技术领域
本发明属于活性物质提取技术领域，具体涉及一种黄酮类物质的 提取方法。
背景技术
茶叶中含有丰富的黄酮类化合物，黄酮类化合物具有清除自由基、 抗氧化、抗癌、抗菌等多种生理活性及药理作用,且无毒无害,对治 疗和预防肿瘤、心血管病等疾病的有显著的效果，对延缓人体的衰老 有重要意义，因阳黄酮成为近年来研究、开发和利用的热点。但目前 的黄酮类化合物的纯化主要有硅胶柱层析法和大孔树脂吸附法，纯化 周期较长。因此，寻求一种更加方便快捷、生产周期短的纯化方法成 为研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄酮类物质的提取方法，能够高效的 从茶叶中分离黄酮类物质，从而弥补现有技术的不足。
本发明的方法，包括如下步骤：
1)粗提物的制备：
将茶叶研磨成粉后，加入水后，再加入纤维素酶进行酶解，酶解 1-3h后，加入乙醇至终浓度为60-90％，进行超声波浸提，浸提3-4h 后；将浸提液浓缩、干燥，制成粗提物；
2)络合物的制备
将步骤1)制成的粗提物用浓度为70～75％的乙醇溶解，制成浓 度为10～20mg/mL的溶液，在搅拌条件下加入乙酸锌盐溶液；调节溶 液的pH值为8～10，进行络合反应，反应结束后收集金属络合物沉淀；
3)金属络合物的解离：
将步骤2)所得金属络合物溶解于浓度为30～35％的乙醇中，加 入EDTA进行解络合反应，振荡反应至沉淀完全溶解，冷却至室温， 旋转蒸干，用甲醇溶解过滤，将滤液浓缩、干燥即得纯化后的茶叶黄 酮类化合物。
步骤2)的络合反应温度为50～60℃，络合反应时间为30～60min。
步骤3)中EDTA的加入终浓度为15-40mg/ml，
步骤3)中解络合反应温度为55～65℃。
为了提高制成的茶叶黄酮类化合物的纯度，将步骤3)制成的茶 叶黄酮类化合物用清洗液进行清洗；
所述的清洗液，为浓度为20％的乙醇丙酮水溶液，其中乙醇和丙 酮的体积比为2:1。
本发明以茶叶为原料来提供黄酮类物质，提取物中黄酮类化合物 含量达到50％以上。与已有的方法相比，不但纯化周期大大缩短，而 且不影响黄酮类物质的得率和纯度。
具体实施方式
本发明利用紫外‐可见光谱法测定黄酮类物质的含量，采用亚硝 酸钠-硝酸铝显色法进行显色。黄酮提取物以Al(NO3)3‐NaNO2‐NaOH体 系显色后于500nm处测得总黄酮的吸光度。
使用的仪器如下：
紫外‐可见分光光度计
分析天平(分度值0.0001g)
使用的试剂如下：
三氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠：分析纯
水：去离子水或二次蒸馏水
乙醇：分析纯
芦丁对照品
具体方法如下：
1、芦丁对照品溶液的制备
取芦丁对照品约20mg，精密称定，置于100mL容量瓶中，加60％ 乙醇适量，超声处理使之溶解，放置至室温，加60％乙醇至刻度，摇 匀，即得芦丁对照品储备液。
2、标准曲线的制作
分别精密量取芦丁对照品储备液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0, 4.5,5.0,5.5,6.0ml置于25mL容量瓶中，用30％乙醇补足至6ml，加 5％NaNO21ml，静置6min，然后加入10％AlNO31ml，静置6min， 最后加入4％NaOH10ml，30％乙醇定容后静置15min，并在500nm下 测定吸光度，以芦丁对照品溶液浓度(x，mg/mL)为横坐标，吸光 度(y)为纵坐标绘制标准曲线,得线性回归方程y＝k1x+b1。
3、供试品溶液的制备
取本品约100mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加60％乙醇适 量，超声处理使之溶解，放置至室温，加60％乙醇至25ml，摇匀， 即得置于25ml供试品储备液。
4、测定方法
精密量取2mL供试品储备液，置25ml容量瓶中，照标准曲线 制备项下的方法，自“用30％乙醇补足至6ml”起依法测定，吸光度记 为A1。
5、黄酮含量的计算
具体公式如下：
W % = A 1 - b 1 k 1 × 100 × n m × 100 % ]]>
式中A1为Al(NO3)3-NaNO2-NaOH显色法测得的总黄酮吸光度 值，控制在0.2～0.8范围内，如果吸光度超过此范围，则可通过稀释 样品溶液来控制，n为样品溶液的稀释倍数。k1和b1分别为AlCl3显 色法标准曲线的斜率和截距，W为样品中黄酮的质量分数(％)，m为 样品的称样量(mg)。
以下结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1)粗提物的制备：
将产自崂山的茶树叶子烘干研磨成粉并过40目筛，得到100g的 茶叶粉末，加入300ml的水进行溶解后，加入纤维素酶在30℃下进 行酶解2h，其中纤维素酶用量为10U/g(茶叶)。酶解结束后，加入 乙醇至浓度为70％，然后置于功率为250W的超声波设备中处理 30min，再置于50℃水浴条件下浸提3h。将浸提液进行旋转蒸发浓缩、 干燥，即得到粗提物。
2)金属络合物的制备
将步骤1)所得茶叶黄酮类化合物的粗提物用70％乙醇溶液配制 成浓度为15mg/mL的溶液，用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为 5mg/mL的乙酸锌溶液100ml，设置络合反应温度为55℃，用 10％NaOH溶液调pH值为8，反应30min后，收集沉淀，该沉淀即 为茶叶黄酮-金属络合物。
3)茶叶黄酮-金属络合物的解离
将步骤2)所得茶叶黄酮-金属络合物均匀分散溶解于浓度为30％ 的乙醇溶液中，按0.15g/g茶叶黄酮-金属络合物加入EDTA，设置解 络合反应温度为65℃，振荡反应至沉淀完全溶解，冷却至室温，旋 转蒸干，用甲醇溶解过滤，将滤液浓缩、干燥即得纯化后的含有茶叶 黄酮类化合物的干粉。
按照黄酮的检测方法对最后制备的干粉进行测定，结果表明其最 终获得的提取物中黄酮类物质的质量百分比含量为58.2％。
实施例2
1)粗提物的制备：
将产自崂山的茶树叶子烘干研磨成粉并过40目筛，得到100g的 茶叶粉末，加入300ml的水进行溶解后，加入纤维素酶在25℃下进 行酶解2h，其中纤维素酶用量为10U/g(茶叶)。酶解结束后，加入 乙醇至浓度为90％，然后置于功率为250W的超声波设备中处理 30min，再置于50℃水浴条件下浸提3h。将浸提液进行旋转蒸发浓缩、 干燥，即得到粗提物。
2)金属络合物的制备
将步骤1)所得茶叶黄酮类化合物的粗提物用70％乙醇溶液配制 成浓度为15mg/mL的溶液，用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为 5mg/mL的乙酸锌溶液100ml，设置络合反应温度为55℃，用 10％NaOH溶液调pH值为8，反应30min后，收集沉淀，该沉淀即 为茶叶黄酮-金属络合物。
3)茶叶黄酮-金属络合物的解离
将步骤2)所得茶叶黄酮-金属络合物均匀分散溶解于浓度为30％ 的乙醇溶液中，按0.15g/g茶叶黄酮-金属络合物加入EDTA，设置解 络合反应温度为65℃，振荡反应至沉淀完全溶解，冷却至室温，旋 转蒸干，用甲醇溶解过滤，将滤液浓缩、干燥即得纯化后的含有茶叶 黄酮类化合物的干粉。
按照黄酮的检测方法对最后制备的干粉进行测定，结果表明其最 终获得的提取物中黄酮类物质的质量百分比含量为56.1％。
为了提高制成的茶叶黄酮类化合物的纯度，将步骤3)制成的含 有茶叶黄酮类化合物的干粉用清洗液进行清洗。使用的清洗液为浓度 为20％的乙醇丙酮水溶液，其中乙醇和丙酮的体积比为2:1。对最终 的终获得的提取物进行分析，提取物中黄酮类物质的质量百分比含量 为升高为67.3％；且换算后黄酮类物质的总量没有变化，表明用清洗 液进行清洗后明显提高了纯度。
上述清洗液中有机溶液的组成及配比进行了优化，实验结果表明， 如果使用更低浓度的乙醇丙酮水溶液，则不会导致纯度发生变化，而 使用更高浓度的有机溶剂，则会导致黄酮类物质的流失，导致得率下 降。