技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及堪萨斯分枝杆菌的快速检测，具体为一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
堪萨斯分枝杆菌是一种慢生长非结核分枝杆菌，属于Runyon分类法中的Ⅰ群，即光产色群。直接涂片显微镜观察见该菌比较粗大，亦可见颗粒状杆菌形态和菌体栅栏样排列。堪萨斯分枝杆菌在合适的培养基(如米氏培养基、罗氏培养基)上生长大约6周后，可形成粗糙或光滑的中等大小的黄色菌落，随着培养时间延长，菌落颜色慢慢转变为红橙色。堪萨斯分枝杆菌可存在于环境中的水和土壤中，最常见的来源是自来水，一般不会感染人类引起疾病和造成人间传播。但在特殊情况下，如有基础性肺病或患者免疫力低下时，该菌可引起肺部疾病、肺外疾病甚至全身播散性感染。
堪萨斯分枝杆菌感染常见的临床症状包括咳嗽、胸痛、咯血和呼吸困难等，常见的影像学改变为单侧的上肺区段阴影，这些表现与肺结核的临床症状和影像学改变都比较类似，故此类诊断依据在堪萨斯分枝杆菌感染诊断方面都缺乏特异性。在实验室诊断方面，通过培养和生化鉴定可鉴别堪萨斯分枝杆菌与其它分枝杆菌(包括结核分枝杆菌复合物)，但这种传统鉴别方法操作繁琐和耗时较长，而且结果的重复性和稳定性不太理想；γ干扰素释放试验被认为是鉴别结核病和非结核分枝杆菌病的有利武器，但由于堪萨斯分枝杆菌与结核分枝杆菌一样能产生CFP-10和EAST-6，因此γ干扰素释放试验无法鉴别堪萨斯分枝杆菌病和结核病；分子生物学方法能够快速地鉴定堪萨斯分枝杆菌，常用方法包括普通PCR、实时PCR和DNA探针杂交等，但目前这些方法都需要使用PCR仪等特殊仪器，而且有些方法使用的扩增靶位也缺乏很好的特异性，这些不足导致临床对研发应用堪萨斯分枝杆菌检测新方法的需求更为迫切。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是本世纪初问世的一种新的核酸扩增技术，该技术进行核酸扩增时无需变换温度，在等温条件下即可完成整个扩增反应，而且最终的结果判断可通过肉眼观察颜色变化即可实现，因此LAMP不需要能够精确控温和进行荧光监测的PCR仪等特殊设备。因为LAMP能够弥补PCR法某些方面的不足，所以该技术在结核分枝杆菌临床检测方面已得到了广泛应用，但目前在堪萨斯分枝杆菌检测方面LAMP尚未得到应用。
发明内容
有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒。
本发明所解决的技术问题还在于提供一种利用上述堪萨斯分枝杆菌LAMP检测试剂盒检测堪萨斯分枝杆菌的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组，针对堪萨斯分枝杆菌特有的ECHT基因编码序列设计并优化，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：
外引物F3：5’-GACTGTTGGCGAGTTGGT-3’
外引物B3：5’-GTCCTGGAACGTCTGCTC-3’
内引物FIP：5’-GGTGTGGCACATTGCGACAGATATAACTCGAACAGCAC-3’
内引物BIP：5’-CGGATCAGCGGTATGACGGCCGGCTGCCCGATTAGAT-3’
环引物LF：5’-GTTCTGCGACGGCGATTC-3’
环引物LB：5’-GGGATGCGTTGTCCACCA-3’。
优选地，所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB在反应体系中的摩尔比为1:1:4:4:2:2。
另一方面，本发明还公开了一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒中含有如权利要求1或2所述的堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组。
优选地，其特征在于，还包括以下成分的部分或者全部：(1)DNA聚合酶；(2)LAMP反应液；(2)荧光染料或显色剂；(3)阳性对照和阴性对照。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；LAMP反应液包括dNTP、反应缓冲液、MgSO4和甜菜碱。
优选地，阳性对照为含有堪萨斯分枝杆菌ECHT基因片段的载体克隆，阴性对照为不含堪萨斯分枝杆菌ECHT基因片段的水或其他溶剂。
优选地，所述荧光染料为SYBR green，所述显色剂为羟基萘酚蓝。
在本发明的优选方案中，本发明的堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒，包括以下成分：
(1)引物组：包含权利要求1所述的LAMP检测引物组，外引物、内引物和环引物的浓度均为10μM；
(2)反应液：包括dNTP、反应缓冲液、MgSO4和甜菜碱，使用时需等倍稀释；
(3)Bst DNA聚合酶：浓度为0.16U/μL；
(4)荧光染料或显色剂：荧光染料为SYBR green，显色剂为羟基萘酚蓝(HNB)；
(5)密封液：为封闭用石蜡油；
(6)去核酸水：用于补充反应体积。
再有，本发明还公开了一种利用上述堪萨斯分枝杆菌LAMP检测试剂盒检测堪萨斯分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)待检样品DNA的提取：采用煮沸裂解法提取样品DNA。(a)根据痰标本粘稠程度的差异，适当加入1～2倍体积的消化液，然后漩涡振荡30s，室温条件下放置15min。支气管冲洗液标本的处理同痰标本一样。胸腔积液标本5000rpm离心15min后适当加入1～2倍体积体积的消化液，余下处理同痰标本。拭子标本先放入1ml生理盐水中，反复旋转后取出拭子，然后5000rpm离心15min，加入1ml消化液，余下处理同痰标本。(b)吸取1ml消化后的液体至1.5ml微量离心管中，13000rpm离心10min。(c)弃去上清液后加入1ml生理盐水，13000g离心10min。(d)弃掉上清液后重复步骤(c)。离心后去除上清液，加入40μl DNA提取液，振荡混匀后2000rpm离心5s，接着37℃温浴30min，然后100℃加热10min，冷却后13000rpm离心10min。(e)离心后将包含DNA模板的上清液转移到另一个去核酸的1.5ml微量离心管中，置-20℃保存备用；
(2)等温扩增反应：取2μL步骤(1)中获取的待检样品DNA模板或者阴、阳性对照加入LAMP反应体系中混匀，65℃等温反应50min进行扩增，然后80℃等温反应10min终止反应；所述LAMP反应体系中包含权利要求1或2中所述的堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组；
(3)结果判断：通过分析荧光定量PCR仪的实时荧光检测数据来进行判断，或通过加入显色剂观察PCR管内液体颜色的变化来判断结果。
优选地，所述LAMP反应体系为，20μL反应体系中含有：
外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB浓度均为10μM，加入量分别为0.5μL、0.5μL、2μL、2μL、1μL、1μL；
0.16U/μL Bst DNA聚合酶的加入量为0.4μL；
荧光染料或显色剂0.4μL；
反应液10μL，反应液中包含4mM dNTP、12mM MgSO4、1.6mM甜菜碱、40mM Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH4)SO4、0.1％TritonX-100；
2μL步骤(1)中提取的待检样品DNA；
用去离子水补齐到20μL。
作为影响检测效果的重要指标，检测目的片段的选择至关重要。在核算检测中，考虑到堪萨斯分枝杆菌的长度，采用全系列检测并不现实，耗时费力且可能对检测结果，本发明通过查阅文献和搜索Genebank数据库寻找堪萨斯分枝杆菌特有的核酸序列，并通过与其它靶基因检测进行比较来验证该核酸序列的特异性，最终确定的堪萨斯分枝杆菌特有核酸序列为ECHT基因序列作为扩增的目的片段，结合上述分析及本发明实施例中的技术效果可知，本发明至少包含如下有益效果：
(1)操作简便：DNA提取步骤简单有效，模板可直接用于后续扩增反应，等温扩增可选择或无需PCR仪等特殊设备；
(2)扩增快速：等温扩增只需60min，扩增完成后结果可直接判读，整个检测过程所需时间在2h以内。
(3)特异性高：检测引物组包括六条特异性引物，只能有效扩增堪萨斯分枝杆菌，不能有效扩增结核分枝杆菌复合物、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌等其它病原体。
(4)灵敏性高：能检测出的最低值为100个拷贝。
(5)避免污染：荧光染料或显色剂在反应前加入，无需反应后开盖加入，能有效防止扩增产物的扩散和污染。
附图说明
图1是特异性分析荧光曲线图。S型曲线为堪萨斯分枝杆菌的扩增曲线。
图2是特异性分析肉眼观察图。上排PCR管从左至右分别对应堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌，下排PCR管从左至右分别对应胞内分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌。
图3是灵敏性分析荧光曲线图。从左至右三条S型曲线分别为106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL浓度模板的扩增曲线。
图4是灵敏性分析肉眼观察图。从左至右PCR反应管扩增的模板浓度分别为：106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL和1copies/μL。
图5是临床标本检测荧光曲线图。共检测9份临床标本，其中1份标本堪萨斯分枝杆菌检测阳性。左边的S型曲线为阳性质控扩增曲线。
图6是临床标本检测肉眼观察图。共检测9份临床标本，其中1份标本堪萨斯分枝杆菌检测阳性。下排PCR管第1管(从左至右)为临床标本扩增阳性管，下排PCR管第4、5管(从左至右)分别为阳性质控和阴性质控扩增管。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但所描述的实例只是本发明的部分实施例，而不是全部实施例，故不应该理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，在无创造性劳动前提下对本发明方法、步骤或条件的修改或替换，都属于本发明保护的范围。
实施例1：引物设计
首先通过查阅文献寻找堪萨斯分枝杆菌特有的基因序列，接着在NCBI的Genebank数据库中搜索该基因序列并验证其特异性，然后应用专门的LAMP引物设计软件以该序列为靶基因进行引物设计，最后在primer-blast上对设计好的引物进行分析和优化。最终确定的引物序列分别见SEQ ID No:1至SEQ ID No:6。
验证堪萨斯分枝杆菌特有基因序列的比较试验包括以下扩增引物：
hsp65F：5’-CAGGAAGCAGTGCTGGAAGA-3’SEQ ID No:7；
hsp65R：5’-GTGCTCAAAGCCTCACCCTC-3’SEQ ID No:8；
ECHTF：5’-AAACGGTGTGTCGCAATGTG-3’SEQ ID No:9；
ECHTR：5’-GGATATGGCGGTCCCTTCTG-3’SEQ ID No:10；
应用上述两对引物分别检测堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌和龟分枝杆菌等分枝杆菌临床株的两种靶基因(即hsp65和ECHT基因)，比较两种靶基因扩增阳性结果并分析其正确率，正确率越高表示该靶基因扩增检测堪萨斯分枝杆菌的特异性越高，也表明该靶基因更适合被用于临床标本中堪萨斯分枝杆菌的检测。
实施例2：建立堪萨斯分枝杆菌LAMP检测反应体系
设置不同等温扩增反应温度(60℃、63℃、65℃)，不同引物浓度(5μM、10μM、15μM)和不同加入量Bst DNA聚合酶(0.2μL、0.4μL、0.6μL)，比较同一模板在各因素不同条件下扩增的Ct值，以能够获得最小Ct值的引物浓度、Bst DNA聚合酶加入量和扩增反应温度作为本发明的最终反应参数。
通过反复试验确定了最为优选的堪萨斯分枝杆菌LAMP检测反应体系和反应条件，即等温扩增温度为65℃；在20μL反应体系中，外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB浓度均为10μM，加入量分别为0.5μL、0.5μL、2μL、2μL、1μL、1μL，在反应体系中的摩尔比为1:1:4:4:2:2；0.16U/μL Bst DNA聚合酶的加入量为0.4μL。具体加入量如下表：
组分名称 加入量(μL) 组分名称 加入量(μL) 反应液 10 Bst DNA聚合酶 0.4 外引物 1 荧光染料/显色剂 0.4 内引物 4 样品DNA 2 环引物 2 加水补齐至 20
反应液中包含4mM dNTP、12mM MgSO4、1.6mM甜菜碱、40mM Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH4)SO4、0.1％TritonX-100。
实施例3：分析特异性评价
选取常见分枝杆菌和常见普通细菌作为检测对象来评价分析特异性，具体包括堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等10种微生物。结果显示(附图1、2)，本发明对上述堪萨斯分枝杆菌以外的其它微生物均未能检出，因此本发明具有很好的分析特异性。
实施例4：分析灵敏性评价
应用已连接靶基因的质粒制备106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL和1copies/μL浓度的模板，每种浓度均取1μL进行LAMP检测，分别通过肉眼观察颜色变化和荧光PCR仪监测分析荧光进行结果判读，以荧光分析判读方法的最低检测量作为检测下限。结果显示(如图3、4)，本发明检测解脲脲原体的下限为100个拷贝，因此本发明具有很好的分析灵敏性。
实施例5：临床标本检测
1、试剂准备
(1)引物、反应液、Bst DNA聚合酶、荧光染料、显色剂、去核酸水、石蜡油、阴性对照、阳性对照，取相应量的各种成分混匀(具体加入量见实施例2)，瞬时离心后4℃下保存备用。
2、样本制备
(1)根据痰标本粘稠程度的差异，适当加入1～2倍体积的消化液，然后漩涡振荡30s，室温条件下放置15min。支气管冲洗液标本的处理同痰标本一样。胸腔积液标本5000rpm离心15min后适当加入1～2倍体积体积的消化液，余下处理同痰标本。拭子标本先放入1mL生理盐水中，反复旋转后取出拭子，然后5000rpm离心15min，加入1mL消化液，余下处理同痰标本。
(2)吸取1mL消化后的液体至1.5mL微量离心管中，13000rpm离心10min。
(3)弃去上清液后加入1mL生理盐水，13000g离心10min。重复此步骤一次。
(4)离心后去除上清液，加入40μL DNA提取液，振荡混匀后2000rpm离心5s，接着37℃温浴30min，然后100℃加热10min，冷却后13000rpm离心10min。
(5)离心后将包含DNA模板的上清液转移到另一个去核酸的1.5mL微量离心管中，若不立即扩增则置-20℃保存备用。
3、样本加入
取2μL模板加入已有各种反应成分的PCR管中并混匀，标记好后瞬时离心。采用荧光分析法时在反应体系中加入荧光染料，采用肉眼观察法时则在反应体系中加入显色剂HNB。
4、等温扩增
(1)荧光分析法：将PCR反应管放入荧光定量PCR仪的样本架上，在分析软件中根据放置顺序编制样本名称和阴阳性对照；设置扩增条件为：65℃反应50min、90℃反应10min、25℃冷却1min，荧光检测通道选择FAM通道；应用荧光定量PCR仪监测和分析荧光信号，样本扩增曲线呈S型，且信号值高于阈值才判定为阳性，无扩增曲线或扩增曲线平直均判定为阴性，只有在阴阳性对照结果符合的前提下才能进行样本结果判读(如图5)；
(2)肉眼观察法：将PCR反应管放入干浴锅中65℃反应50min，然后升至90℃反应10min，冷却后瞬时离心；肉眼观察结果，深蓝色为扩增阴性，浅蓝色为扩增阳性，只有阴阳性对照结果符合才能判读样本扩增结果(如图6)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 深圳市第三人民医院(深圳市肝病研究所)
<120> 堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法
<130> 2017
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
GACTGTTGGCGAGTTGGT 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
GTCCTGGAACGTCTGCTC 18
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
GGTGTGGCACATTGCGACAGATATAACTCGAACAG CAC 38
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
CGGATCAGCGGTATGACGGCCGGCTGCCCGATTAGAT 37
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
GTTCTGCGACGGCGATTC 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
GGGATGCGTTGTCCACCA 18