技术领域
本发明涉及1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯及其制备方法，涉及它抑制肿瘤细胞增殖的活性，进一步涉及它对荷S180小鼠肿瘤生长的抑制作用，涉及它的DNA嵌插能力，因而本发明涉及它在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明属于生物医药领域。
技术背景
近年来，鉴于全球癌症发病率和死亡率急剧上升，癌症已经成为了一个世界问题.我国的癌症患者人数处于世界前列，癌症患者人数不断增加，对抗肿瘤药的需求也不断增加.目前临床应用的抗肿瘤药物存在许多局限性，随着科技的进步以及科学的发展，寻找安全有效的抗肿瘤新药是药物研究的热点之一。
癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称.使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物.据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家.而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万.因此，开发新的高效，低毒，毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。
随着对肿瘤特性和发病本质的认识，最近几年抗肿瘤药物不断从传统的细胞毒药物向发展非细胞毒药物过渡.β-咔啉是天然来源的细胞毒性抗肿瘤化合物.发明人认识到，β-咔啉抗肿瘤的细胞毒性本质是与肿瘤细胞DNA之间的嵌插.这种形式的扦插可造成细胞毒性.发明人曾经发现，β-咔啉可以插入肿瘤细胞DNA之间的双螺旋碱基之间.在进一步的研究中，发明人认识到，β-咔啉的抗肿瘤活性来自嵌插.发明人还认识到，在β-咔啉的1位引入二肽生成β-咔啉-3-羧酸苄酯及衍生物可增强β-咔啉与肿瘤细胞的作用，增强抗肿瘤活性.根据这些认识，发明人提出1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯，与发明人前期的发明1-(乙基-AA-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯相比，本发明的突出创造性在于，保留了β-咔啉与肿瘤细胞DNA之间的嵌插作用，在低剂量下显示高抗肿瘤活性，显示了良好的抑制肿瘤细胞增殖作用和抗肿瘤活性。
发明的内容
本发明的第一个内容是提供下式的1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯。
本发明的第二个内容是提供1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯的制备方法，该方法包括：
(1)将L-色氨酸苄酯在三氟醋酸的催化下与1，1，3，3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler缩合，得到l-(2，2-二甲氧乙基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
(2)将1-(2，2-二甲氧乙基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在四氢呋喃中，用高锰酸钾水溶液氧化得到1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉3-羧酸苄酯；
(3)在冰醋酸、浓盐酸、混合液中1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉-3-羧酸苄酯水解为1-乙醛基-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
(4)将1-乙醛基-β-咔啉-3-羧酸苄酯与HCl.Val-Tyr-OBzl偶联得到1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯。
本发明的第三个内容是评价1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯抑制肿瘤细胞增殖的作用。
本发明的第四个内容是评价1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯抑制S180肿瘤小鼠肿瘤生长的作用。
本发明的第五个内容是测定1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯与CT-DNA的嵌插作用。
本发明的第六个内容是测定1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯的纳米结构。
附图说明
图1化合物1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯的合成路线图.i)多聚磷酸，苯甲醇；ii)三氟醋酸，1，1，3，3-四甲氧基丙烷；iii)高锰酸钾，四氢呋喃，水；iv)溶浓盐酸，冰醋酸，水；v)N-甲基吗啉，无水硫酸镁，氰基硼氢化钠，Val-Tyr-OBzl。
图2化合物5与CT-DNA作用的粘度变化.DNA(100μM)，5的终浓度依次为10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μM。
图3化合物5与CT-DNA之间嵌插的紫外光谱.DNA(200μM)，5终浓度依次为2，10，20，30，40，50μM。
图4化合物5与CT-DNA之间嵌插的荧光光谱，5(20μM)的原始荧光光谱，每次加入20μL浓度为605μM的DNA。
图5化合物5与CT-DNA之间嵌插的圆二色散谱.DNA浓度为200μM，化合物5的终浓度依次为0，50，100，200μM。
图6化合物5在pH7.4环境中，浓度为6×10-7M浓度下的透射电镜照片。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一些列实施例.这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备1-(2，2-二甲氧乙基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯
先将5gL-色氨酸苄酯用饱和NaHCO3水溶液洗，用70mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，酯相用饱和氯化钠溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤至250mL的圆底烧瓶中，旋干得4g白色固体.在100mL的圆底烧瓶中，先将4mL1，1，3，3-四甲氧基丙烷溶于40mL二氯甲烷溶剂中，再加入4mL三氟醋酸，活化45min，在冰浴下，将上述4g白色固体加入到反应瓶中.反应52小时，TLC(PE/Actone＝4/1)显示反应完成，用饱和NaHCO3水溶液中和反应体系中的酸，然后用70mL二氯甲烷萃取，共萃取3次，再用饱和氯化钠溶液洗至中性，二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，滤液减压浓缩后加入硅胶拌样，减压浓缩至干后用硅胶湿法柱层析纯化，得到3.5g(51％)标题化合物，为黄色油状物.ESI-MS(m/e)395[M+H]+。
实施例2制备1-(2，2-二甲氧乙基)-β-咔啉3-羧酸苄酯
将5g(12.7mmol)1-(2，2-二甲氧乙基)-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯，与约150mL的THF加入到250mL的茄瓶中，冰浴搅拌，分批加入高锰酸钾5g(31.6mmol)的水溶液，室温反应5小时，TLC(PE/Actone＝4/1)显示反应完成，过滤，并加入四氢呋喃冲洗滤饼，滤液减压浓缩除去THF，再将残余水相用70mL二氯甲烷提取，共提取3次，合并酯相，用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压回收溶剂，滤液减压浓缩后加入硅胶拌样，减压浓缩至干后用硅胶湿法柱层析纯化得产物，采用石油醚-丙酮体系的展开剂5∶1收集产物.再采用石油醚-丙酮或丙酮-乙醚重结晶的方法得到纯品3g(60％)松散白色固体.ESI/MS(m/e)391[M+H]+。
实施例3制备1-乙醛基-β-咔啉3-羧酸苄酯
先加入冰醋酸72mL使344mg(1mmol)原料完全溶解，再依次加入9mL浓盐酸和9mL水.TLC监测原料斑点消失后处理反应，加入大量冰水混合物搅拌，大量固体析出后过滤，并用90mL冰水冲洗滤饼.收集滤饼，充分干燥，以备下一步反应使用。
实施例4制备1-(乙基-Val-Tyr-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯(5)
冰浴下，往488mg(1.2mmol)HCl·Val-Tyr-OBzl与20ml无水四氢呋喃的溶液中滴加N-甲基吗啉调节溶液pH值至8，往溶液中加344mg(1mmol)1-乙醛基-β-咔啉3-羧酸苄酯20mL二氯甲烷的悬浮液，搅拌10分钟后加入200mg无水硫酸镁搅拌15分钟.往反应混合物中加63mg(1mmol)氰基硼氢化钠，室温搅拌14h，TLC(CHCl3/MeOH＝24/1)显示反应完成.反应混合物过滤，滤液减压浓缩，剩余物加入饱和NaHCO3水溶液溶解，得到的溶液用50ml乙酸乙酯液萃取，共萃取3次.乙酸乙酯层用饱和氯化钠溶液洗至中性，收集的乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到的糖浆状物先后经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝50/1)及制备薄层层析(二氯甲烷/甲醇＝22/1)纯化，得到121mg(17％)标题化合物，为淡黄色油状物.ESI-MS(m/e)699.9[M+H]+；IR(KBr)：3329.14，3066.82，3028.24，2960.73，2933.73，2881.65，1830.45，1797.66，1743.65，1724.36，1654.92，1680.00，1597.06，1498.69，1348.24，1301.95，1247.94，1213.23，1174.65，1155.36，1134.14，1105.21，1078.21，1028.06，1012.63，966.34，950.91，896.90，788.89，746.45，738.74，698.23，680.87cm-1；1HNMR(300MHz，CDCl3)δ/ppm：10.96(brs，1H)，8.76(s，1H)，8.15(d，J＝9.0Hz，1H)，7.54～7.42(m，4H)，7.42～7.30(m，11H)，6.95(m，1H)，6.88(d，J＝9.0Hz，2H)，6.67(d，J＝9.0Hz，2H)，5.36(s，2H)，5.27(d，J＝12.0Hz，1H)，5.17(d，J＝12.0Hz，1H)，4.99(m，1H)，3.18(m，1H)，3.09(m，1H)，3.00(m，1H)，2.82(m，1H)，2.68(d，J＝6.0Hz，1H)，2.55(m，1H)，2.43(m，1H)，1.94(m，1H)，0.96(d，J＝12.0Hz，3H)，0.87(d，J＝12.0Hz，3H)。
实验例1测定化合物5对肿瘤细胞增殖的抑制作用
1)化合物5用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。
2)实验用的肿瘤细胞为HL-60(人早幼粒细胞白血病细胞)、A549(肺癌细胞)、Be17402(肝癌细胞)、SH-sy5y(人神经母细胞瘤)、S180(小鼠腹水瘤细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)。
3)实验方法HL-60，MCF-7，Bel-7402，A549和S180细胞选用RPMI-1640培养基；SH-sy5y细胞选用DMEM培养基.培养基中均含10％经灭活的胎牛血清和1×105U/L青霉素和100mg/L链霉素。
贴壁细胞MCF-7，Bel-7402，A549，SH-sy5y和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以4×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养6小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒.继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养4小时.小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。
悬浮细胞HL60的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物5与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养48小时.每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO2的细胞孵育箱中培养4小时.3000rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μLDMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。
按下式求出各个浓度下化合物5抑制肿瘤细胞增殖的活性：
细胞增殖(％)＝(化合物5组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC50(半数有效抑制浓度)值。
4)结果见表1和表2.结果表明，在体外细胞毒试验中，化合物5对HL-60，MCF-7，Bel-7402，A549和S180和SH-sy5y肿瘤细胞增殖都显示明确的抑制作用。
表1化合物5抑制肿瘤细胞增殖的IC50(均值±SDμM)
表2化合物5抑制肿瘤细胞增殖的IC50(均值±SDμM)
实验例2评价化合物5的体内抗肿瘤活性
1)本发明的化合物5用0.5％羧甲基纤维素钠配制成混悬液，剂量为1μmol/kg.阳性对照阿霉素配制成生理盐水溶液，剂量为2μmol/kg.阳性对照阿糖胞苷配制成生理盐水溶液，剂量为8.2μmol/kg.阴性为0.5％羧甲基纤维素钠水溶液。
2)化合物5灌胃给药，剂量为1μmol/kg，连续给药7天，共给药7次.阿霉素腹腔注射，剂量为2μmol/kg，连续给药7天，共给药7次.阿糖胞苷腹腔注射，剂量为8.2μmol/kg，连续7天给药7天，共给药7次.0.5％羧甲基纤维素钠水溶液灌胃给药，剂量为0.2mL/20g，连续7天，共给药7次。
3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。
4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。
5)动物模型与治疗无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。
细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数＝细胞数/mL
细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％
将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成1.5×107个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠.肿瘤接种24h后，各组小鼠每日按照上面的剂量和给药条件治疗.实验进行至第8天，称小鼠体重，乙醚麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物5组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％.实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以均值±SDg表示.结果见表3。
由表3可以看出，在1μmol/kg的口服剂量下，化合物5治疗组小鼠的瘤重明显小于0.5％羧甲基纤维素钠水溶液治疗组小鼠的瘤重，说明它具有有效的抗肿瘤活性.它的有效剂量(1μmol/kg)比发明人发表的1-(乙基-AA-OBzl)-β-咔啉-3-羧酸苄酯的有效剂量(8.9μmol/kg)低8.9倍。
表3化合物5对荷S180小鼠肿瘤重量的影响(均值±SDg)
n＝12；a)与0.5％羧甲基纤维素钠水溶液组比P＜0.01。
实验例3粘度法测定化合物5与CT-DNA的嵌插作用
将Ubbeholde粘度计置于37℃水浴中，测试PBS的粘度(平行三次)，作为T0，再测定CT-DNA(100μM)溶液的粘度，样品量为10mL.取10μL化合物5(浓度为10mM)，即样品中化合物5的终浓度为10μM.吹打混匀测定三次取均值，以后依次累加l0μL至样品液中，即样品中化合物5的终浓度依次为20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，100μM.η＝(t-t0)/t0，其中t0为PBS经过毛细管所需的时间，t为含有药物的CT-DNA溶液经过毛细管所需的时间.以(η/η0)1/3对结合比率C5/CCT-DNA作图.CT-DNA的粘度变化见图2.结果表明随着化合物5浓度增加，CT-DNA溶液的粘度随之增大，且增大的趋势逐渐减小，说明化合物5与CT-DNA发生扦插。
实验例4光谱法测定化合物5与CT-DNA的嵌插作用
为了证实5与肿瘤细胞DNA之间的嵌插作用，选择CT-DNA为模型，用UV光谱、荧光光谱和圆二色散谱描述5与CT-DNA的嵌插作用。
1)用UV谱描述5与CT-DNA的嵌插作用
采用固定DNA浓度，向DNA溶液中累加化合物5的方法检测其紫外光谱变化趋势.DNA浓度200μM，测其紫外光谱，波长为240nm～330nm，将化合物5依次累加至DNA溶液中，使其终浓度依次为2，10，20，30，40，50μM.共计得出7条波长为240nm～330nm的紫外光谱图.经化合物5作用后的DNA溶液最大吸收峰强度明显下降，且最大吸收峰发生轻微红移，见图3，这符合Long，EC等提出的利用光谱学方法确证小分子与DNA发生嵌插作用的现象，且此光谱图呈现出一定的浓度依赖关系.减色效应是DNA构象变化的结果，说明化合物5与DNA之间存在嵌插作用。
2)用荧光光谱描述5与CT-DNA的嵌插作用
移取2mL浓度为20μM的化合物5置于石英比色杯中，固定药物浓度测定荧光光谱.逐次向比色杯中加入20μL浓度为605μM的CT-DNA溶液(每次加入20μL，故认为保持测试体系体积不变，即体系浓度保持恒定)，测定荧光猝灭光谱(CT-DNA的终浓度分别为0，6，12，18，24，30μM).荧光发射和激发狭缝分别为5nm，2.5nm，固定激发波长270nm，扫描速度为1500nm/min，发射光谱范围320～500nm，37℃条件下测定.得到的荧光光谱图见图4。结果表明，化合物5为荧光物质，随着不断加入CT-DNA，荧光强度逐渐降低，可见，DNA对化合物5有荧光猝灭作用，说明化合物5与CT-DNA发生了扦插。
3)用圆二色散谱描述5与CT-DNA的嵌插作用
DNA浓度为200μM，化合物5的终浓度依次为0，50，100，200μM，配制成1mL，37℃孵育3h，测定其圆二色散(CD)光谱，实验中采用0.1cm的样品池加入600μL样品即可，结果见图5.参数如下：扫描速度500nm·min-1s，分辨率0.2nm，扫描范围200～350nm，灵敏度50mdeg，响应时间0.5s，频带宽度15nm，堆积度5。
经化合物5作用后的DNA的碱基堆叠作用及双螺旋构象有所改变，说明化合物5与DNA之间存在嵌插作用。
实验例5测定化合物5的透射电镜照片
将化合物5按照6×10-7M的浓度配置化合物的pH7.4PBS溶液，均匀的铺在铜网上，在透射电镜(TEM，JEM-1230，JEOL)下观察化合物的自组装性质，得到如图6的照片。结果表明，化合物5在pH7.4PBS溶液中可形成纳米颗粒，纳米粒径在36-143nm之间。