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1、(10)申请公布号 CN 103387970 A (43)申请公布日 2013.11.13 CN 103387970 A *CN103387970A* (21)申请号 201210140748.2 (22)申请日 2012.05.09 C12N 9/54(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市经济技术开发区第十三 大街 29 号食品工程与生物技术学院 (72)发明人 王艳萍 姚四平 肖萍 (54) 发明名称 一种纳豆菌发酵鹰嘴豆粉产纳豆激酶的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种纳豆菌发酵鹰嘴豆粉产纳 豆激酶的工艺， 属。
2、于微生物发酵、 酶制剂领域。本 发明涉及利用纳豆芽孢杆菌以鹰嘴豆粉为氮源 发酵产纳豆激酶的方法， 由蔗糖、 鹰嘴豆粉、 水、 硫 酸镁、 氯化钙、 磷酸氢二钾， 磷酸二氢钾通过一次 性接种纳豆芽孢杆菌发酵。其配比为蔗糖 1-10 份， 鹰嘴豆粉 1-5 份， 硫酸镁 0.01-0.08 份， 氯化 钙 0.01-0.05 份， 磷酸氢二钾 0.1-1 份， 磷酸二氢 钾 0.1-1.2 份， 水 50-200 份。纳豆芽孢杆菌接种 量为 2 -6， 接种后发酵时间为 28-48h， 温度 30-37。本方法的优点在于鹰嘴豆营养价值很 高， 以鹰嘴豆粉作为氮源发酵产纳豆激酶， 产物中 纳豆激酶活。
3、力高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103387970 A CN 103387970 A *CN103387970A* 1/1 页 2 1. 一种纳豆菌发酵鹰嘴豆粉产纳豆激酶的工艺的方法， 其特征在于利用纳豆菌发酵鹰 嘴豆粉高产纳豆激酶， 其过程包括 ： (1) 配制及培养基灭菌 ： 将鹰嘴豆粉磨成粉， 制备培养基， 培养基质量百分比成分为蔗 糖1-10份， 鹰嘴豆粉1-5份， 硫酸镁0.01-0.08份， 氯化钙0.01-0。
4、.05份， 磷酸氢二钾0.1-1 份， 磷酸二氢钾 0.1-1.2 份， 水 50-200 份， pH 为 6-9。 (2) 纳豆芽孢杆菌接种， 纳豆菌接种量为 2 -6 ； (3) 发酵， 接种后于 30-37下培养发酵 28-48h ； (4) 发酵完毕， 取发酵液测定酶活 ： 以中性蛋白酶方法和纤维蛋白平板法测定 ； (5) 测定发酵液纤维蛋白的溶解能力。 2. 根据权利要求 1 所述的生产工艺， 其特征在于所述鹰嘴豆粉粉粒径为 80-200 目。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的纳豆激酶的制备方法， 其特征在于培养基质量百分比成 分为蔗糖 1-10 份， 鹰嘴豆粉 1-5 份， 。
5、硫酸镁 0.01-0.08 份， 氯化钙 0.01-0.05 份， 磷酸氢二 钾 0.1-1 份， 磷酸二氢钾 0.1-1.2 份， 水 50-200 份， pH 为 6-9。 4.根据权利要求3所述的纳豆激酶的制备方法， 其特征在于纳豆菌接种量为2-6； 5. 根据权利要求 4 所述的纳豆激酶的制备方法， 其特征在于接种后于 30-37下培养 发酵 28-48h。 权 利 要 求 书 CN 103387970 A 2 1/3 页 3 一种纳豆菌发酵鹰嘴豆粉产纳豆激酶的方法 技术领域 0001 一种纳豆菌发酵鹰嘴豆粉产纳豆激酶的方法， 属于微生物发酵、 酶制剂领域。 背景技术 0002 中国糖。
6、尿病患病率在不断增长， 估计年增长率约为 1， 预计到 2010 年中国患糖 尿病人数将达 6300 万， 总数将居世界各国之首位， 因此， 寻找有效预防和治疗糖尿病的方 法成为当前重要任务， 筛选开发具有降低血糖、 调节血脂代谢的生物资源对于糖尿病人的 康复具有重要意义。 0003 纳豆激酶是一种具有强烈纤溶活性的纤维蛋白溶解酶， 其溶栓作用强于尿激酶、 蚓激酶等， 作用时间长 ； 能直接分解血栓的骨架基质 - 纤维蛋白， 并且能激活血管内皮细胞 产生纤维蛋白溶解酶原， 以及促进尿激酶原向尿激酶转化， 从而起到直接或间接的强大溶 栓作用。 鹰嘴豆盛产于新疆天山北坡海拔1300m的木垒县， 已。
7、有2500年的生长历史。 据 中 华人民共和国卫生部药品标准维吾尔分册 记载， 鹰嘴豆富含人体所需要的 18 种氨基酸 及蛋白质、 膳食纤维、 钙、 钾、 锌等多种微量元素和维生素等营养物质， 被誉为 “营养之花， 豆 中之王” 。近年来对鹰嘴豆调节血糖和血脂作用的药理学研究正在积极开展中， 研究表明 ： 鹰嘴豆对改善糖尿病及糖尿病引起的血脂代谢紊乱具有积极意义。 0004 鹰嘴豆是一种营养丰富的豆科作物， 富含多种蛋白质、 氨基酸、 维生素、 异黄酮和 皂苷等生理活性物质， 营养价值高， 有很好的医疗保健功能。 0005 本专利为解决上述的不足， 以鹰嘴豆作为原料发酵产纳豆激酶， 不仅得到了。
8、高活 性纳豆激酶， 而且鹰嘴豆是一种营养价值非常高的原料， 为其开发成功能保健食品提供了 依据， 也为我国鹰嘴豆的深加工， 提高其附加值， 另辟蹊径， 具有一定的经济和社会效益。 发明内容 0006 本发明主要目的是克服上述不足， 充分利用鹰嘴豆的价值， 提供一种操作工艺简 单， 产量高、 活性高的产品。该方法不仅大幅提高了纳豆激酶的活性， 并保留了发酵液中多 种功能成分， 保健功能得到最大限度开发。 0007 为达到上述目的， 本发明的技术方案如下 ： 一种纳豆菌发酵鹰嘴豆粉产纳豆激酶 的工艺， 其特征在于 ： 该生产工艺以鹰嘴豆粉为天然原料制备高活性的纳豆激酶， 其过程包 括 ： 0008。
9、 (1) 配制及培养基灭菌 ： 将鹰嘴豆粉磨成粉， 制备培养基， 培养基质量百分比成分 为蔗糖 1-10 份， 鹰嘴豆粉 1-5 份， 硫酸镁 0.01-0.08 份， 氯化钙 0.01-0.05 份， 磷酸氢二钾 0.1-1 份， 磷酸二氢钾 0.1-1.2 份， 水 50-200 份， pH 为 6-9。 0009 (2) 纳豆芽孢杆菌接种， 纳豆菌接种量为 2 -6 ； 0010 (3) 发酵， 接种后于 30-37下培养发酵 28-48h ； 0011 (4) 发酵完毕， 取发酵液测定酶活 ： 以中性蛋白酶方法测定 ； 0012 (5) 测定发酵液纤维蛋白的溶解能力。 说 明 书 CN。
10、 103387970 A 3 2/3 页 4 0013 本发明与现有技术相比所具有的积极效果在于 ： 0014 (1) 首次选用鹰嘴豆作为原料， 鹰嘴豆具有非常丰富的营养价值， 而且价格便宜， 世界范围产量仅此于大豆。 0015 (2) 保留了发酵产物中的多种功能成分， 更大的提高其营养保健价值。 0016 (3) 本工艺所产纳豆激酶具有比以往产品更高活性。 0017 (4) 本生产培养基成分价格便宜， 企业见效快， 适宜大规模工业生产。 附图说明 0018 如图所示为发酵液在 18 小时溶解纤维蛋白形成透明圈大小， 以 Tris-Hcl 缓冲液 作为空白。 具体实施方式 0019 1. 培养。
11、基配制及灭菌步骤实施例 0020 配置培养基， 蔗糖 1-10 份， 鹰嘴豆粉 1-5 份， 硫酸镁 0.01-0.08 份， 氯化钙 0.01-0.05 份， 磷酸氢二钾 0.1-1 份， 磷酸二氢钾 0.1-1.2 份， pH 为 6-9。各具体含量见 表 1( 只列出鹰嘴豆粉和蔗糖含量 )， 接种量为 2-6 ； 接种后于 30-37温度下培养发酵 28-48h。测定纳豆激酶酶活 ( 以中性蛋白酶计 )， 结果见表 1 ： 0021 表 1 不同配比纳豆激酶活性 0022 0023 通过实验结果可以看出， 培养基成分为蔗糖 1-10 份， 鹰嘴豆粉 1-5 份， 硫酸镁 0.01-0.0。
12、8 份， 氯化钙 0.01-0.05 份， 磷酸氢二钾 0.1-1 份， 磷酸二氢钾 0.1-1.2 份， 水 50-200 份， pH 为 6-9。纳豆激酶酶活最高时配比为鹰嘴豆粉 5， 蔗糖 3.5。 0024 2. 培养发酵步骤实施例 0025 配 制 成 分 为 蔗 糖 1-10 份， 鹰 嘴 豆 粉 1-5 份， 硫 酸 镁 0.01-0.08 份， 氯 化 钙 0.01-0.05 份， 磷酸氢二钾 0.1-1 份， 磷酸二氢钾 0.1-1.2 份， 水 50-200 份， pH 为 6-9。接 种 2-6， 培养温度为 28-48， 测定纳豆激酶酶活 ( 以中性蛋白酶计 )， 结果。
13、见表 2 ： 0026 表 2 不同发酵温度纳豆激酶活性 0027 说 明 书 CN 103387970 A 4 3/3 页 5 0028 通过实验结果可以看出， 培养基成分为蔗糖 1-10 份， 鹰嘴豆粉 1-5 份， 硫酸镁 0.01-0.08 份， 氯化钙 0.01-0.05 份， 磷酸氢二钾 0.1-1 份， 磷酸二氢钾 0.1-1.2 份， 水 50-200 份， pH 为 6-9， 酶活最高时温度为 32。 0029 3 发酵液纤维蛋白溶解能力的测定 0030 0.75纤维蛋白原溶解在 pH 7.2 的 Tris-HCL 缓冲液中， 加入 42U/mL 的凝血酶及 1.2的琼脂糖溶液， 室温静置 1h 后， 加入 10uL 发酵液， 18h 后观察溶解圈大小。 0031 以上实施例是对专利的说明和进一步解释， 而不是对本发明的限制， 在本发明的 精神和权利保护范围， 所做的任何修改， 都落入本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103387970 A 5 1/1 页 6 说 明 书 附 图 CN 103387970 A 6 。