《一种快速分离厌氧微藻的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种快速分离厌氧微藻的方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 101709267 B (45)授权公告日 2011.08.31 CN 101709267 B *CN101709267B* (21)申请号 200910230547.X (22)申请日 2009.11.27 C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (73)专利权人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市南海路 7 号 (72)发明人 王广策 乔洪金 张晓娟 朱大玲 潘光华 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 许宗富 周秀梅 CN 101270334 A,2008.09.24, 。
2、全文 . 向文洲 谢科 吴华莲 何慧 肖伟 . 一种绿藻分离物的显微研究 .热带 海洋学报 .2007, 全文 . 王修垣 谢树华 薛燕芬 . 用斜面法分离厌氧微生物 .微生 物学通报 .1994, 全文 . (54) 发明名称 一种快速分离厌氧微藻的方法 (57) 摘要 本发明涉及微藻的分离方法， 具体的说是一 种快速分离厌氧微藻的方法。将待分离样品加入 盛有 TAP 培养基的器皿中， 然后用灭菌的液体石 蜡密封， 置于光照培养箱中培养直至上层液体变 成绿色， 使待分离样品充分富集生长， 待用 ； 取上 述富集培养的待分离样品1ml， 稀释至10-5， 10-6和 10-7三个稀释度， 将三。
3、个梯度的待分离样品分别 涂于加入 1.5琼脂、 冷却的 TAP 培养基上， 然后 再铺一层加入1.5琼脂的TAP培养基， 而后再铺 一层低熔点固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 倒 置于光照培养箱中培养 5-10 天 ； 若出现蓝色或绿 色藻落， 即为存在厌氧微藻 ； 若没有出现蓝色或 绿色藻落， 即为不存在厌氧微藻。 本发明可在短时 间内获得厌氧微藻， 方法简单， 实用性强。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李美宣 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 CN 101709267 B1/1 页 2 1. 一种。
4、快速分离厌氧微藻的方法， 其特征在于 ： 将待分离样品加入盛有 TAP 培养基的 器皿中， 然后用灭菌的液体石蜡密封， 置于光照培养箱中以 25 或 30， 40molm-2s-1 条件下培养直至上层液体变成绿色， 使待分离样品充分富集生长， 待用 ； 取上述富集培养 的待分离样品 1ml， 稀释至 10-5， 10-6和 10-7三个稀释度， 将三个梯度的待分离样品分别涂 于加入 1.5琼脂、 冷却的 TAP 培养基上， 然后再铺一层加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 而 后再铺一层低熔点固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 倒置于光照培养箱中以 25 或 30， 40molm-2s-1条件。
5、下培养 5-10 天 ； 若上述培养基中出现蓝色或绿色藻落， 即为待分离样品中存在厌氧微藻 ； 若上述培养 基中没有出现蓝色或绿色藻落， 即为待分离样品中不存在厌氧微藻 ； 所述样品为绿藻门 GXNN01 ； 所述培养基中出现蓝色或绿色藻落， 将培养基上固体石蜡去掉， 用巴氏吸管将蓝色或 绿色藻落吸出至 TAP 液体培养基中培养， 待颜色变绿后， 将藻落加入盛有 TAP 培养基的器 皿中， 然后用灭菌的液体石蜡密封， 置于光照培养箱中以 25 或 30， 40molm-2s-1条 件下培养直至上层液体变成绿色， 使待分离样品充分富集生长， 待用 ； 取上述富集培养的 待分离样品 1ml， 稀释。
6、至 10-5， 10-6和 10-7三个稀释度， 将三个梯度的待分离样品分别涂于 加入 1.5琼脂、 冷却的 TAP 培养基上， 然后再铺一层加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 而后 再铺一层低熔点固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 倒置于光照培养箱中以 25 或 30， 40molm-2s-1条件下培养 5-10 天， 为一个周期， 如此重复 3 至 4 个周期 ； 即获得纯化后 藻液 ； 所述纯化后藻液接种于TAP培养基中， 加入终浓度为1mg/L的刃天青作为厌氧指示剂， 另外加入终浓度为 0.1 (m/m) 的连二亚硫酸钠作为除氧剂， 而后将其处于厌氧状态， 置于 光照培养箱中培养至培。
7、养基变为蓝色或绿色， 取藻落加入连二亚硫酸钠， 若蓝色或绿色不 褪去， 表明分离到的微藻已经生长， 属于厌氧微藻 ； 所述涂布有待分离样品的加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 于 121灭菌 20min， 冷却后 涂布 ； 再涂布有待分离样品的加入 1.5琼脂的 TAP 培养基上再铺的加入 1.5琼脂的 TAP 培养基于 121灭菌 20min， 冷却至 45， 待用 ； 所述低熔点固体石蜡为 60石蜡。 2. 按权利要求 1 所述的快速分离厌氧微藻的方法， 其特征在于 ： 所述厌氧状态为将培 养基密封后迅速充入高纯氮气一分钟， 刃天青由蓝色变为无色， 即为厌氧状态。 权 利 要 求 书 C。
8、N 101709267 B1/4 页 3 一种快速分离厌氧微藻的方法 技术领域 0001 本发明涉及微藻的分离方法， 具体的说是一种快速分离厌氧微藻的方法。 背景技术 0002 微藻是一种生物制氢的重要材料， 在其生产氢气的过程中必须给予一个严格的厌 氧环境， 防止氢气与氧气结合。蓝藻细胞主要依靠固氮酶释放氢气， 只要去除铵离子， 氮气 等底物以及氧气， 就可以在厌氧环境下持续产氢。对于绿藻， 目前常用的技术方法是 “间接 生物光解” 法， 首先正常培养绿藻细胞， 使之靠光合作用累积自身所需的碳水化合物 ； 然后 将收获的绿藻细胞培养在缺硫的培养基中， 此后 PSII 活性很快丧失， 而线粒体。
9、的呼吸作用 几乎不受影响， 导致培养基中的 O2逐渐被呼吸作用消耗掉， 氢酶活性达到最大， 从而得到了 较高的产氢量。 一段时间后再将第二阶段的细胞转移到正常培养基中， 重新进 “第一阶段” ， 如此周而复始。然而， 不管是蓝藻的固氮酶还是绿藻的氢酶， 它们对氧气都是极其敏感的， 氧气的发生会极大地限制氢气产量。但是严格的厌氧环境反过来又会抑制微藻细胞的生 长， 使得操作技术复杂化。如果能够找到在厌氧环境下快速生长的微藻藻种， 那么不仅可 以大大减少操作技术的复杂性， 而且也能获得较高的氢气产量。随着微藻作为生物制氢的 材料越来越受到重视， 分离培养这种具有厌氧生长能力的微藻藻种具有重要的潜在。
10、应用价 值。 0003 厌氧微藻作为一类特殊的生物群体， 反应了生物从无氧环境到有氧环境的生物进 化历程， 因此是生命进化树上的重要一环， 具有重要的研究价值。 0004 厌氧微生物的分离培养已有许多成熟的技术， 比如亨盖特滚管技术， 厌氧培养箱 操作技术等等， 但是这些方法操作复杂， 成本高昂， 不适合于快速地分离鉴定厌氧微藻。 发明内容 0005 本发明目的在于提供一种快速分离厌氧微藻的方法。 0006 为实现上述目的本发明采用的技术方案为 ： 0007 一种快速分离厌氧微藻的方法 ： 将待分离样品加入盛有 TAP 培养基的器皿中， 然 后用灭菌的液体石蜡密封， 置于光照培养箱中以 25 。
11、或 30， 40molm-2s-1条件下培养 直至上层液体变成绿色， 使待分离样品充分富集生长， 待用 ； 取上述富集培养的待分离样品 1ml， 稀释至 10-5， 10-6和 10-7三个稀释度， 将三个梯度的待分离样品分别涂于加入 1.5琼 脂、 冷却的 TAP 培养基上， 然后再铺一层加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 而后再铺一层低熔 点固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 倒置于光照培养箱中以 25 或 30， 40molm-2s-1 条件下培养 5-10 天 ； 0008 若上述培养基中出现蓝色或绿色藻落， 即为待分离样品中存在厌氧微藻 ； 若上述 培养基中没有出现蓝色或绿色藻落，。
12、 即为待分离样品中不存在厌氧微藻。 0009 所述培养基中出现蓝色或绿色藻落， 将培养基上固体石蜡去掉， 用巴氏吸管将蓝 色或绿色藻落吸出至 TAP 液体培养基中培养， 待颜色变绿后， 将藻落加入盛有 TAP 培养基 说 明 书 CN 101709267 B2/4 页 4 的器皿中， 然后用灭菌的液体石蜡密封， 置于光照培养箱中以 25 或 30， 40molm-2s-1 条件下培养直至上层液体变成绿色， 使待分离样品充分富集生长， 待用 ； 取上述富集培养 的待分离样品 1ml， 稀释至 10-5， 10-6和 10-7三个稀释度， 将三个梯度的待分离样品分别涂 于加入 1.5琼脂、 冷却的。
13、 TAP 培养基上， 然后再铺一层加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 而 后再铺一层低熔点固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 倒置于光照培养箱中以 25 或 30， 40molm-2s-1条件下培养 5-10 天， 为一个周期， 如此重复 3 至 4 个周期 ； 即获得纯化后 藻液。 0010 所述纯化后藻液接种于 TAP 培养基中， 加入终浓度为 1mg/L 的刃天青作为厌氧指 示剂， 另外加入终浓度为 0.1 (m/m) 的连二亚硫酸钠作为除氧剂， 而后将其处于厌氧状 态， 置于光照培养箱中培养至培养基变为蓝色或绿色， 取藻落加入连二亚硫酸钠， 若蓝色或 绿色不褪去， 表明分离到的微藻已。
14、经生长， 属于厌氧微藻。 0011 所述厌氧状态为将培养基密封后迅速充入高纯氮气一分钟， 刃天青由蓝色变为无 色， 即为厌氧状态。 0012 所述涂布有待分离样品的加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 于 121灭菌 20min， 冷 却后涂布 ； 再涂布有待分离样品的加入1.5琼脂的TAP培养基上再铺的加入1.5琼脂的 TAP 培养基于 121灭菌 20min， 冷却至 45， 待用 ； 所述低熔点固体石蜡为 60石蜡。 0013 本法发明所具有的优点 ： 0014 本发明可快速分离厌氧微藻， 其利用简单的 “三明治” 夹层培养法， 在短时间内获 得厌氧微藻单克隆， 方法简单， 实用性强， 。
15、同时结合简单的厌氧培养方法， 可以快速确定所 得微藻是否在厌氧条件下生长。 附图说明 0015 图 1 为本发明的 “三明治” 平板 ( 其中 1. 琼脂一层 ； 2. 琼脂二层 ； 3. 石蜡层 ； 4. 培 养皿 )。 0016 图 2 为采用本发明方法分离出的微藻藻株 GXNN01 在厌氧平板上的单克隆藻落。 0017 图3为基于18S rRNA基因序列的进化树， 以Chlamydomonasreinhardtii CC-1952 为外源对照。 0018 图4基于ITS(内含子间隔区)序列的进化树， 以Chlamydomonasreinhardtii SAG 11-32b 为外源对照。 。
16、0019 图 5A 为采用本发明方法分离出的微藻藻株 GXNN 01 的光镜照片。 0020 图 5B 为采用本发明方法分离出的微藻藻株 GXNN 01 的扫描电镜照片。 0021 图 5C 为采用本发明方法分离出的微藻藻株 GXNN 01 的透射电镜照片。 0022 图6为采用本发明分离出的微藻藻株GXNN 01在添加苹果酸条件下的混养有氧和 混养厌氧生长曲线， 以及自养条件下的生长曲线。 具体实施方式 0023 实施例 1 0024 待分离样品从广西省南宁市淀粉加工厂的一处污水处理池中， 用取样器取少量底 层污泥和污水， 装入无菌瓶中， 盖紧盖子， 命名为 GXNN01， 密封后带回实验室。
17、置于四度保存。 说 明 书 CN 101709267 B3/4 页 5 取少量污泥接种于盛有 TAP 培养基的三角瓶中， 上面覆盖一层液体石蜡， 用丁基橡胶塞盖 紧， 置于光照培养箱中， 于 30， 40molm-2s-1条件下培养直至上层液体变成绿色。取 上层培养基 1mL， 加入至 9mLTAP 培养基中， 进行十倍梯度稀释至 10-5， 10-6和 10-7三个稀释 度的藻液， 而后将 3 个梯度的澡液分别涂于 “三明治” 平板 ( 参见图 1) 上。所述 “三明治” 为 ： 澡液涂布于加入 1.5琼脂的、 冷却的 TAP 培养基上， 然后再铺一层加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 而。
18、后再铺一层低熔点固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 即为 “三明治” 平板， 而 后将涂好的平板倒置于光照培养箱中 30， 40molm-2s-1条件下培养。约 5 天后平板 中央长出现蓝色或绿色单藻落 ( 参见图 2)。即为待分离样品中不存在厌氧微藻。 0025 在无菌台中用镊子轻轻将上述培养基上层的石蜡剥落， 并用接种环扎进琼脂层挑 取单藻落至 TAP 液体培养基中培养， 待颜色变绿后， 将藻落加入承有 TAP 培养基的器皿中， 然后用灭菌的液体石蜡密封， 置于光照培养箱中以 30， 40molm-2s-1条件下培养直 至上层液体变成绿色， 使待分离样品充分富集生长， 待用 ； 取上述富集。
19、培养的待分离样品 1ml， 稀释至 10-5， 10-6和 10-7三个稀释度， 将三个梯度的待分离样品分别涂于加入 1.5琼 脂、 冷却的TAP培养基上， 然后再铺一层加入1.5琼脂的TAP培养基， 而后再铺一层低熔点 固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 倒置于光照培养箱中以 30， 40molm-2s-1条件下 培养约 5 天， 为一个周期， 如此重复 3 周期 ； 即获得纯化后藻液。 0026 取获得纯化后藻液接种于 TAP 培养基中， 加入过滤除菌的 10连二亚硫酸钠储液 ( 终浓度 0.1 ) 和 1mg/mL 的刃天青储液 ( 终浓度 1mg/L)， 而后将培养基密封后迅速充入 高。
20、纯氮气一分钟， 刃天青由蓝色变为无色， 其处于厌氧状态， 置于光照培养箱中培养 5 天， 培养基变为蓝色或绿色， 取藻落加入连二亚硫酸钠， 若蓝色或绿色不褪去， 表明分离到的微 藻已经生长， 属于厌氧微藻。 0027 利用通用引物进行PCR， 扩增了该藻的18S rRNA基因和内含子间隔区(ITS)序列， 并对其进行了测序， 经 Blast 比对， 做进化树分析表明该微藻是隶属于绿藻门的 Chlorella sorokiniana GXNN01( 参见图 3、 图 4)。 0028 对该藻的细胞结构进行了光镜， 扫描电镜和透射电镜分析 ( 参见图 5A、 图 5B、 图 5C)， 光镜分析表明。
21、该藻是单细胞微藻， 呈圆形或椭圆形， 细胞大小在 2.1m 到 5.6m 之 间， 细胞内部被一个杯状的叶绿体填充， 叶绿体内有蛋白核和淀粉粒， 生殖方式通过似亲孢 子生殖， 一个细胞放散四个小孢子。 0029 对该藻的生长曲线(参见图6)的分析表明， 该藻具有在有氧和厌氧条件下快速生 长的能力。在自养条件下， 生长周期漫长， 在 12d 之后才进入稳定期 ； 在添加苹果酸并且有 氧气条件下， 该藻能快速生长， 仅 5d 就进入稳定期， 而且在厌氧条件下保持着相同生长速 度但细胞密度有所降低。同时， 该藻还可以利用葡萄糖， 乙酸盐， 果糖， 琥珀酸， 延胡索酸丙 酮酸等进行异养或混养生长。 0。
22、030 对该藻的生化成分进行分析表明， 在自养条件下蛋白质含量可达 75细胞干重， 在以乙酸盐作为碳源进行异养生长时脂肪含量可达 28细胞干重， 因此具有重要的应用价 值， 既可作水产饵料又可当作生物制氢和生物柴油的反应器。 0031 实施例 2 0032 将待分离样品加入承有 TAP 培养基的器皿中， 然后用灭菌的液体石蜡密封， 置于 光照培养箱中以 30， 40molm-2s-1条件下培养直至上层液体变成绿色， 使待分离样品 说 明 书 CN 101709267 B4/4 页 6 充分富集生长， 待用 ； 取上述富集培养的待分离样品 1ml， 稀释至 10-5， 10-6和 10-7三个稀。
23、释 度， 将三个梯度的待分离样品分别涂于加入 1.5琼脂、 冷却的 TAP 培养基上， 然后再铺一 层加入 1.5琼脂的 TAP 培养基， 而后再铺一层低熔点固体石蜡， 使其处于密封厌氧状态， 倒置于光照培养箱中以 30， 40molm-2s-1条件下培养 6-7 天 ； 0033 上述培养基中没出现蓝色或绿色藻落， 即为待分离样品中不存在厌氧微藻。 说 明 书 CN 101709267 B1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101709267 B2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101709267 B3/3 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 。