技术领域
本发明涉及植物功能天然活性成分的提取技术领域，具体涉及一种黑米花青素的提取方法。
背景技术
花青素(Anthocyanidin)在植物界中广泛存在，是一种水溶性色素，属于酚类化合物中的类黄酮类(flavonoids)。花青素由苯基丙酸路径和类黄酮生合成途径生成，其中由许多酵素调控催化。在自然状态下，由于花青素不稳定，在植物中主要以糖苷(称为花色苷)的形式存在于植物细胞液中，不同的花色苷呈现出不同的颜色，从而构成了花、果实、茎和叶五彩缤纷的美丽色彩，包括蓝、紫、紫罗兰、洋红、红和橙色。花色苷具有很强的抗氧化作用，可以清除体内自由基；降低血清及肝脏中脂肪含量；抗变异、抗肿瘤、保护胃黏膜，减缓衰老及癌症病变，延迟血小板凝集；维持血管正常渗透压，改善心肌营养等多种保健功能。
因此，花青素具有独特的营养价值和药用价值，对维持正常的人体生理功能具有重要作用。但目前所用的色素多为合成色素，几乎都有不同程度的毒性，长期使用会危害人的健康，因此，天然色素的开发利用越来越受到科研领域的重视，降低花青素的提取成本，提取高纯度的花青素，对于提高人类身体健康以及疾病的防治水平具有重大意义。
花青素提取方法的选择决定于提取的目的和花青素本身的组成，用于定性或定量分析时应选择的色素尽可能处于天然状态的提取方法，用于食物着色时应关注色素的最大产率、着色力和稳定性。国内外应用最多的花色苷的提取方法是溶剂提取法。但这些传统方法提取色素时，有机溶剂毒副作用大，且提取效率低下、操作耗费时间、消耗能量大，提取成本较高。
黑米(black rice)是珍贵的特殊稻种资源，属于糯米类，是我国古老而名贵的水稻品种，相传距今二千多年的历史。有研究表明：黑米中含有大量以花青素为主且抗氧化物质活性较高的天然色素。黑米具有很高的营养价值和药用价值，俗称“药米”，因此，加大对黑米花青素的开发利用，提高其利用价值，对黑米资源的深加工及工业化生产都具有重要意义。生产上如果能兼顾黑米产量和作为花青素提取原料的干物质质量，利用黑米提取花青素作为天然添加剂，不但可以生产粮食，而且还可以降低天然花青素提取成本，综合提高黑米的经济效益。
目前常用提取方法得到的黑米花青素中含有较多糖、有机酸和蛋白等杂质，使得产品的质量差、稳定性低，对产品应用造成了很大的困难。
发明内容
超声波协同微波提取技术，是一种新型的天然辅助溶剂提取技术，它利用了超声波的热效应、空化技术、加快了细胞壁的破碎使细胞外溶剂轻松进入细胞内部，从而促进了细胞内部物质的溶出。由于超声波协同微波提取具有简便、快速、加热均匀等优点，因此在植物化学领域提取天然色素方面应用广泛。
为此，本发明针对上述问题的不足，旨在提供一种行之有效的提取方法，具体利用超声波协同微波辅助提取黑米花青素，能够进行快速、便捷的提取黑米中的花青素。
具体的，本发明提供的黑米花青素的提取方法，包括如下步骤：
S1：以黑米籽粒作为原料，进行低温烘干，然后粉碎成20-60目的细粉；
S2：以体积比为70∶20-30的60-85％乙醇和0.05-1mol/L的盐酸混合液作为提取液对所述细粉进行超声波协同微波辅助提取，所述细粉和所述提取液的料液比为1-4∶10，料液pH调节至3.8，超声波协同微波功率450-500W，提取温度40-55℃，提取时间为30-60min；
S3：对超声波协同微波辅助提取后的混合物用高速离心机在4000rpm/min的速度下离心10-15min，分离滤渣和滤液；
S4：将得到的滤液在35-40℃下用真空旋转蒸发，获得浓缩液；
S5：将获得的浓缩液加入到填充有大孔树脂的层析柱中，所述浓缩液的加入体积为大孔树脂体积的1/3-2/3，控制流速为1.0-1.5mL/min，随后对大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液；
S6：用旋转蒸发仪在35-40℃下将洗脱液进行浓缩，之后冷冻干燥，得到黑米的花青素冻干粉。
优选地，所述S3和S4之间还包括S33，所述S33具体为：将所述滤液通过截留分子量为3000Da有机物的超滤膜设备进行超滤过滤，操作压力0.3Mpa，过滤时间8-10h，过滤温度为室温；
所得超滤流出液之后再进行S4的操作。
更优选地，所述S33和S4之间还包括S34，所述S34具体为：将S33得到的超滤流出液通过截留分子量为200Da的纳滤膜进行浓缩，操作压力为0.2Mpa，过滤5h，收集截留液；
所得截留液之后再进行S4的操作。
更优选地，所述S5和S6之间还包括S56，所述S56具体为：将洗脱液放入截留分子量为200Da的纳滤膜分离设备中，控制操作压力为0.2Mpa，使溶液保持室温，收集黑米花青素纳滤流出液，并通过反渗透回收洗脱液中的乙醇；
所得纳滤流出液之后再进行S6的操作。
优选地，S1中，所述低温烘干温度为35℃。
优选地，S2中，所述盐酸浓度为0.1-0.2mol/L。
优选地，S6中，所述洗脱液经旋转蒸发仪浓缩后，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥至水分含量在5％以下，冷冻干燥的真空度控制在15Pa以下，温度控制在-40℃以下。
更优选地，本发明提供的黑米花青素的提取方法，包括如下步骤：
S11：以黑米籽粒作为原料，进行35℃烘干，然后粉碎成40目的细粉；
S21：以体积比为70∶30的85％乙醇和0.1mol/L的盐酸作为提取液对黑米细粉进行超声波协同微波辅助提取，所述黑米细粉和所述提取液的料液比为1∶10，pH值为3.8，微波功率450W，提取温度40℃，提取时间为50min；
S31：对超声波协同微波辅助提取后的混合物用高速离心机在4000rpm/min的速度下离心10min，分离滤渣和滤液；
S41：将得到的滤液通过截留分子量为3000Da有机物的超滤膜设备进行超滤过滤，操作压力0.3Mpa，过滤时间10h，过滤温度为室温，得到超滤流出液；
S51：将超滤流出液通过截留分子量为200Da的纳滤膜进行浓缩，操作压力为0.2Mpa，过滤5h，收集截留液；
S61：将截留液在35℃下用真空旋转蒸发，获得浓缩液；
S71：将获得的浓缩液加入到填充有大孔树脂的层析柱中，所述浓缩液的加入体积为大孔树脂体积的1/2，控制流速为1.2mL/min，随后对大孔树脂依次采用水洗和醇洗，收集洗脱液；
S81：将洗脱液放入截留分子量为200Da的纳滤膜分离设备中，控制操作压力为0.2Mpa，使溶液保持室温，收集黑米花青素纳滤流出液，并通过反渗透回收洗脱液中的乙醇；
S91：用旋转蒸发仪在35-40℃下将洗脱液进行浓缩，并将浓缩液放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥至水分含量在5％以下，控制真空度在15Pa以下，温度为-40℃以下，干燥完全后得到黑米花青素粉末。
本发明提供的方法具有如下有益效果：
(1)由于黑米中的花青素稳定的存在于植物细胞内，受到细胞壁的保护，并且在细胞内还与其他多种有机物形成共轭体，因此难以提取。本发明采用的超声波协同微波辅助提取法中超声波其独有的运动机理可以使细胞内部物质产生运动、摩擦，使细胞质运动起来，正是因为这种运动，才使得细胞有破碎的因素，在这里，细胞膜透性被改变，可以让有效物质自由进出，有利于人体代谢、循环，提供所需物质，蛋白合成也得到了加速，加快了更新速度。在细胞内部结构的变化，导致细胞功能的变化，从而延长软硬结缔组织。
(2)该方法选择性好，可有效分离黑米花青素中的多糖、有机酸和蛋白等杂质，萃取率高，产品质量高，即使是微量也可以提取，提取速度快，操作简单，废液排放量少；
(3)加热均匀，且热效率较高，超声波协同微波萃取时没有高温热源，因而可消除温度梯度，且加热速度快，物料的受热时间短，因而有利于花青素的萃取；
(4)超声波协同微波萃取不存在热惯性，因而过程易于控制，处理批量较大，萃取效率高，省时；
(5)由于超声波协同微波可对萃取物质中的不同组分进行选择性加热，因而可使目标组分与基体直接分离开来，从而可提高萃取效率和产品纯度。
附图说明
图1为本发明实施例1中黑米花青素酸性乙醇液的吸收光谱图；
图2为本发明实施例1中黑米花青素酸性乙醇扫描图的峰值检出图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中所用到的试剂均为常规试剂。
一、黑米籽粒中花青素的测定
对黑米籽粒所提取的花青素含量的测定方法有pH示差法，HPLC法和HPLC/MS法等，本发明中对黑米籽粒所提取的花青素含量的测定采用pH示差法，具体如下：
配制pH值为1.0的缓冲液∶准确称取1.49gKCl用dd H2O溶解定容至100ml，准确量取1.7ml盐酸(分析纯)用dd H2O定容至100ml，配成0.2mol/L盐酸溶液，将盐酸溶液与KCl溶液以25∶67的比例混合，用KCl溶液调pH1.0。配制pH值为4.5的缓冲液∶准确称取1.64gNaAc用dd H2O溶解定容至100ml，用盐酸调pH4.5。黑米中花青素的主要成分为矢车菊花素-3-葡萄糖苷(Cyd-3-glu)，由于花青素的的色调和色度随pH值的不同而发生改变，而干扰物质特征光谱不随pH的改变而改变。pH为1时，花青素以红色的2-苯基苯并吡喃的形式存在，pH为4.5时，花青素以无色的甲醇假碱的形式存在。结合朗伯-比尔定律可得出，在两个不同的pH值下，花青素溶液的吸光度的差值与花青素的含量成比例。准确称取0.1g的黑米花青素干粉，用稀醇溶解，用dd H2O定容到100ml。然后取10ml样液两份，分别用pH值为1.0和4.5的缓冲液定容至10mL。室温下放置15min，以dd H2O作对照，用紫外可见分光光度计在480～700nm扫描最大吸收峰，并测定在最大吸收峰处和700nm处的吸光度值，计算花青素含量：
% w / W = A ϵ L × M W × D F × V W t × 100 % ]]>
A：吸光度；ε：矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔吸收系数(26900)；MW：花青素的摩尔质量(449.2)；DF：稀释倍数；V：体积(mL)；Wt：样品质量(mg)；L：光路路径长度(1cm)。dd H2O作参比；用A700nm来消除样液混浊的影响。
A＝(A520nmpH1.0-A700nmpH1.0)-(A520nmpH4.5-A700nmpH4.5)
二、黑米的花青素的测定中最大吸收波长的确定
具体包括如下步骤，精确称取已制备好的黑米籽粒10.0g，加入V/V＝70/30的乙醇/酸混合液100mL，黑米籽粒混合液的料液比1∶10，微波功率480W、乙醇体积分数80％、温度40℃，超声波协同微波辅助作用下对黑米籽粒进行花青素提取50min。
置于室内暗处静置浸提后，转移至离心管中，用高速离心机在4000rpm的速度下离心15min；然后用提取溶剂作为参比溶液，在400～700nm(每间隔1nm)进行扫描，并记录最大OD值。进行统计学分析，找出黑米花青素的最大吸收波长。
对酸性乙醇所提取的花青素溶液进行400-700nm(每间隔1nm)自动扫描，花青素溶液的吸收光谱如图1所示，峰值检出如图2所示，得出最佳吸收波长为520nm。
实施例1
秦稻2号黑米中花青素的提取
以秦稻2号黑米的籽粒作为原料，进行35℃低温烘干，然后粉碎成60目的细粉，准确称量10.0g破碎好的黑米细粉，置于锥形瓶中，加入100ml的乙醇/盐酸混合液，其中混合液由V/V为70/30的65％乙醇/0.1mol/L酸组成，黑米细粉与混合液的料液比1∶10，将二者混合均匀后，pH调节至3.8，在提取温度50℃，功率为500W，超声波协同微波辅助作用下对黑米细粉进行花青素提取30min。
对超声波协同微波辅助提取后的混合物进行振荡，4000rpm/min离心15min，分离滤渣和滤液；取滤液在40℃下用真空旋转蒸发，将提取液进行浓缩至50ml；
将获得的浓缩液加入到填充有100mL AB-8大孔树脂的玻璃层析柱中，花青素浓缩液上柱，控制流速为1.0mL/min，随后静置20min后，用去离子水和乙醇对AB-8大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪在40℃下将溶液浓缩至20ml，再进行冷冻干燥，具体为放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥至水分含量在5％以下，控制真空度在15Pa以下，温度为-40℃以下，干燥完全后得到黑米的花青素冻干粉。
采用pH示差法对得到的花青素含量进行测定，具体数据如表1所示
表1 A的测定
A＝(A520nmpH1.0-A700nmpH1.0)-(A520nmpH4.5-A700nmpH4.5)＝(0.337-0.022)-(0.204-0.046)＝0.157
黑米中花青素的含量(％，w/w)＝(A/εL)×MW×DF×V/Wt100
＝{[(0.337-0.022)-(0.204-0.046)]/26900×1}×449.2×10×100/(0.1×1000)×100
＝2.62％
实施例2
黑选8号中花青素的提取
以黑选8号黑米的籽粒作为原料，进行35℃低温烘干，然后粉碎成40目的细粉，准确称量10.0g破碎好的选8号黑米细粉，置于锥形瓶中，加入50ml的乙醇/酸混合液，其中混合液由V/V为70/20的60％乙醇/0.05mol/L的盐酸组成，黑选8号黑米细粉与混合液的料液比1∶5，将二者混合均匀后，pH调节至4.0，在提取温度40℃，功率为450W，超声波协同微波辅助作用下对选8号黑米细粉进行花青素提取50min。
对超声波协同微波辅助提取后的混合物进行振荡，4000rpm/min离心10min，分离滤渣和滤液；取滤液在40℃下用真空旋转蒸发，将提取液进行浓缩致50ml；
将获得的浓缩液加入到填充有100mL AB-8大孔树脂的玻璃层析柱中，花青素浓缩液上柱，控制流速为1.5mL/min，随后静置20min后，用去离子水和乙醇对AB-8大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪在35℃下将溶液浓缩至20ml，再进行冷冻干燥，具体为放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥至水分含量在5％以下，控制真空度在15Pa以下，温度为-40℃以下，干燥完全后得到黑米的花青素冻干粉。
采用pH示差法对得到的花青素含量进行测定，具体如表2所示，
表2 A的测定
A＝(A520nmpH1.0-A700nmpH1.0)-(A520nmpH4.5-A700nmpH4.5)＝(0.352-0.026)-(0.210-0.044)＝0.160
黑米中花青素的含量(％，w/w)＝(A/εL)×MW×DF×V/Wt100
＝{[(0.352-0.026)-(0.210-0.044)]/26900×1}×449.2×10×100/(0.1×1000)×100＝2.67％
实施例3
黑丰糯黑米中花青素的提取
以黑丰糯黑米的籽粒作为原料，进行35℃低温烘干，然后粉碎成20目的细粉，准确称量10.0g破碎好的黑丰糯黑米细粉，置于锥形瓶中，加入80ml的乙醇/酸混合液，其中混合液由V/V为70/25的85％乙醇/0.2mol/L的盐酸组成，黑丰糯黑米细粉与混合液的料液比1∶8，将二者混合均匀后，pH调节至3.8，在提取温度45℃，功率为500W，超声波协同微波辅助作用下对黑丰糯黑米细粉进行花青素提取60min。
对超声波协同微波辅助提取后的混合物进行振荡，4000rpm/min离心15min，分离滤渣和滤液；取滤液在40℃下用真空旋转蒸发，将提取液进行浓缩致30ml；
将获得的浓缩液加入到填充有90mL AB-8大孔树脂的玻璃层析柱中，花青素浓缩液上柱，控制流速为1.2mL/min，随后静置20min后，用去离子水和乙醇对AB-8大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液；用旋转蒸发仪在35℃下将溶液浓缩至20ml，再进行冷冻干燥，具体为放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥至水分含量在5％以下，控制真空度在15Pa以下，温度为-40℃以下，干燥完全后得到黑米的花青素冻干粉。
采用pH示差法对得到的花青素含量进行测定，具体如表3所示，
表3 A的测定
A＝(A520nmpH1.0-A700nmpH1.0)-(A520nmpH4.5-A700nmpH4.5)＝(0.325-0.018)-(0.211-0.039)＝0.145
黑米中花青素的含量(％，w/w)＝(A/εL)×MW×DF×V/Wt100
＝{[(0.325-0.018)-(0.211-0.039)]/26900×1}×449.2×10×100/(0.1×1000)×100＝2.42％
实施例4
黑粘110黑米中花青素的提取
以黑粘110黑米的籽粒作为原料，进行35℃低温烘干，然后粉碎成40目的细粉，准确称量10.0g破碎好的黑米细粉，置于锥形瓶中，加入100ml的乙醇/酸混合液，其中混合液由V/V为70/30的85％乙醇/0.1m0l/L的盐酸组成，黑米细粉与混合液的料液比1∶10，将二者混合均匀后，pH调节至3.8，在提取温度40℃，微波功率为450W，超声波协同微波辅助作用下对黑米细粉进行花青素提取50min。
对超声波协同微波辅助提取后的混合物进行振荡，4000rpm/min离心10min，分离滤渣和滤液；将离心后得到的滤液通过截留分子量为3000Da有机物的超滤膜设备进行超滤过滤，操作压力0.3Mpa，过滤时间10h，过滤温度为室温，得到超滤流出液；再将超滤流出液通过截留分子量为200Da的纳滤膜进行浓缩，操作压力为0.2Mpa，过滤5h，收集截留液；将截留液在35℃下用真空旋转蒸发，将提取液进行浓缩致50ml；
将获得的浓缩液加入到填充有100mL AB-8大孔树脂的玻璃层析柱中，花青素浓缩液上柱，控制流速为1.2mL/min，随后静置20min后，用去离子水和乙醇对AB-8大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液；将洗脱液放入截留分子量为200Da的纳滤膜分离设备中，控制操作压力为0.2Mpa，使溶液保持室温，收集黑米花青素纳滤流出液，并通过反渗透回收洗脱液中的乙醇；用旋转蒸发仪在35℃下将纳滤流出液浓缩至20ml，再进行冷冻干燥，具体为放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥至水分含量在5％以下，控制真空度在15Pa以下，温度为-40℃以下，干燥完全后得到黑米的花青素冻干粉。
采用pH示差法对得到的花青素含量进行测定，具体为如表4所示，
表4 A的测定
A＝(A520nmpH1.0-A700nmpH1.0)-(A520nmpH4.5-A700nmpH4.5)＝(0.309-0.021)-(0.203-0.042)＝0.127
黑米中花青素的含量(％，w/w)＝(A/εL)×MW×DF×V/Wt100＝{[(0.309-0.021)-(0.203-0.042)]/26900×1}×449.2×10×100/(0.1×1000)×100＝2.12％
针对黑粘110黑米含花青素较低的情况下，仍然具有很好的提取效率。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。