技术领域
本发明属于发酵工程领域，涉及一种生产玻璃酸钠的培养基及其制备方法。
背景技术
玻璃酸钠(Sodium Hyaluronate)又名透明质酸钠，是由N-乙酰葡萄糖醛酸反复交替而形成的一种高分子多糖体生物材料。玻璃酸钠为关节滑液的主要成分，是软骨基质的成分之一。在关节腔内起润滑作用，可覆盖和保护关节软骨，改善关节挛缩，抑制软骨变性变化表面，改善病理性关节液，增加滴滑功能。目前获取玻璃酸钠的方法主要是从动物的滑液、皮肤、雄鸡冠及脐带中提取到玻璃酸钠。但是，这种方法存在一定的缺陷，对于制约着玻璃酸钠提取的发展。目前，生物发酵法可以弥补传统方法存在问题，是玻璃酸钠生产研究的热点内容。
CN105255969A公开了一种提高发酵生产透明质酸产量的方法，属于发酵工程技术领域。此方法利用用菌株发酵生产透明质酸，发酵所用培养基中添加有核糖、大豆磷脂的一种或两种以上的混合物。采用此方法可有效提高透明质酸产量，提高了可达26％。但是此方法中透明质酸的产量最高为6.3g/L，还需要进一步提高。
CN107338201A公开了一种马链球菌兽疫亚种SXY36及在发酵生产透明质酸中的应用，(1)SXY36经紫外线、微波和γ射线照射诱变选育，无溶血性，HA发酵产率高，遗传稳定，在优选的发酵条件下，摇瓶发酵产率可达0.731g/L，发酵罐发酵的产率可达4.78g/L；(2)采用两段变温发酵和稳定pH法，可以发酵制备高分子量HA，分子量可达1.89MDa，是常规发酵法的2倍。(3)采用发酵液自酶降解法制备不同分子量HA，控制酶解时间，即可生产分子量在0.035～1.89MDa范围内的HA。但是，此方法的在发酵罐中的产率仅有4.78g/L，产量相对较低。
CN1786180公开了一种提高发酵法生产透明质酸产量及分子量的方法，涉及生产透明质酸的发酵技术领域采用兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)H23作为出发菌株，经液体发酵生产透明质酸，发酵培养基选用酵母粉为单一氮源、搅拌转速为180-220rpm的条件下，透明质酸的产量及分子量有大幅度提高，适用于透明质酸的工业化生产。但是此方法产量也仅仅为6g/L，产量还需进一步提高。
目前，现有方法生产玻璃酸钠的产量一般仅在6g/L，已不能满足日益增长的工业生产需求。而如何从发酵培养基为根本，来提高生产玻璃酸钠的产量，是一个前景可行的策略。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于一种生产玻璃酸钠的培养基及其制备方法，以使得通过发酵法生产玻璃酸钠的产量得到提高，降低工业化的生产的成本。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，一种生产玻璃酸钠的培养基，所述培养基按重量份计包括以下组分：
本发明提供的生产玻璃酸钠的培养基，通过L-精氨酸、麦麸和微量元素的无机盐合理搭配，在使用兽疫链球菌H23发酵生产玻璃酸钠时，大大提升了玻璃酸钠的产量，其产量可达到6.7g/L-7.2g/L。微量元素的无机盐所提供的微量元素与L-精氨酸共同促进了菌体的代谢过程，尤其是能够促进与玻璃酸钠代谢通路相关的代谢过程，而麦麸同时为菌体提供了充足的能量来源，保证了菌体的生长，并且不会影响L-精氨酸与微量元素的无机盐发挥功效，相比于其他氮源如蚕蛹粉、尿素、蛋白胨等，效果更加优良。
在本发明中，所述白砂糖的重量份为29-38份，例如可以是29份、30份、31份、32份、33份、34份、35份、36份、37份或38份等。
在本发明中，所述酵母浸粉的重量份7-15份，例如可以是7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份或15份等。
在本发明中，所述缓冲无机盐的重量份为2.5-4份，例如可以是2.5份、3份、3.5份或4份等。
优选地，所述缓冲无机盐包括七水合硫酸镁、二水合磷酸二氢钠、硫酸钾、磷酸二氢钾或磷酸氢二钠中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：七水合硫酸镁和二水合磷酸二氢钠；七水合硫酸镁、二水合磷酸二氢钠和硫酸钾；磷酸二氢钾和磷酸氢二钠；硫酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠等等。进一步优选为水合硫酸镁、二水合磷酸二氢钠和硫酸钾的组合。
在本发明中，缓冲无机盐主要为培养基提供适宜的酸碱环境，能够保证菌体在合适的环境下进行正常代谢。
在本发明中，所述L-精氨酸的重量份为14-28份，例如可以是14份、16份、17份、19份、20份、22份、25份、27份或28份等。
在人体中，精氨酸是鸟氨酸循环中的一个组成成分具有极其重要的生理功能，精氨酸可有效提高免疫力、促进免疫系统分泌自然杀伤细胞、吞噬细胞、白血球内烯素(interleukin-1)等内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染。另外，精氨酸是鸟氨酸(L-ornithine)及脯氨酸(L-proline)的前趋物，脯氨酸是构成胶原蛋白的重要元素，补充精氨酸对于严重外伤、烧伤等需要大量组织修护的康护，具有明显的帮助，同时具有降低感染及发炎的效果。
在本发明中，所述聚醚消泡剂的重量份为10-30份，例如可以是10份、12份、15份、18份、20份、23份、25份、27份或30份等。
在本发明中，使用聚醚消泡剂相对于其他传统的消泡剂来说，消泡效果更突出，能够保证发酵过程中所需气体的正常交换，利于菌体生长和代谢。
在本发明中，所述麦麸的重量份为2.5-5份，例如可以是2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份或5份等。
麦麸是小麦加工面粉副产品，麦黄色，片状或粉状。麦皮的端部有部分胚芽(也就是麦子生芽的部位)，大约占麦皮总量的5-10％左右，麦皮含有大量的维生素B类。富含纤维素和维生素，主要用途有食用、入药、饲料原料、酿酒等。在本发明中通过添加麦麸，使得培养基中的营养成分充足。
在本发明中，所述微量元素的无机盐的重量份为1.5-3份，例如可以是1.5份、2份、2.5份或3份等。
优选地，所述微量元素的无机盐包括硝酸铈、硫酸锌、硝酸镧、硝酸镨或硫酸亚铁中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括硝酸铈和硫酸锌；硫酸锌和硝酸镧；硝酸镧、硝酸镨和硫酸亚铁等等组合。
在本发明中，微量元素的无机盐中所提供的微量元素，会和L-精氨酸协同发挥作用，促进菌体与玻璃酸钠相关代谢通路的进行，能够提升玻璃酸钠的产量。而如果培养基中缺少L-精氨酸或者微量元素，则产量会出现下降。
优选地，所述培养基中还包括卵磷脂2-4份，例如可以是2份、2.5份、3份、3.5份或4份等。
卵磷脂又称蛋黄素，主要成分为磷脂酰胆碱，不饱和脂肪酸。在本发明的培养中添加卵磷脂，可进一步提升玻璃酸钠的产量。
优选地，所述培养基按重量份计包括以下组分：
另一方面，本发明提供了一种如上所述的培养基的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将白砂糖、酵母浸粉和麦麸溶于水中混合得到混合溶液；
(2)将缓冲无机盐、微量元素的无机盐、L-精氨酸和任选地卵磷脂溶于水中，混合得到混合溶液；
(3)将步骤(1)得到的混合溶液、步骤(2)得到的混合溶液与聚醚消泡剂混合至澄清状态得到所述培养基。
本发明所提供的制备方法中，聚醚消泡剂需最后添加进入培养基中，这样才能够使得消泡的效果更为突出。
优选地，步骤(1)所述混合的温度为20-40℃，例如可以是20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、32℃、33℃、35℃、36℃、38℃或40℃等。
优选地，步骤(1)所述混合的时间为20-200min，例如可以是20min、50min、80min、100min、120min、15min、180min或200min等。
在本发明中，步骤(1)中混合的温度不宜过高，一般在室温左右即可。
优选地，步骤(2)所述混合的温度为50-80℃，例如可以是50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃等。
优选地，步骤(2)所述混合的时间为10-30min，例如可以是10min、12min、15min、18min、20min、23min、25min、27min或30min等。
在本发明中，步骤(2)中混合主要包括无机盐等物质，温度略微提升，有助于无机盐、微量元素的充分混匀。
优选地，步骤(3)所述混合的温度为30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等。
优选地，步骤(3)所述混合的时间为5-15min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min等。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将白砂糖、酵母浸粉和麦麸溶于水中，在20-40℃下混合20-200min得到混合溶液；
(2)将缓冲无机盐、微量元素的无机盐、L-精氨酸和任选地卵磷脂溶于水中，在50-80℃下混合10-30min得到混合溶液；
(3)将步骤(1)得到的混合溶液、步骤(2)得到的混合溶液与聚醚消泡剂在30-40℃下混合5-15min后，至澄清状态得到所述培养基。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的生产玻璃酸钠的培养基，通过L-精氨酸、麦麸和微量元素的无机盐合理搭配，在使用兽疫链球菌H23发酵生产玻璃酸钠时，大大提升了玻璃酸钠的产量，其产量可达到6.7g/L-7.2g/L。微量元素的无机盐所提供的微量元素与L-精氨酸共同促进了菌体的代谢过程，尤其是能够促进与玻璃酸钠代谢通路相关的代谢过程，而麦麸同时为菌体提供了充足的能量来源，保证了菌体的生长，并且不会影响L-精氨酸与微量元素的无机盐发挥功效，相比于其他氮源如蚕蛹粉、尿素、蛋白胨等，效果更加优良。
本发明通过引入微量元素、前体和促进剂等，能够促进菌体生长，提高发酵产物产量，抑制副产物的生成，同时能够在稳定发酵生产的及存储上促进菌体繁殖，提高细胞生长速率，突破了透明质酸钠行业技术发展的瓶颈，创造了生产更优质产品的内外部环境，更在一定程度上满足了社会发展的多重需要，减少了不良反应发生的概率，降低了生产成本。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供的培养基按重量份计包括以下组分
制备方法：
(1)将白砂糖、酵母浸粉和麦麸溶于水中，在30℃下混合100min得到混合溶液；
(2)将1份的七水合硫酸镁、1份的二水合磷酸二氢钠、1份的硫酸钾、硫酸锌、L-精氨酸和卵磷脂溶于水中，在60℃下混合20min得到混合溶液；
(3)将步骤(1)得到的混合溶液、步骤(2)得到的混合溶液与聚醚消泡剂在35℃下混合10min后，至澄清状态得到培养基。
实施例2
制备方法：
(1)将白砂糖、酵母浸粉和麦麸溶于水中，在20℃下混合20min得到混合溶液；
(2)将磷酸二氢钾、硝酸镧、L-精氨酸和卵磷脂溶于水中，在50℃下次混合10min得到混合溶液；
(3)将步骤(1)得到的混合溶液、步骤(2)得到的混合溶液与聚醚消泡剂在30℃下混合5min后，至澄清状态得到所述培养基。
实施例3
制备方法：
(1)将白砂糖、酵母浸粉和麦麸溶于水中，在40℃下混合200min得到混合溶液；
(2)将磷酸氢二钠、硫酸亚铁、L-精氨酸溶于水中，在80℃下混合30min得到混合溶液；
(3)将步骤(1)得到的混合溶液、步骤(2)得到的混合溶液与聚醚消泡剂在40℃下混合15min后，至澄清状态得到所述培养基。
实施例4
制备方法：
(1)将白砂糖、酵母浸粉和麦麸溶于水中，在40℃下混合180min得到混合溶液；
(2)将2.1份二水合磷酸二氢钠、1.9份硫酸钾、L-精氨酸和卵磷脂溶于水中，在80℃下混合20min得到混合溶液；
(3)将步骤(1)得到的混合溶液、步骤(2)得到的混合溶液与聚醚消泡剂在33℃下混合13min后，至澄清状态得到所述培养基。
实施例5
制备方法：
(1)将白砂糖、酵母浸粉和麦麸溶于水中，在40℃下混合50min得到混合溶液；
(2)将1.5份磷酸二氢钾、1份磷酸氢二钠、1份硫酸锌、0.5份硝酸镧、L-精氨酸溶于水中，在70℃下混合22min得到混合溶液；
(3)将步骤(1)得到的混合溶液、步骤(2)得到的混合溶液与聚醚消泡剂在33℃下混合14min后，至澄清状态得到所述培养基。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中不包括L-精氨酸，其余均与实施例1相同制备得到培养基。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中不包括硫酸锌，其余均与实施例1相同制备得到培养基。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例中不包括聚醚消泡剂，其余均与实施例1相同制备得到培养基。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于，本对比例的制备方法为，直接将所有原料进行混合，制备得到培养基。
将上述制备的培养基作为发酵培养基，进行发酵测试。方法为：将兽疫链球菌H23种子接种至发酵培养基中，在7L发酵罐中含有5L培养基进行发酵16小时，发酵条件为：pH7.0，搅拌转速2000rpm，通气速率1.0vvm。得到的玻璃酸钠的产量具体如下表1所示：
表1
样品 产量g/L 实施例1 7.1 实施例2 7.0 实施例3 6.7 实施例4 6.8 实施例5 6.7 对比例1 5.1 对比例2 5.2 对比例3 5.4 对比例4 5.5
通过实施例1-实施例5的结果可知，当培养基中含有卵磷脂时，发酵的效果更加优良；而通过对比例1-对比例3的结果可知，当培养基中不含有L-精氨酸、硫酸锌或聚醚消泡剂时，玻璃酸钠的产量大幅下降；通过对比例4的结果可知，当所有原料同时共混时，也不利于提升玻璃酸钠的产量，产量也出现大幅的下降。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的生产玻璃酸钠的培养基及其制备方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。