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1、(10)授权公告号 CN 101792815 B (45)授权公告日 2012.03.21 CN 101792815 B *CN101792815B* (21)申请号 201010150801.8 (22)申请日 2010.03.25 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 中国检验检疫科学研究院 地址 100123 北京市朝阳区高碑店北路甲 3 号 专利权人 袁飞 (72)发明人 陈颖 袁飞 杨海荣 暴书婵 赵勇胜 (74)专利代理机构 隆天国际知识产权代理有限 公司 72003 代理人 吴小瑛 吕俊清 CN 101250582 A,2。
2、008.08.27, 全文 . CN 101250583 A,2008.08.27, 全文 . 侯晓军等.一种苦荞主要过敏原基因cDNA的 克隆及序列分析 .中国生物化学与分子生物学 报 .2003, 第 19 卷 ( 第 04 期 ), 全文 . 吴海强等 . 食品过敏原的检测与分析 .热 带医学杂志 .2006, 第 6 卷 ( 第 05 期 ), 全文 . 曹际娟等 . 实时荧光 PCR 快速检测食品中致 敏原芹菜成分 .生物技术通报 .2009, 全文 . (54) 发明名称 腰果过敏原 PCR 检测方法和试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及测定腰果过敏原的 PCR 检测方 法， 所述方。
3、法包括使用针对腰果致敏蛋白基因的 特异性引物对。本发明还涉及快速检测腰果过 敏原的试剂盒， 所述试剂盒包括用于 PCR 检测腰 果过敏原的针对腰果致敏蛋白基因的特异性引物 对。本发明还涉及腰果致敏蛋白基因的特异性引 物对在检测腰果过敏原中的应用。使用本发明的 PCR检测方法和PCR检测试剂盒， 能够简单、 快速、 特异且灵敏地测定食品、 药品以及营养品等中是 否含有腰果过敏原。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张艳霞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 5 页 附图 2 页 CN 101792815 B1/1 页。
4、 2 1. 一种腰果过敏原的 PCR 检测方法， 所述方法包括使用针对腰果致敏蛋白基因的特异 性引物对， 其中所述PCR检测方法是检测腰果致敏蛋白AnaO3基因， 其中所述特异性引物对 为 SEQ IDNO ： 17 和 SEQ ID NO ： 18。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中 PCR 反应的扩增退火温度为 55.4。 3. 快速检测腰果过敏原的试剂盒， 所述试剂盒包括用于 PCR 检测腰果过敏原的针对腰 果致敏蛋白基因的特异性引物对和使用说明书， 所述特异性引物对为 SEQ ID NO ： 17 和 SEQ ID NO ： 18。 4. 根据权利要求 3 所述的试剂盒， 所。
5、述使用说明书中给出的 PCR 反应的扩增退火温度 为 55.4。 5. 腰果致敏蛋白基因的特异性引物对在检测腰果过敏原中的应用， 其中所述特异性引 物对为 SEQ ID NO ： 17 和 SEQ ID NO ： 18。 权 利 要 求 书 CN 101792815 B1/8 页 3 腰果过敏原 PCR 检测方法和试剂盒 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体而言， 本发明涉及一种腰果过敏原 PCR 检测方法， 快速检测腰果过敏原的试剂盒， 以及腰果致敏蛋白基因的特异性引物对在检测腰果过敏原 中的应用。 背景技术 0002 食品过敏原现已成为一个新兴的公众性健康问题， 全世界范围内。
6、有 1 -2的成 年人对食品过敏， 有8以上低于三岁儿童对食品过敏。 产生的临床症状有皮肤反应(荨麻 疹、 血管性水肿、 湿疹等)、 呼吸症状(哮喘、 鼻炎等)、 肠胃症状(呕吐、 腹泻、 肠胃痉挛等)、 全身系统反应 ( 心血管症状等 )， 严重时发生过敏性休克危及生命。 0003 现有食品中过敏原检测方法主要有 ： 利用单克隆或多克隆抗体检测食品过敏原蛋 白的方法和采用 PCR 和实时荧光 PCR 方法检测食品中过敏原基因的方法。两种方法各有优 缺点。 针对过敏原蛋白的方法， 直接检测致敏蛋白， 针对性更好 ； 但对食品， 特别是深加工食 品检测时， 由于其中过敏原蛋白结构发生改变而易导致。
7、假阴性结果。针对过敏原基因的方 法， 没有直接检测致敏蛋白， 而间接检测过敏原成分， 针对性不如前一种方法 ； 但对深加工 食品检测时， 由于深加工对 DNA 的破坏程度低于对蛋白质的结构破坏， 因此可改善假阳性 情况。 0004 目前， 食品中腰果过敏原 PCR 检测方法， 国内外鲜有报道， 且尚无针对腰果致敏蛋 白基因的检测方法。 此外， 国外已经开发了几种腰果致敏蛋白检测试剂盒， 但是其通常与芝 麻、 胡桃、 开心果等存在交叉反应， 特异性不高。本领域还未见报道用于快速检测食品中腰 果过敏原的试剂盒。 0005 因此， 本领域需要一种快速、 特异性好、 灵敏度高的腰果过敏原检测方法以及用。
8、于 快速检测腰果过敏原的试剂盒， 进行食品、 药品以及营养品中腰果过敏原的检测。 发明内容 0006 本发明的一个目的在于， 提供快速检测腰果过敏原的 PCR 检测方法。 0007 本发明的另一个目的在于， 提供快速检测腰果过敏原的试剂盒。 0008 本发明的还一个目的在于， 提供腰果致敏蛋白基因的特异性引物对在检测腰果过 敏原中的应用。 0009 针对上述发明目的， 本发明提供以下技术方案 ： 0010 在一个实施方案中， 本发明提供腰果过敏原 PCR 检测方法， 所述方法包括使用针 对腰果致敏蛋白基因的特异性引物对。 0011 在一个实施方案中， 所述腰果过敏原 PCR 检测方法中特异性引。
9、物对的确定包括对 腰果致敏蛋白基因的特异性引物的设计和引物筛选步骤。 0012 关于腰果过敏原的研究很少， 而利用腰果致敏蛋白通过 PCR 检测腰果过敏原 的方法目前尚未见报道。本发明的发明人针对腰果中主要致敏蛋白 Ana o 1( 参见 说 明 书 CN 101792815 B2/8 页 4 a cashew(Anacardium occidental)allergen of the vicilinseed storage protein family.Fang Wang， Jason M.Robotham， SuzanneS.Teuber， Pallavi Tawde， Shridhar 。
10、K.Sathe， and Kenneth H.Roux.J.ALLERGY CLIN.IMMUNOL.， 2002， 110 ： 1160-1166)、 Ana o 2( 参见 a MajorCashew(Anacardium occidentale L.)Nut Allergen of the Legumin Family.Fang Wang， Jason M.， Robothama Suzanne S.， Teuberb Shridhar K.Sathe， andKenneth H.Roux.Int.Arch.Allergy Immunol.2003， 132 ： 27-39) 以及 An。
11、a o 3( 参见 an important cashew nut(Anacardium occidentale L.)allergen of the2S albumin family.Jason M.， Robotham， Fang Wang， Vanessa Seamon， Suzanne S.Teuber， Shridhar K.Sathe， Hugh A.Sampson， Kirsten Beyer， Margaret Seavy and Kenneth H.Roux. J.ALLERGY CLIN.IMMUNOL.2005， 115 ： 1284-1290) 设计特异性引物， 以通过。
12、 PCR 方法检测腰 果过敏原。在一个本发明的腰果过敏原 PCR 检测方法的优选实施方案中， 所述腰果致敏蛋 白基因选自 AnaO1、 AnaO2 和 AnaO3 基因中的一种或多种。 0013 在本发明的方法的一个优选实施方案中， 针对腰果主要致敏蛋白 AnaO1 基 因 的 特 异 性 引 物 对 为 AnaO1F1 ： TTCCTCCGACCAGTCAATCT(SEQ ID NO ： 1) 和 AnaO1R2 ： TGCCTTCTGCGTTTACTTCA(SEQ ID NO ： 2) ； AnaO1F2 ： ACTATGCCGCTTTAGGTGTC(SEQ ID NO ： 3)和 Ana。
13、O1R2 ： TGCCTTCTGCGTTTACTTC(SEQ ID NO ： 4) ； AnaO1F3 ： TCCTCCGACCAGTCAATCT(SEQ ID NO ： 5) 和 AnaO1R3 ： GTTGCCTTCTGCGTTTACTT(SEQ ID NO ： 6)。 0014 在本发明的方法的一个优选实施方案中， 针对腰果主要致敏蛋白 AnaO2 基 因 的 特 异 性 引 物 对 为 AnaO2F1 ： AGGGTGAGGGTATGACAGGA(SEQ ID NO ： 7) 和 AnaO2R1 ： TTTGAGGATTGGGAGGTTGA(SEQ ID NO ： 8) ； AnaO2。
14、F2 ： ATCCAACCTAATGGCCTTCT(SEQ ID NO ： 9)和 AnaO2R2 ： ATTGGCTAACACTTCCTCTGG(SEQ ID NO ： 10) ； AnaO2F3 ： TCCAGGGTGAGGGTATGAC(SEQ ID NO ： 11) 和 AnaO2R3 ： TTGAGGATTGGGAGGTTGA(SEQ ID NO ： 12)。 0015 在本发明的方法的一个优选实施方案中， 针对腰果主要致敏蛋白 AnaO3 基因 的 特 异 性 引 物 对 为 AnaO3F1 ： TACTCCTCCTATCTGCCTTCG(SEQ ID NO ： 13) 和 Ana。
15、O3R1 ： CACCCTTTATTTGTTCCTGTG(SEQ IDNO ： 14) ； AnaO3F2 ： AACGCCTCCATTTACCGA(SEQ ID NO ： 15) 和 AnaO3R2 ： CTGCCTCACCATTTGCTCTA(SEQ ID NO ： 16) ； AnaO3F3 ： TACTCCTCCTATCTGCCTTCG(SEQ ID NO ： 17) 和 AnaO3R3 ： CCTCCTCACCCTTTATTTGT(SEQ ID NO ： 18)。 0016 更优选地， 在本发明的腰果过敏原 PCR 检测方法中， 所使用的针对腰果主要致 敏蛋白基因的特异性引物对为 A。
16、naO3F3 ： TACTCCTCCTATCTGCCTTCG(SEQ ID NO ： 17) 和 AnaO3R3 ： CCTCCTCACCCTTTATTTGT(SEQ ID NO ： 18)。 0017 在一个实施方案中， 引物设计采用美国 Primer express3.0 软件进行。在本发明 的腰果过敏原 PCR 检测方法中的特异性引物对的确定中， 在引物筛选步骤中的筛选条件为 选择退火温度较高、 扩增条带清晰、 无非特异性条带、 无引物二聚体的引物对。 0018 在一个实施方案中， 本发明的腰果过敏原 PCR 检测方法还进一步包括提取样品 DNA 的步骤。在一个实施方案中， 所述 DNA。
17、 提取采用 CTAB 方法。在另一个实施方案中， 所述 DNA 提取采用商业化的试剂盒。在一个实施方案中， 所述商业化的试剂盒为 Wizard Magnetic DNA Purificationfor Food。 0019 在本发明的腰果过敏原 PCR 检测方法中， 还进一步包括对 PCR 扩增条件进一步优 说 明 书 CN 101792815 B3/8 页 5 化的步骤。在一个优选的实施方案中， 在 PCR 扩增条件优化的步骤中， 使用不同的退火温度 进行扩增。在一个优选的实施方案中， 所述 PCR 扩增条件是 94， 5min ； 94， 30s ； 50， 30s， R 3.0 /s， 。
18、G 5.5， 35 个循环 ； 72， 5min。 0020 在本发明的腰果过敏原 PCR 检测方法中， 还进一步包括确定 PCR 方法特异 性的步骤。在一个优选的检测 PCR 方法特异性的实施方案中， 所使用的坚果为开心 果、 杏仁、 花生、 巴西坚果、 长寿果、 核桃、 山核桃、 瓜子、 芝麻、 大麦、 榛果、 松子。在一 个优选的检测 PCR 方法特异性的实施方案中， 使用植物通用引物作为内参照来保证 扩增有效性。在一个实施方案中， 使用腰果引物对 AnaO3F、 AnaO3R 和植物通用扩 增引物对 18Srdna-1 ： CTCAACCATAAACGATGCCGACCAG(SEQ I。
19、D NO ： 19)， 18Srdna-2 ： CCAGACAAATCGCTCCACCAACTAA(SEQ ID NO ： 20)， 进行双重 PCR 扩增。 0021 在本发明的腰果过敏原 PCR 检测方法中， 还进一步包括确定 PCR 方法灵敏度的步 骤。在一个实施方案中。所述确定 PCR 方法灵敏度包括确定 PCR 方法的绝对灵敏度和相对 灵敏度。在一个优选的实施方案中， 通过采用紫外分光光度计测定样品 DNA 溶液吸光值， 用 无菌水对样品 DNA 溶液进行系列稀释， 然后进行 PCR 扩增来确定绝对灵敏度。在一个优选 的实施方案中， 通过如下步骤确定相对灵敏度 ： 将腰果与大麦核酸裂。
20、解溶液混和， 配成系列 稀释的含腰果成分的腰果大麦混合溶液， 提取 DNA， 然后进行 PCR 扩增。 0022 在一个优选的实施方案中， 本发明的腰果过敏原 PCR 检测方法的确定包括如下步 骤 ： 0023 1. 提取样品 DNA ； 0024 2. 引物设计 ； 0025 3. 引物筛选 ； 0026 4.PCR 扩增条件优化 ； 0027 5. 确定方法特异性 ； 和 0028 6. 确定方法灵敏度。 0029 本发明提供了一种腰果过敏原的 PCR 检测方法， 其根据腰果的主要致敏蛋白 AnaO1、 AnaO2、 AnaO3 的基因序列， 设计引物， 筛选出特异性好的最佳引物， 建立了。
21、特异性好、 灵敏度高的腰果过敏原 PCR 检测法， 从而实现廉价、 快速、 高特异性、 高灵敏度地检测腰果 过敏原。 0030 本发明适宜于腰果过敏原的快速测定， 可快速、 特异且灵敏地测定腰果过敏原致 敏基因， 从而为确保食品过敏人群得到安全的食品提供技术手段。 0031 根据本发明的一个实施方案， 本发明的测定方法的确定包括以下步骤 ： 0032 A. 提取样品 DNA 0033 采用 CTAB 方法 (Murray， M.G.and W.F.Thompson.1980.Rapid isolationofhigh molecular weight DNA.Nucleic Acids Res。
22、.8 ： 4321-4325)， 也可采用商业化的试剂盒， 如 Wizard Magnetic DNA Purification for Food(promega公司， 美国)等， 提取样品DNA。 特 异性实验中使用的其他坚果样品 DNA 的提取以及灵敏度实验中大麦粉和腰果混合样品 DNA 的提取也采用上述方法。 0034 B. 引物设计 0035 利用美国Primer express3.0软件(ABI公司， 美国)， 针对腰果的三种主要致敏蛋 说 明 书 CN 101792815 B4/8 页 6 白 AnaO1、 AnaO2、 AnaO3 的基因序列， 设计 9 对引物， 引物均由上海英。
23、骏技术公司合成。 0036 C. 引物筛选 0037 引物对的初步筛选， 以腰果样品 DNA( 浓度为 10ng/L) 为模板， 分别采用上述引 物进行温度梯度 PCR 扩增， 根据 2琼脂糖凝胶电泳图， 选择退火温度较高、 扩增条带清晰、 无非特异性条带、 无引物二聚体的引物对。 0038 引物对的特异性筛选， 选择易与腰果发生交叉反应的开心果、 杏仁、 花生、 核桃、 瓜 子、 芝麻、 榛果， 提取其 DNA， 以其 DNA 为模板， 分别以初步筛选出的几对引物为扩增引物， 进 行扩增， 根据 2琼脂糖凝胶电泳图， 选择无交叉反应的引物对。 0039 D.PCR 扩增条件优化 0040 以。
24、腰果样品 DNA 为模板， 采用筛选出来的腰果引物， 使用不同退火温度扩增， 2 琼脂糖凝胶电泳分析结果， 找出该引物反应的最佳退火温度。 0041 E. 确定方法特异性 0042 以腰果、 杏仁、 开心果等 13 种坚果 DNA 为模板， 采用筛选出来的腰果引物对 AnaO3F、 AnaO3R 和植物通用扩增引物对 18Srdna-1， 18Srdna-2， 进行双重 PCR 扩增， 在以植 物通用引物作为内参照来保证扩增有效性的情况下， 确定该方法的特异性。 用2琼脂糖凝 胶电泳分析结果。 0043 F. 确定方法灵敏度 0044 确定方法的绝对灵敏度。采用紫外分光光度计测定腰果样品 DN。
25、A 溶液吸光值， 确定其浓度。用无菌水稀释腰果样品 DNA 溶液， 使其质量浓度分别为 10ng/L、 1ng/L、 100pg/L、 10pg/L、 1pg/L。分别取 5L 进行 PCR 扩增。用 2琼脂糖凝胶电泳分析结 果， 确定发生扩增的最小浓度为绝对灵敏度。 0045 确定方法的相对灵敏度。分别称取研磨成细粉状的腰果、 大麦 0.5g 放入 1.5mL 离 心管中， 加入 1mL 核酸裂解液， 放入 65， 恒温振荡 2h。将腰果与大麦溶液混和， 配成含有 10、 5、 1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.001、 0.0001腰果(W/W)溶液， 采用A中 方法提。
26、取 DNA。分别取 5L 进行 PCR 扩增。用 2琼脂糖凝胶电泳分析结果， 确定发生扩 增的最小浓度为相对灵敏度。 0046 在另一个实施方案中， 本发明提供快速检测腰果过敏原的试剂盒， 所述试剂盒包 括用于 PCR 检测腰果过敏原的针对腰果致敏蛋白基因的特异性引物对和使用说明书。在 一个优选的实施方案中， 所述试剂盒还包括用于样品 DNA 提取的试剂和用于 PCR 反应的试 剂。在一个优选的实施方案中， 所述试剂盒的使用说明书中包括对用于腰果过敏原 PCR 扩 增的条件的描述。在一个优选的实施方案中， 所述试剂盒的说明书中给出的 PCR 扩增条件 是 94， 5min ； 94， 30s，。
27、 55.4， 30s， 72， 30s， 35 个循环 ； 72， 5min ； 4， 保存。 0047 在另一个实施方案中， 本发明提供腰果致敏蛋白基因的特异性引物对在检测腰果 过敏原中的应用。在一个优选的实施方案中， 本发明提供腰果致敏蛋白基因的特异性引物 对 AnaO1F3 ： TCCTCCGACCAGTCAATCT 和 AnaO1R3 ： GTTGCCTTCTGCGTTTACTT 在检测腰果过敏原 中的应用。 0048 本发明的检测方法和试剂盒不仅适合检测食品中的腰果过敏原， 还能够检测其他 物品， 例如药品、 营养品等中的腰果过敏原。 使用本发明的PCR检测方法和PCR检测试剂盒， 。
28、能够简单、 快速、 特异且灵敏地测定食品以及其他物品中是否含有腰果过敏原。 说 明 书 CN 101792815 B5/8 页 7 附图说明 0049 图 1 是显示本发明的腰果致敏原特异性引物对的 PCR 扩增条件的优化， 其中各泳 道的腰果 DNA 的扩增退火温度如下 ： 1 ： 44.5； 2 ： 44.6； 3 ： 45.2； 4 ： 46.2； 5 ： 47.5； 6 ： 48.9 ； 7 ： 50.4 ； 8 ： 51.9 ； 9 ： 53.3 ； 10 ： 54.5 ； 11 ： 55.4 ； 12 ： 55.9。 0050 图 2 是显示腰果过敏原 PCR 检测方法特异性的结果。
29、 0051 其中各泳道的样品如下 ： M ： DNA Marker ； 1 ： 腰果 DNA 的 PCR 产物 ； 2. 杏仁 DNA 的 PCR产物 ； 3 ： 开心果DNA的PCR产物 ； 4 ： 花生DNA的PCR产物 ； 5 ： 巴西坚果DNA的PCR产物 ； 6 ： 长寿果 DNA 的 PCR 产物 ； 7 ： 核桃 DNA 的 PCR 产物 ； 8 ： 葵花籽 DNA 的 PCR 产物 ； 9 ： 山核桃 DNA 的 PCR 产物 ； 10 ： 榛果 DNA 的 PCR 产物 ； 11 ： 松子 DNA 的 PCR 产物 ； 12 ： 芝麻 DNA 的 PCR 产物 ； 13 ： 。
30、大麦 DNA 的 PCR 产物 ； 14 ： 空白对照。 0052 图 3 是显示腰果过敏原 PCR 检测方法相对灵敏度的结果 0053 其中各泳道的样品如下 ： M ： DNA Marker ； 1-9 ： 依次为含 10、 5、 1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.001、 0.0001腰果成分的腰果大麦混合物的 PCR 产物 ； 10 ： 空 白对照。 0054 图 4 是显示腰果过敏原 PCR 检测方法绝对灵敏度的结果 0055 其中各泳道的样品如下 ： M ： DNA Marker ； 1-6 ： 依次为 10ng/L、 1ng/L、 100pg/ L、 10pg/。
31、L、 1pg/L、 0.1pg/L 的腰果 DNA 的 PCR 产物 ； 7 ： 空白对照。 具体实施方式 0056 通过实施例的方式对本发明作进一步的说明， 但是本发明并不仅仅局限于以下实 施例。 0057 实施例 1 0058 本实施例为采用 CTAB 法提取腰果 DNA 的典型实例。 0059 称取研磨后样品0.1g放入1.5mL离心管中， 加入1mL CTAB提取缓冲液(100mmol/ L Tris-HCl(pH8.0)、 20mmol/L EDTA-Na2、 1.4mol/LNaCl、 2CTAB， 使用前加入0.1(V/V) 的-巯基乙醇)， 放入65， 恒温振荡1h。 经130。
32、00r/min， 10min离心后取上清700L， 加 入 490L 氯仿， 高速漩涡振荡混合 30s。经 13000r/min， 10min 离心后， 取 500L 上清， 转 入新管中， 加入 2 倍体积 CTAB， 室温 (20 ) 孵化 1h。13000r/min， 5min 离心后， 弃上清， 将 沉淀溶于350L， 1.2M NaCl溶液， 65， 放置20min。 加入350L氯仿， 高速涡旋震荡30s， 混匀。 13000r/min， 离心10min， 将定量的上清转移至新管， 加入0.8倍体积的异丙醇， -20 放置 0.5h。13000r/min， 10min 离心后， 弃。
33、上清， 用 70乙醇洗涤。13000r/min， 10min 离心 后， 弃上清。常温下干燥后， 溶于 100L ddH2O， 65放置 5min。4保存， 待用。 0060 对于腰果 DNA， 也可采用商品化的核酸提取试剂盒， 如 WizardMagnetic DNA Purification for Food 进行提取。 0061 实施例 2 0062 本实施例提供用于本发明的 PCR 方法的腰果致敏原特异性引物对的设计。 0063 利用美国 Primer express3.0 软件， 针对腰果的三种主要致敏蛋白 (AnaO1、 AnaO2、 AnaO3) 的基因序列， 设计 9 对引物 。
34、( 见表 1)， 引物均由上海英骏技术公司合成。 说 明 书 CN 101792815 B6/8 页 8 0064 表 1 引物序列、 目的基因及长度 0065 0066 实施例 3 0067 本实施例提供用于本发明的 PCR 方法的腰果致敏原特异性引物对的初步筛选和 特异性筛选。 0068 引物对的初步筛选， 以腰果 DNA( 浓度为 10ng/L) 为模板， 分别采用上述引物进 行温度梯度 PCR 扩增， 根据 2琼脂糖凝胶电泳图， 选择退火温度较高、 扩增条带清晰、 无非 特异性条带、 无引物二聚体的引物对。扩增条件为 ： 94， 5min ； 94， 30s ； 50， 30s， R 。
35、3.0/s， G5.5， 35个循环 ； 72， 5min ； 4， 保存。 扩增体系为 ： 缓冲液， 2.5L ； dNTP， 2L ； 引物， 10mol/L， 各 0.5L ； Taq 酶， 0.2L ； 模板 DNA， 30ng/L， 5L ； 水， 补足至体 积为 25L。 0069 经初步筛选， 选出以下几对引物 ： AnaO1 F2和AnaO1R2， AnaO2F2和AnaO2R2， AnaO3 F1 和 AnaO3R1， AnaO3F3 和 AnaO3R3， 将其用做后续步骤的扩增引物。 0070 引物对的特异性筛选， 选择易与腰果发生交叉反应的开心果、 杏仁、 花生、 核桃、。
36、 瓜 子、 芝麻、 榛果， 提取其 DNA， 以其 DNA 为模板， 分别以初步筛选出的几对引物为扩增引物， 进 行扩增， 根据2琼脂糖凝胶电泳图， 选择无交叉反应的引物对AnaO3F3和AnaO3R3。 PCR扩 增退火温度， 根据初步筛选结果确定。 说 明 书 CN 101792815 B7/8 页 9 0071 实施例 4 0072 本实施例提供用于本发明的PCR方法的腰果致敏原特异性引物对的PCR扩增条件 的优化。 0073 以腰果 DNA 为模板， 采用筛选出来的腰果引物， 使用不同退火温度扩增， 2琼脂 糖凝胶电泳分析结果， 找出该引物反应的最佳退火温度。所使用的退火温度为 44.。
37、5、 44.6、 45.2、 46.2、 47.5、 48.9、 50.4、 51.9、 53.3、 54.5、 55.4、 55.9。 0074 从图 1 可见， 退火温度为 55.4时能从样品中扩增出明亮清晰的条带， 且无拖尾， 无非特性条带和引物二聚体。 0075 实施例 5 0076 本实施例是确定本发明的 PCR 方法特异性的实施例。 0077 如实施例 1 所述的方法， 分别提取腰果、 杏仁、 开心果、 花生、 巴西坚果、 长寿果、 核 桃、 葵花籽、 山核桃、 榛果、 松子、 芝麻、 大麦样品的 DNA。 0078 以上述 13 种坚果 DNA 为模板， 采用筛选出来的腰果引物对。
38、 AnaO3F， AnaO3R 和植物 18SrDNA 基因为内参照， 进行双重 PCR 扩增， 在以植物通用引物作为内参照来保证扩增有效 性的情况下， 确定该方法的特异性。 作为内参照的植物18SrDNA基因的引物对序列为18Srd na-1CTCAACCATAAACGATGCCGACCAG(SEQ ID NO ： 19)， 18Srdna-2CCAGACAAATCGCTCCACCAACTA A(SEQ ID NO ： 20)。用 2琼脂糖凝胶电泳分析结果。根据筛选试验结果， 确定 PCR 反应的 退火温度为55.4。 PCR反应体系为 ： 10 x缓冲液， 2.5L ； dNTP 0.1-。
39、0.5mol/L， 2L ； 引 物对 AnaO3F、 AnaO3R， 10mol/L， 各 0.5L ； 引物对 18Srdna-1、 18Srdna-2， 10mol/L， 各 0.5L ； Taq DNA酶0.5-5U， 0.2L ； 模板DNA， 10ng/L， 5L ； 水， 补足至体积为25L。 扩 增条件扩增条件为 ： 94， 5min ； 94， 30s， 55.4， 30s， 72， 30s， 35 个循环 ； 72， 5min ； 4， 保存。 0079 从图 2 可见， 筛选出的引物对 AnaO3F3 和 AnaO3R3( 简称 AnaO3FR)， 仅腰果扩增出 了目标条。
40、带和内标条带 ； 其他坚果均未扩增出目标条带， 但是扩增出了内部条带 ； 空白对 照未发生扩增。说明该方法特异性好。 0080 实施例 6 0081 本实施例是确定本发明的 PCR 方法灵敏度的实施例， 包括绝度灵敏度和相对灵敏 度的确定。 0082 确定方法的绝对灵敏度。采用紫外分光光度计测定腰果 DNA 溶液吸光值， 确定其 浓度。用无菌水稀释腰果 DNA 溶液， 使其质量浓度分别为 10ng/L、 1ng/L、 100pg/L、 10pg/L、 1pg/L。分别取 5L 进行 PCR 扩增。扩增中退火温度为 55.4。用 2琼脂 糖凝胶电泳分析结果， 确定发生扩增的最小浓度为绝对灵敏度。。
41、 0083 确定方法的相对灵敏度。分别称取研磨成细粉状的腰果、 大麦 0.5g 放入 1.5mL 离 心管中， 加入 1mL 核酸裂解液， 放入 65， 恒温振荡 2h。将腰果与大麦溶液混和， 配成含有 10、 5、 1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.001、 0.0001腰果(W/W)溶液， 采用A中 方法提取 DNA。分别取 5L 进行 PCR 扩增。用 2琼脂糖凝胶电泳分析结果， 确定发生扩 增的最小浓度为相对灵敏度。 0084 从图 3 可见， 该方法可检出 0.001腰果成分， 从图 4 可见， 该方法可检出 0.1pg/ L 的腰果 DNA。说明该方法检测食品中。
42、腰果过敏原成分的相对灵敏度为 0.001 (W/W)， 说 明 书 CN 101792815 B8/8 页 10 绝对灵敏度为 0.1pg/L。 0085 实施例 7 0086 本实施例提供本发明的腰果过敏原的 PCR 检测方法。 0087 所述食品中腰果过敏原的 PCR 检测方法包括如下步骤 ： 0088 1. 食品 DNA 提取 ： 0089 如实施例 1 中所述， 采用 CTAB 法提取食品样品 DNA。 0090 2. 使用腰果致敏原特异性引物对 AnaO3F， AnaO3R 和植物通用扩增引物对 18Srdna-1， 18Srdna-2 进行 PCR 扩增。PCR 扩增反应体系及扩增。
43、条件如表 1 和 2 所示。 0091 表 1PCR 扩增反应体系 0092 0093 表 2PCR 扩增反应条件 0094 0095 该方法特异性好、 灵敏度高地检测了食品中腰果过敏原。 0096 实施例 8 0097 本实施例提供检测食品中腰果过敏原的试剂盒。 0098 所述试剂盒包括引物对 AnaO3F， AnaO3R 和引物对 18Srdna-1， 18Srdna-2PCR， 以及 使用说明书， 其中引物对 AnaO3F， AnaO3R 是用于 PCR 检测食品中腰果过敏原的针对腰果主 要致敏蛋白基因的特异性引物对， 18Srdna-1， 18Srdna-2 是植物通用扩增引物， 所述。
44、使用说 明书中给出了PCR扩增条件， 扩增条件为 ： 94， 5min ； 94， 30s， 55， 30s， 72， 30s， 35个 循环 ； 72， 5min ； 4， 保存。 0099 虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述， 但是本领域技术人员应认识到， 在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而， 本发明 意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。 说 明 书 CN 101792815 B1/5 页 11 SEQUENCE LISTING 中国检验检疫科学研究院 ； 袁飞 腰果过敏原 PCR 检测方法和试剂盒 C1000281 2。
45、0 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 ttcctccgac cagtcaatct 20 2 20 DNA 人工序列 2 tgccttctgc gtttacttca 20 3 20 DNA 人工序列 3 actatgccgc tttaggtgtc 20 4 19 DNA 序 列 表 CN 101792815 B2/5 页 12 人工序列 4 tgccttctgc gtttacttc 19 5 19 DNA 人工序列 5 tcctccgacc agtcaatct 19 6 20 DNA 人工序列 6 gttgccttct gcgtttactt 20 7 20。
46、 DNA 人工序列 7 agggtgaggg tatgacagga 20 8 20 DNA 人工序列 8 tttgaggatt gggaggttga 20 9 20 序 列 表 CN 101792815 B3/5 页 13 DNA 人工序列 9 atccaaccta atggccttct 20 10 21 DNA 人工序列 10 attggctaac acttcctctg g 21 11 19 DNA 人工序列 11 tccagggtga gggtatgac 19 12 19 DNA 人工序列 12 ttgaggattg ggaggttga 19 13 21 DNA 人工序列 13 tactc。
47、ctcct atctgccttc g 21 14 序 列 表 CN 101792815 B4/5 页 14 21 DNA 人工序列 14 caccctttat ttgttcctgt g 21 15 18 DNA 人工序列 15 aacgcctcca tttaccga 18 16 20 DNA 人工序列 16 ctgcctcacc atttgctcta 20 17 21 DNA 人工序列 17 tactcctcct atctgccttc g 21 18 20 DNA 人工序列 18 cctcctcacc ctttatttgt 20 19 序 列 表 CN 101792815 B5/5 页 15 25 DNA 人工序列 19 ctcaaccata aacgatgccg accag 25 20 25 DNA 人工序列 20 ccagacaaat cgctccacca actaa 25 序 列 表 CN 101792815 B1/2 页 16 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101792815 B2/2 页 17 图 4 说 明 书 附 图 。