《孔石莼多糖分离产物及其分离纯化方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《孔石莼多糖分离产物及其分离纯化方法.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611128519.3 (22)申请日 2016.12.09 (71)申请人 潍坊医学院 地址 261053 山东省潍坊市潍城区宝通西 街7166号 (72)发明人 綦慧敏李伟达刘顺梅常新涛 蒋南芳 (74)专利代理机构 潍坊正信致远知识产权代理 有限公司 37255 代理人 王伟霞 (51)Int.Cl. C08B 37/00(2006.01) (54)发明名称 孔石莼多糖分离产物及其分离纯化方法 (57)摘要 本发明涉及多糖提取技术领域， 尤其涉及孔 石莼多糖分离产物，。
2、 包括分离产物F1、 分离产物 F2和分离产物F3中的至少一种； 分离产物F1由鼠 李糖、 木糖和葡萄糖按照摩尔比1:0.290.35: 0.130.15的比例组成； 分离产物F2由鼠李糖、 木糖和葡萄糖按照摩尔比1:0.380.46:0.26 0.28的比例组成； 分离产物F3由鼠李糖和木糖按 照摩尔比1:0.360.44的比例组成。 本发明还涉 及分离产物的分离纯化方法， 包括下列步骤： 水 提醇沉法提取孔石莼多糖、 超声溶解处理、 离心 处理、 离子交换层析柱处理、 透析处理、 冷冻干燥 得到分离产物F1、 F2和F3。 本发明中的三个分离 产物具有高效的抗氧化活性， 对于增强其降血脂 。
3、效果、 减轻病人用药负担等研究奠定了基础。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 106749723 A 2017.05.31 CN 106749723 A 1.孔石莼多糖分离产物， 其特征在于： 所述分离产物包括分离产物F1、 分离产物F2和分 离产物F3中的至少一种； 所述分离产物F1由鼠李糖、 木糖和葡萄糖按照摩尔比1:0.29 0.35:0.130.15的比例组成； 分离产物F2由鼠李糖、 木糖和葡萄糖按照摩尔比1:0.38 0.46:0.260.28的比例组成； 分离产物F3由鼠李糖和木糖按照摩尔比1:0.360.44的比 例组成。 2.根据权利要求1所述的孔石莼多糖分离产物，。
4、 其特征在于： 所述分离产物F1的重均分 子量为200893Da， 数均分子量为194940Da， 分子量分布宽度为1.03； 所述分离产物F2的重均 分子量为190368Da， 数均分子量为186162Da， 分子量分布宽度为1.02； 所述分离产物F3的重 均分子量为83094Da， 数均分子量为35374Da， 分子量的分布宽度为2.35。 3.孔石莼多糖分离产物的分离纯化方法， 其特征在于所述分离纯化方法包括下列步 骤： (1)超声溶解： 通过水提醇沉方法得到孔石莼多糖， 然后按照8g/L11g/L的加入量加 入到蒸馏水中， 以200W400W功率超声处理1h2h， 间歇搅拌使其溶解得。
5、到多糖溶液； (2)离心处理： 将步骤(1)得到的多糖溶液， 按照6000-10000r/min的转速离心5 10min， 收集上清液； (3)离子交换柱层析处理： 将步骤(2)所得上清液过DEAE-Sepharose FastFlow离子交 换柱， 依次用蒸馏水、 0.5mol/L氯化钠溶液、 1mol/L氯化钠溶液进行洗脱， 分部收集； (4)透析处理： 将步骤(3)所得三种洗脱液分别于截留分子量为500Da的透析袋中， 蒸馏 水透析48h， 得到保留液； (5)冷冻干燥： 将步骤(4)中得到的三种保留液分别浓缩、 冷冻干燥后， 分别得到分离产 物F1、 分离产物F2和分离产物F3。 4.。
6、根据权利要求3所述的孔石莼多糖分离产物的分离纯化方法， 其特征在在于： 所述步 骤(1)中孔石莼多糖加入量为10g/L。 5.根据权利要求3所述的孔石莼多糖分离产物的分离纯化方法， 其特征在于： 所述步骤 (2)中离心处理的转速为8000r/min， 时间为8min。 6.根据权利要求3所述的孔石莼多糖分离产物的分离纯化方法， 其特征在于： 所述步骤 (3)中洗脱液的流速为10ml/min。 7.根据权利要求3所述的孔石莼多糖分离产物的分离纯化方法， 其特征在于： 所述步骤 (5)得到的分离产物， F1/g中糖醛酸含量为23.14， 硫酸根含量为21.75； F2/g中糖醛酸 含量为15 .2。
7、7， 硫酸根含量为15 .56； F3/g中糖醛酸含量为25 .99， 硫酸根含量为 23.99。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106749723 A 2 孔石莼多糖分离产物及其分离纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及多糖提取技术领域， 具体涉及孔石莼多糖分离产物及其分离纯化方 法。 背景技术 0002 孔石莼(Ulva pertusa)属绿藻门(Chlorophyta)石莼科(Ulvaceae)石莼属 (Ulva)， 是一种可食用的大型绿藻， 它广泛分布于北太平洋的西部、 朝鲜、 日本、 中国及独联 体亚洲部分海区的沿岸。 在我国它主要分布于辽宁、 河北、 山东、 江苏等省沿海地区。
8、， 其幼体 绿色， 成体颜色加深而为碧绿色， 生长在中潮带及大潮干线附近的岩石或石沼中。 0003 孔石莼多糖属细胞间产物， 在藻体中以杂多糖形式而存在。 现代药理研究证明， 孔 石莼多糖具有抗氧化、 调血脂、 抗肿瘤及抗病毒等多方面生理活性。 但相比于临床上常用的 调血脂药物， 孔石莼多糖的降血脂效果起效慢且用药剂量较大。 因此获得高效的多糖分离 组分对于增强其降血脂效果、 减轻病人用药负担等具有重要意义。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是： 针对现有技术存在的不足， 提供具有高效抗氧化、 调血脂活性的孔石莼多糖分离产物。 0005 为解决上述技术问题， 本发明的技术方案是： 。
9、0006 孔石莼多糖分离产物， 所述分离产物包括分离产物F1、 分离产物F2和分离产物F3 中的至少一种； 所述分离产物F1由鼠李糖、 木糖和葡萄糖按照摩尔比1:0.290.35:0.13 0.15的比例组成； 分离产物F2由鼠李糖、 木糖和葡萄糖按照摩尔比1:0.380.46:0.26 0.28的比例组成； 分离产物F3由鼠李糖和木糖按照摩尔比1:0.360.44的比例组成。 0007 作为一种改进的技术方案， 所述分离产物F1的重均分子量为200893Da， 数均分子 量为194940Da， 分子量分布宽度为1.03； 所述分离产物F2的重均分子量为190368Da， 数均分 子量为186。
10、162Da， 分子量分布宽度为1.02； 所述分离产物F3的重均分子量为83094Da， 数均 分子量为35374Da， 分子量的分布宽度为2.35。 0008 本发明所要解决的另一个技术问题是： 针对现有技术存在的不足， 提供一种操作 简便、 环境友好、 适于大规模化生产、 且具有高效抗氧化活性和调血脂活性的孔石莼多糖分 离产物的分离纯化方法， 所述分离纯化方法包括下列步骤： 0009 (1)超声溶解： 通过水提醇沉方法得到孔石莼多糖， 然后按照8g/L11g/L的加入 量加入到蒸馏水中， 以200W400W功率超声处理1h2h， 间歇搅拌使其溶解得到多糖溶液； 0010 (2)离心处理： 。
11、将步骤(1)得到的多糖溶液， 按照6000-10000r/min的转速离心5 10min， 收集上清液； 0011 (3)离子交换柱层析处理： 将步骤(2)所得上清液过DEAE-Sepharose Fast Flow离 子交换柱， 依次用蒸馏水、 0.5mol/L氯化钠溶液、 1mol/L氯化钠溶液进行洗脱， 分部收集； 0012 (4)透析处理： 将步骤(3)所得三种洗脱液分别于截留分子量为500Da的透析袋中， 说明书 1/7 页 3 CN 106749723 A 3 蒸馏水透析48h， 得到保留液； 0013 (5)冷冻干燥： 将步骤(4)中得到的三种保留液分别浓缩、 冷冻干燥后， 分别。
12、得到分 离产物F1、 分离产物F2和分离产物F3。 0014 作为一种改进的技术方案， 所述步骤(1)中孔石莼多糖加入量为10g/L。 0015 作为一种改进的技术方案， 所述步骤(2)中离心处理的转速为8000r/min， 时间为 8min。 0016 作为一种改进的技术方案， 所述步骤(3)中洗脱液的流速为10ml/min。 0017 作为一种改进的技术方案， 所述步骤(5)得到的分离产物， F1/g中糖醛酸含量为 23.14， 硫酸根含量为21.75； F2/g中糖醛酸含量为15.27， 硫酸根含量为15.56； F3/ g中糖醛酸含量为25.99， 硫酸根含量为23.99。 0018 。
13、采用了上述技术方案后， 本发明的有益效果是： 0019 本发明以孔石莼为原料采用水提醇沉法得到的孔石莼多糖， 经过超声溶解、 离心 处理、 离子交换柱层析处理、 透析处理、 冷冻干燥后得到三种分离产物F1、 F2和F3,通过红外 光谱分析发现这三种分离产物与孔石莼多糖结构相似， 通过对超氧阴离子自由基清除实 验、 有机自由基DPPH的清除实验及还原能力测定实验， 得出这三种分离产物与孔石莼多糖 相比具有较好的抗氧化活性， 因此结合多糖的特性及构效关系， 进一步为开发以孔石莼为 原料， 获得高效生理活性的多糖分离组分并对于增强多糖分离组分的降血脂效果、 减轻病 人用药负担等研究奠定了基础。 附图。
14、说明 0020 图1为孔石莼多糖的红外光谱图； 0021 图2为分离产物F1的红外光谱图； 0022 图3为分离产物F2的红外光谱图； 0023 图4为分离产物F3的红外光谱图。 具体实施方式 0024 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0025 将孔石莼多糖与分离产物F1、 F2和F3分别进行红外光谱测定， 红外光谱吸收峰及 对应的官能团见表1。 0026 表1孔石莼多糖及分离产物F1、 F2和F3的红外光谱数据 说明书 2/7 页 4 CN 1。
15、06749723 A 4 0027 0028 由于F1、 F2和F3的红外谱图对比孔石莼多糖(U)的红外谱图并无明显差异， 没有出 现新的吸收峰， 因此认为各分离组分并无新的官能团产生， 即分离产物F1、 F2和F3与孔石莼 多糖(U)结构相似。 0029 实施例1 0030 孔石莼多糖的提取方法 0031 (1)预处理： 将孔石莼藻体用自来水洗净， 除去泥沙， 杂草及其他附着物； 然后自然 凉干， 粉碎后过60目筛， 得到孔石莼藻体粉末， 封装备用； 0032 (2)脱脂处理： 称取步骤(1)中的孔石莼藻体粉末， 用80乙醇回流三次， 离心， 40 减压干燥得到脱脂孔石莼藻体； 0033 (。
16、3)热水提取： 将步骤(2)得到的脱脂孔石莼藻体在125水浴条件下提取3次， 每 次提取2h， 过滤， 合并三次滤液， 然后将滤液进行旋转蒸发浓缩， 用75的乙醇沉淀24h， 滤 出沉淀； 0034 (4)干燥： 将步骤(3)中滤出的沉淀用无水乙醇脱水处理两次后， 置于干燥箱内40 条件下烘干， 得到孔石莼多糖粗品。 0035 该方法制备的孔石莼多糖主要的重复二糖单元:-4- -D-GlcA-(1-4)- -L-Rha 3S-1和-4- -L-IdoA-(1-4)- -L-Rha 3S-1。 0036 其结构式分别为： 说明书 3/7 页 5 CN 106749723 A 5 0037 003。
17、8 其中G:(14)连接 D葡萄糖醛酸； R:(14)连接 L鼠李糖3硫酸基 (与 D葡萄糖醛酸相连)； I:(14)连接 L艾杜糖醛酸； R*:(14)连接 L鼠李 糖3硫酸基(与 L艾杜糖醛酸相连)。 0039 实施例2 0040 孔石莼多糖分离产物的分离纯化方法 0041 (1)超声溶解： 准确称取孔石莼多糖粗品(实施例1制备)10g置于1000ml烧杯中， 加 入蒸馏水1000ml， 以400W功率超声处理1h， 间歇搅拌使其溶解； 0042 (2)离心处理： 将步骤(1)得到的多糖溶液于高速离心机8000r/min离心8min， 收集 上清液； 0043 (3)离子交换柱层析： 采用。
18、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换填料装柱使成5cm 20cm柱床， 10倍蒸馏水平衡， 然后将步骤(2)所得的1L上清液过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱， 依次用蒸馏水、 0.5mol/L氯化钠溶液、 1mol/L氯化钠溶液进行洗脱， 洗脱 流速10ml/min， 分部收集， 苯酚硫酸法在485nm处逐管测定多糖含量， 以吸光度为纵坐标， 管数为横坐标， 绘制洗脱曲线， 合并相同组分。 经检测自蒸馏水洗脱开始， 收集200ml- 1200ml洗脱液为水洗脱组分F1； 自0.5mol/L氯化钠溶液洗脱开始， 收集250ml-1200ml洗脱 液。
19、为0.5mol/L氯化钠溶液洗脱组分F2； 自1mol/L氯化钠溶液洗脱开始， 收集250ml-800ml洗 脱液为1mol/L氯化钠溶液洗脱组分F3； 0044 (4)透析处理： 将步骤(3)所得三种洗脱液分别于截留分子量为500Da的透析袋中 蒸馏水透析48h， 得到保留液； 0045 (5)冷冻干燥： 将步骤(4)中得到的三种保留液分别浓缩、 在-40冷冻干燥14- 18h， 得到孔石莼多糖的三种分离纯化产物。 分离产物F1、 F2和F3的收率见表2。 0046 表2分离产物F1、 F2和F3的分离纯化收率 0047 重量(g)多糖收率() 孔石莼多糖原料10 F14.8248.2 F2。
20、1.5615.6 F30.454.5 0048 实施例3 0049 分离产物F1、 F2和F3对超氧阴离子自由基的清除作用 说明书 4/7 页 6 CN 106749723 A 6 0050 清除实验反应体系含有不同浓度多糖样品以及435mol L-1还原型辅酶I(NADH) 1mL,150mol L-1硝基四氮唑蓝(NBT)1mL,72mol L-1吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液1mL,上述各个 溶液均为Tris-HCl缓冲液(16mmol L-1,pH 8.0)配制,室温下放置5min后,在560nm波长处测 定吸光度。 空白组不加样品和NADH溶液,对照组不加样品溶液。 清除率计算公式: 0。
21、051 清除率()(A对 照-A样 品)/(A对 照-A空 白)100 0052 清除率结果见表3。 0053 表3分离产物F1、 F2和F3对超氧阴离子自由基的清除作用 0054 0055 实验结果表明各浓度下的F1、 F2和F3样品溶液对体外超氧阴离子自由基都有一定 的清除能力， 并且在0.0120.2mg/ml的范围内， 其清除率随着浓度的增高而增强， 在此浓 度范围内分离产物F1和F3对超氧阴离子自由基的清除率都高于孔石莼多糖对超氧阴离子 自由基的清除率。 0056 实施例4 0057 分离产物F1、 F2和F3的还原性测定 0058 用磷酸盐缓冲液(0.2mol/L， pH6.6)分。
22、别按照表3中的多糖浓度配制三种分离产物 的样品2mL和铁氰化钾(1w/v)2mL， 在50保温反应20min， 用2mL三氯乙酸(10w/v)中止 反应。 摇匀， 取上清2mL， 加入三氯化铁(0.1w/v)1mL， 摇匀， 在700nm处测定吸光度， 以 0.13mmoL/L Vc作为阳性对照。 三种产物的还原性结果见表4。 0059 表4分离产物F1、 F2和F3的还原性测定 说明书 5/7 页 7 CN 106749723 A 7 0060 0061 实验结果表明各浓度下的F1、 F2和F3样品溶液具有一定能力的还原能力， 并且在 0.84mg/ml的浓度范围内， 其还原力随着浓度的增高。
23、而增强。 而且在此浓度范围内分离产 物F2的还原性比孔石莼多糖的还原性强。 0062 实施例5 0063 分离产物F1、 F2和F3对有机自由基DPPH的清除作用 0064 清除反应体系是以水为溶剂， 分别按照表3中的浓度依次配置三种分离产物样品 溶液和2mL 0.1mmol L-1DPPH溶液,其中DPPH以乙醇溶液为溶剂,室温放置30min后,于517nm 波长处测定吸光度。 对照组使用1mL蒸馏水代替样品溶液。 清除率计算公式: 0065 清除率()(A对 照-A样 品)/A对 照100 0066 清除率结果见表5。 0067 表5分离产物F1、 F2和F3对有机自由基DPPH的清除作用。
24、 0068 0069 实验结果表明各浓度下的F1、 F2和F3样品溶液对体外有机自由基DPPH都有一定的 清除能力， 并且在1.57.9mg/ml的范围内， 其清除率随着浓度的增高而增强， 在此浓度范 围内分离产物F2对有机自由基DPPH的清除率要高于孔石莼多糖对有机自由基DPPH的清除 说明书 6/7 页 8 CN 106749723 A 8 率。 0070 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 7/7 页 9 CN 106749723 A 9 图1 说明书附图 1/4 页 10 CN 106749723 A 10 图2 说明书附图 2/4 页 11 CN 106749723 A 11 图3 说明书附图 3/4 页 12 CN 106749723 A 12 图4 说明书附图 4/4 页 13 CN 106749723 A 13 。