养： 0012 将TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌分别加入到装有培养基的无菌三角瓶中， 置 于37条件下， 静置培养16h或100次/min振荡培养10h； 0013 (3)受试菌浓度的确定： 0014 用紫外分光光度计分别测定培养所得T。
12、A98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌在600nm 下的OD值， 然后用培养基稀释菌液至其OD600值为0.5； 0015 (4)S9混合液的配制： 0016 将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照1:1的体积比混合后配 制成氯化钾-氯化镁溶液； 取磷酸缓冲液、 氯化钾-氯化镁溶液、 0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸 钠盐缓冲液和0.025mol/L的辅酶-溶液， 按照30:2:5:8的体积比混合， 用0.22 m无菌过滤 器过滤除菌后， 与S9代谢活化液按照9:1的体积比混合， 配制成S9混合液备用； 0017 (5)受试物的分组 0018 将受试物分为四组： 自。
13、发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组和样品测试组； 其中， 样 品测试组按表1所示的不同剂量将待测液加入培养中； 自发回变组、 溶剂对照组和阳性对照 组则按表2所示的不同剂量将待测液加入培养中； 将自发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组、 样品测试组样品分别按表3所示的4个检测体系加样； 0019 表1Ames细菌回复突变试验样品测试组加样表 0020 0021 表2Ames细菌回复突变试验自发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组加样表 0022 0023 说明书 2/6 页 5 CN 107746872 A 5 0024 表3Ames细菌回复突变试验4个检测体系加样表 0025 0026 (6。
14、)受试物的培养 0027 将各组受试物分别加入到2.0mL， 40水浴保温的0.6(W/V)琼脂顶层培养基中， 混匀后迅速倒入1.8(W/V)琼脂底层培养基中， 转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层 上， 平放固化， 每个剂量设3个复皿， 置于37、 5CO2培养箱中培养48h， 观察结果； 0028 (7)结果判定 0029 计算培养长出的回变菌落数， 在背景生长良好的条件下， 样品测试组诱发的回变 菌落数等于或大于自发回变组菌落数的2倍以上， 并有剂量效应关系， 即认为样品测试组试 验结果为阳性。 0030 本发明方法与现有技术相比， 优点在于： 综合考察了电子烟制品的使用特点和作 用方式，。
15、 建立了全新的电子烟烟雾样品前处理方法(捕集瓶捕集法)， 并确定了样品检测剂 量， 形成了适合电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验方法。 样品的有效处理、 检测剂量 的优化设定， 使得本发明方法能够准确有效的检测电子烟气溶胶水提物的遗传毒性。 具体实施方式： 0031 以下结合实施例对本发明做进一步的详细说明， 但实施例并不是对本发明技术方 案的限定， 所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换均应属于本发明的保护范围。 0032 实施例1 0033 配制3种电子烟烟液， 以捕集瓶捕集到的气溶胶水提物作为前处理样品， 检测其遗 传毒性。 0034 3种电子烟烟液分别为： 1#、 2#、 3#烟液。
16、。 3种电子烟烟液的烟碱及溶剂含量见表4。 0035 表4.3种电子烟烟液主要成分 0036 0037 具体检测过程如下： 0038 (1)样品前处理： 说明书 3/6 页 6 CN 107746872 A 6 0039 采用直线型吸烟机， 在抽吸容量为55.0ml， 抽吸持续时间3s， 抽吸频率30s的条件 下， 连续抽吸100口电子烟， 用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾， 捕集浓度为20口/mL， 捕集液用0.22 m无菌过滤器过滤除菌， 得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液， -80 保存待用； 0040 (2)受试菌的培养： 0041 将TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌分别。
17、加入到装有培养基的无菌三角瓶中， 置 于37条件下， 静置培养16h或100次/min振荡培养10h； 0042 (3)受试菌浓度的确定： 0043 用紫外分光光度计分别测定培养所得TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌在600nm 下的OD值， 然后用培养基稀释菌液至其OD600值为0.5； 0044 (4)S9混合液的配制： 0045 将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照1:1的体积比混合后配 制成氯化钾-氯化镁溶液； 取磷酸缓冲液、 氯化钾-氯化镁溶液、 0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸 钠盐缓冲液和0.025mol/L的辅酶-溶液， 按照30:2:5:8。
18、的体积比混合， 用0.22 m无菌过滤 器过滤除菌后， 与S9代谢活化液按照9:1的体积比混合， 配制成S9混合液备用； 0046 (5)受试物的分组 0047 将受试物分为四组： 自发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组和样品测试组； 其中， 样 品测试组按表5所示的不同剂量将待测液加入培养中； 自发回变组、 溶剂对照组和阳性对照 组则按表6所示的不同剂量将待测液加入培养中； 将自发回变组、 溶剂对照组、 阳性对照组、 样品测试组样品分别按表7所示的4个检测体系加样； 0048 表5Ames细菌回复突变试验样品测试组加样表 0049 0050 表6Ames细菌回复突变试验自发回变组、 溶剂对照。
19、组、 阳性对照组加样表 0051 0052 说明书 4/6 页 7 CN 107746872 A 7 0053 表7Ames细菌回复突变试验4个检测体系加样表 0054 0055 (6)受试物的培养 0056 将各组受试物分别加入到2.0mL， 40水浴保温的0.6(W/V)琼脂顶层培养基中， 混匀后迅速倒入1.8(W/V)琼脂底层培养基中， 转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层 上， 平放固化， 每个剂量设3个复皿， 置于37、 5CO2培养箱中培养48h， 观察结果； 0057 (7)结果判定 0058 计算培养长出的回变菌落数， 在背景生长良好的条件下， 样品测试组诱发的回变 菌落数等于或。
20、大于自发回变组菌落数的2倍以上， 并有剂量效应关系， 即认为样品测试组试 验结果为阳性。 0059 检测结果如表8所示： 阳性对照组、 自发回变组的回复突变菌落数在正常范围内， 表明检测体系正常， 此次试验成功。 溶剂对照组与自发回变组相比回复突变菌落数无显著 差异(P0.05)， 证明无血清细胞培养基无遗传毒性可作为捕集电子烟气溶胶的溶剂使用， 样品测试组与自发回变组相比无显著差异(P0.05)， 且无剂量效应关系。 证明受试的3种电 子烟烟液气溶胶水提物无遗传毒性。 0060 表8电子烟溶剂气溶胶(捕集瓶捕集法) 说明书 5/6 页 8 CN 107746872 A 8 0061 0062 捕集瓶捕集法通过模拟抽吸模式及电子烟烟雾暴露方式最大限度地反映了真实 抽吸状态， 从而能够准确有效地检测电子烟气溶胶水提物的遗传毒性。 0063 综上所述， 本发明综合考察了电子烟制品的暴露途径， 作用方式， 建立了电子烟烟 雾样品前处理方法， 并确定了样品检测剂量， 形成了适合电子烟气溶胶水提物的细菌回复 突变试验方法。 样品的有效处理、 检测剂量的优化设定， 使得本发明方法能够准确有效的检 测电子烟气溶胶水提物的遗传毒性。 说明书 6/6 页 9 CN 107746872 A 9 。