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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611270331.2 (22)申请日 2016.12.30 (71)申请人 四川省农业科学院蚕业研究所 地址 637007 四川省南充市合众街52号 申请人 四川省南充市桃园生物化学研究开 发有限公司 (72)发明人 青学刚李文学陈宝瑞肖金树 刘刚张友洪周安莲肖文福 黄盖群刘俊凤尹红殷浩 王晓芬陈义安王皓 (74)专利代理机构 成都市集智汇华知识产权代 理事务所(普通合伙) 51237 代理人 李华温黎娟 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C1。
2、2R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种球孢白僵菌的培养方法 (57)摘要 本发明公开一种球孢白僵菌的培养方法， 包 括(1)一级斜面培养： 将球孢白僵菌菌体接种于 一级斜面培养基中， 在24-25培养5-6天； (2)二 级液体培养： 将步骤(1)培养后得到的菌种接种 至种子罐中， 在24-25培养24-28h， (3)三级液 体扩大培养： 将步骤(2)培养后得到的菌种接种 至发酵罐中， 在25-28培养28-32h； (4)四级固 体培养： 将步骤(3)扩大培养后的菌种接种到固 体培养基中， 在22-25下培养5-6d。 通过每个阶 段中培养基组分的筛选和配比， 同时配合。
3、培养的 温度和湿度条件， 可以缩短培养周期， 提高球孢 白僵菌分生孢子的质量和产量， 提高分生孢子的 活性。 权利要求书2页 说明书7页 CN 106497805 A 2017.03.15 CN 106497805 A 1.一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 所述培养方法包括以下步骤： (1)一级斜面培养： 将球孢白僵菌菌体接种于一级斜面培养基中， 在24-25培养5-6 天； (2)二级液体培养： 将步骤(1)培养后得到的菌种接种至种子罐中， 在24-25培养24- 28h， 所述种子罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充10-20蛋 白胨、 5-10尿素、 。
4、5-20蔗糖、 10-15麦麸、 0.1-0.5磷酸二氢钾、 0.01-0.05硫酸镁、 0.01-0.05维生素B、 0.01-0.05维生素C、 0.01-0.02硫酸锌、 0.01-0.02硫酸铜、 0.05-0.1氯化铁、 0.05-0.1氯化钙； (3)三级液体扩大培养： 将步骤(2)培养后得到的菌种接种至发酵罐中， 在25-28培养 28-32h， 所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充10- 20蛋白胨、 10-20蔗糖、 10-20黄豆粉、 0.1-0.5磷酸二氢钾、 0.05-0.1硫酸镁、 0.02-0.05维生素B、 0.01-0.0。
5、2维生素C、 0.05-0.15氯化钙、 0.2-1.0海藻酸钠； (4)四级固体培养： 将步骤(3)扩大培养后的菌种接种到固体培养基中， 在22-25下培 养5-6d， 所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸20-30份、 蚕蛹粉10-20份、 黄豆粉 10-20份、 维生素B 1-3份、 维生素C1-2份、 蔗糖2-10份、 米糠20-40份。 2.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(1)所述斜面 培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉20-30份、 蛋白胨1-2份、 乳糖5-10份、 蔗糖1-5 份、 磷酸二氢钾0.05-0.1份、 硫酸镁0.0。
6、5-0.1份、 琼脂1-2份。 3.根据权利要求2所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(1)所述斜面 培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉25份、 蛋白胨1份、 乳糖8份、 蔗糖3份、 磷酸二 氢钾0.08份、 硫酸镁0.06份、 琼脂2份。 4.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(2)所述种子 罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充18蛋白胨、 7尿素、 15蔗糖、 13麦麸、 0.3磷酸二氢钾、 0.02硫酸镁、 0.04维生素B、 0.02维生素C、 0.015硫酸锌、 0.018硫酸铜、 0.08氯化铁、 。
7、0.07氯化钙。 5.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(3)所述发酵 罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充15蛋白胨、 18蔗 糖、 17黄豆粉、 0.3磷酸二氢钾、 0.07硫酸镁、 0.04维生素B、 0.03维生素C、 0.10 氯化钙、 0.8海藻酸钠。 6.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(2)和步骤(3) 中， 所述维生素B为维生素B1、 维生素B2、 维生素B3、 维生素B6中的至少一种。 7.根据权利要求6所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(2)和步骤(3) 中。
8、， 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生 素B6的重量比为1:(1-2):(1-2)。 8.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(1)所述斜面 培养基在接种前先调节pH值至6.5-6.8， 再在压力为100-110kPa下保压灭菌40-60min。 9.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(4)中四级固 体培养的湿度为95-98。 10.根据权利要求1所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 其特征在于： 步骤(4)中固体培 权利要求书 1/2 页 2 CN 106497805 。
9、A 2 养基的厚度为5-6cm， 液固接种的比例为1:(1.2-1.3)。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106497805 A 3 一种球孢白僵菌的培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种球孢白僵菌的培养方法。 背景技术 0002 白僵菌是一种子囊菌类的虫生真菌， 主要种类包括球孢白僵菌和布氏白僵菌等， 常通过无性繁殖生成分生孢子， 菌丝有横隔有分枝。 白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆 虫、 螨类的虫体内大量繁殖， 同时产生白僵素(非核糖体多肽类毒素)、 卵孢霉素(苯醌类毒 素)和草酸钙结晶， 这些物质可引起昆虫中毒， 打乱新陈代谢以致死亡。 其中， 球孢白僵菌为 子囊菌类的真。
10、菌， 可工业化培养生产， 人们利用其产生的分子孢子可加工成微生物杀虫剂； 也可以通过球孢白僵菌侵染家蚕得到中药白僵蚕。 0003 现有的球孢白僵菌培养基的成分比较单一， 对促进球孢白僵菌的生长效果不佳， 针对球孢白僵菌的生长过程进行的设计较少， 在培养过程中易受杂菌污染， 因此， 得到的球 孢白僵菌分生孢子的质量不稳定， 毒力较弱， 繁殖周期较长。 发明内容 0004 有鉴于此， 本申请提供一种球孢白僵菌的培养方法， 通过每个阶段中培养基组分 的筛选和配比， 同时配合培养的温度和湿度条件， 可以缩短培养周期， 提高球孢白僵菌分生 孢子的质量和产量， 提高分生孢子的活性。 0005 为解决以上技。
11、术问题， 本发明提供的技术方案是一种球孢白僵菌的培养方法， 所 述培养方法包括以下步骤： 0006 (1)一级斜面培养： 将球孢白僵菌菌体接种于一级斜面培养基中， 在24-25培养 5-6天； 0007 (2)二级液体培养： 将步骤(1)培养后得到的菌种接种至种子罐中， 在24-25培养 24-28h， 所述种子罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充10-20 蛋白胨、 5-10尿素、 5-20蔗糖、 10-15麦麸、 0.1-0.5磷酸二氢钾、 0.01-0.05硫酸 镁、 0.01-0.05维生素B、 0.01-0.05维生素C、 0.01-0.02硫酸锌、 0.。
12、01-0.02硫酸铜、 0.05-0.1氯化铁、 0.05-0.1氯化钙； 0008 (3)三级液体扩大培养： 将步骤(2)培养后得到的菌种接种至发酵罐中， 在25-28 培养28-32h， 所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补 充10-20蛋白胨、 10-20蔗糖、 10-20黄豆粉、 0.1-0.5磷酸二氢钾、 0.05-0.1硫酸 镁、 0.02-0.05维生素B、 0.01-0.02维生素C、 0.05-0.15氯化钙、 0.2-1.0海藻酸钠； 0009 (4)四级固体培养： 将步骤(3)扩大培养后的菌种接种到固体培养基中， 在22-25 下培养。
13、5-6d， 所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸20-30份、 蚕蛹粉10-20份、 黄 豆粉10-20份、 维生素B 1-3份、 维生素C1-2份、 蔗糖2-10份、 米糠20-40份。 0010 优选的， 步骤(1)所述斜面培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉20-30份、 蛋白胨1-2份、 乳糖5-10份、 蔗糖1-5份、 磷酸二氢钾0.05-0.1份、 硫酸镁0.05-0.1份、 琼脂1- 说明书 1/7 页 4 CN 106497805 A 4 2份。 0011 更为优选的， 步骤(1)所述斜面培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉25 份、 蛋白胨1份、 乳糖8份。
14、、 蔗糖3份、 磷酸二氢钾0.08份、 硫酸镁0.06份、 琼脂2份。 0012 优选的， 步骤(2)所述种子罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培 养基， 补充18蛋白胨、 7尿素、 15蔗糖、 13麦麸、 0.3磷酸二氢钾、 0.02硫酸镁、 0.04维生素B、 0.02维生素C、 0.015硫酸锌、 0.018硫酸铜、 0.08氯化铁、 0.07氯 化钙。 0013 优选的， 步骤(3)所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充15蛋白胨、 18蔗糖、 17黄豆粉、 0.3磷酸二氢钾、 0.07硫酸镁、 0.04维生素B、 0.03维生素C。
15、、 0.10氯化钙、 0.8海藻酸钠。 0014 优选的， 步骤(2)和步骤(3)中， 所述维生素B为维生素B1、 维生素B2、 维生素B3、 维 生素B6中的至少一种。 0015 更为优选的， 步骤(2)和步骤(3)中， 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6 的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量比为1:(1-2):(1-2)。 0016 更为优选的， 步骤(2)和步骤(3)中， 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6 的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量比为1:1.5:1.8。 0017 优选的， 步骤(1)所述斜。
16、面培养基在接种前先调节pH值至6.5-6.8， 再在压力为 100-110kPa下保压灭菌40-60min。 0018 优选的， 步骤(4)所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸25份、 蚕蛹粉15 份、 黄豆粉15份、 维生素B 2份、 维生素C2份、 蔗糖7份、 米糠30份。 0019 优选的， 步骤(4)中四级固体培养的湿度为95-98。 0020 优选的， 步骤(4)中固体培养基的厚度为5-6cm， 液固接种的比例为1:(1.2-1.3)。 0021 优选的， 步骤(4)四级固体培养至固体培养基上长满分生孢子后， 即可进行干燥处 理。 0022 所述的PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼。
17、脂培养基的简称， 即Potato Dextrose Agar Medium。 其做法是： 称取200g洗净去皮的马铃薯切成小块， 加水煮烂(煮沸2030min， 能被 玻璃棒戳破即可)， 用八层纱布过滤， 加热， 再根据实验需要加110g琼脂， 继续加热搅拌混 匀， 待琼脂溶解完后， 加入葡萄糖， 搅拌均匀， 稍冷却后再补足水分至1000毫升， 分装试管或 者锥形瓶， 加塞、 包扎， 115灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀， 冷却后即得。 0023 在本申请技术方案中， 所述的球孢白僵菌的培养包括了一级斜面培养、 二级液体 培养、 三级液体扩大培养、 四级固体培养的步骤， 通过一级斜面培养。
18、， 得到球孢白僵菌菌种， 控制斜面培养基的组分和配比， 并添加菌种生长所需元素钾和镁， 同时控制培养的温度在 24-25之间， 加快菌种的生长； 通过二级液体培养， 使菌种数量迅速提高， 其液体培养基的 组分包括了菌种生长所必须的碳源、 氮源， 还增加了磷酸二氢钾、 硫酸镁、 硫酸锌、 硫酸铜、 氯化铁、 氯化钙， 提供菌体生长所需元素， 同时还增加了维生素B和维生素C， 二者可以提高 菌体生长速度， 提高菌体数量， 以上复配可以大大提高菌种的生长速度， 提高菌种数量， 此 外， 维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的复配， 能够提高保证菌种活性， 并提高菌种 的生长速度； 经过三。
19、级液体扩大培养， 菌种继续生长， 数量增加， 同时菌种生成菌丝体， 其液 体扩大培养基的组分包括了菌种生长所必须的碳源、 氮源， 还增加了促进菌丝体生长磷酸 说明书 2/7 页 5 CN 106497805 A 5 二氢钾、 硫酸镁、 氯化钙， 同时还增加了维生素B和维生素C， 二者可以提高菌体以及菌丝体 生长速度， 维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的复配， 能够提高保证菌丝体活性， 此 外， 所述的液体扩大培养基中还添加了海藻酸钠， 能够提高液体的粘度， 有利于培养基组分 的悬浮， 提高培养基中组分的利用率， 同时通过其配比的调整， 使培养基粘度控制在适应范 围， 避免液体晃。
20、动时， 菌丝体随之晃动产生拉扯， 破坏菌丝体； 通过四级固体培养， 分生孢子 大量生成， 此时可以将其进行干燥， 得到所需的球孢白僵菌孢子粉， 在固体培养基中， 添加 了麦麸、 蚕蛹粉、 黄豆粉、 米糠、 蔗糖， 为菌丝体以及分生孢子提供碳源和氮源， 同时麦麸、 黄 豆粉、 米糠稀松的质地， 具有较好的保湿性和透气性， 提供湿润和透气的环境， 有利于菌丝 体的快速繁殖和产孢， 此外， 还加入了维生素B和维生素C， 能够加快菌丝体产孢的速度， 同 时与蚕蛹粉的复配可以提高分生孢子的活性。 0024 与现有技术相比， 本申请技术方案所述的球孢白僵菌的培养方法， 包括一级斜面 培养、 二级液体培养、。
21、 三级液体扩大培养、 四级固体培养， 通过每个阶段中培养基组分的筛 选和配比， 同时配合培养的温度和湿度条件， 可以缩短培养周期， 提高球孢白僵菌分生孢子 的质量和产量， 提高分生孢子的活性。 具体实施方式 0025 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案， 下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。 0026 实施例1 0027 本实施例所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 所述培养方法包括以下步骤： 0028 (1)一级斜面培养： 将斜面培养基调节pH值至6.8， 再在压力为105kPa下保压灭菌 50min， 冷却后， 将球孢白僵菌菌体接种于一级斜面培养基中， 在25培养5天。
22、， 所述斜面培 养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉25份、 蛋白胨1份、 乳糖8份、 蔗糖3份、 磷酸二氢 钾0.08份、 硫酸镁0.06份、 琼脂2份； 0029 (2)二级液体培养： 将步骤(1)培养后得到的菌种接种至种子罐中， 在25培养 26h， 所述种子罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充18蛋白 胨、 7尿素、 15蔗糖、 13麦麸、 0.3磷酸二氢钾、 0.02硫酸镁、 0.04维生素B、 0.02维生素C、 0.015硫酸锌、 0.018硫酸铜、 0.08氯化铁、 0.07氯化钙； 所述维生 素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物。
23、， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量 比为1:1.5:1.8； 0030 (3)三级液体扩大培养： 将步骤(2)培养后得到的菌种接种至发酵罐中， 在28培 养30h， 所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计包括： PDA培养基， 补充15 蛋白胨、 18蔗糖、 17黄豆粉、 0.3磷酸二氢钾、 0.07硫酸镁、 0.04维生素B、 0.03 维生素C、 0.10氯化钙、 0.8海藻酸钠； 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的 组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量比为1:1.5:1.8； 0031 (4)四级固体培养： 将步骤(3。
24、)扩大培养后的菌种接种到固体培养基中， 在24下 培养5d， 控制四级固体培养的湿度为96， 所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸 25份、 蚕蛹粉15份、 黄豆粉15份、 维生素B 2份、 维生素C2份、 蔗糖7份、 米糠30份； 其中， 固体 培养基的厚度为5.5cm， 液固接种的比例为1:1.2， 四级固体培养至固体培养基上长满分生 说明书 3/7 页 6 CN 106497805 A 6 孢子后， 即可进行干燥处理， 干燥处理后， 采用旋风分离集孢器进行孢子抽提， 得到球孢白 僵菌孢子粉。 0032 本实施例中， 采用上述培养方法得到的球孢白僵菌孢子粉， 其含孢量为8.8101。
25、0/ g， 孢子萌发率为96， 活孢率为98； 用松毛虫3龄幼虫进行孢子毒力的生物测定， 喷菌后 (孢子液0.1108/mL浓度， 温度为20-28， 湿度90以上)4天， 松毛虫出现死亡高峰， 7天 松毛虫死亡率达95。 0033 实施例2 0034 本实施例所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 除以下特征外， 其余均与实施例1相 同。 0035 所述培养方法中： 0036 (1)一级斜面培养： 所述斜面培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉20份、 蛋白胨1份、 乳糖5份、 蔗糖1份、 磷酸二氢钾0.05份、 硫酸镁0.05份、 琼脂1份； 0037 (2)二级液体培养： 所述种子罐中的液。
26、体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA 培养基， 补充10蛋白胨、 5尿素、 5蔗糖、 10麦麸、 0.1磷酸二氢钾、 0.01硫酸镁、 0.01维生素B、 0.01维生素C、 0.01硫酸锌、 0.01硫酸铜、 0.05氯化铁、 0.05氯化 钙； 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生 素B6的重量比为1:1:1； 0038 (3)三级液体扩大培养： 所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计 包括： PDA培养基， 补充10蛋白胨、 10蔗糖、 10黄豆粉、 0.1磷酸二氢钾、 0.05硫酸 镁、 0.02维生素B、。
27、 0.01维生素C、 0.05氯化钙、 0.2海藻酸钠； 所述维生素B为维生素 B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量比为1:1:1； 0039 (4)四级固体培养： 所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸20-30份、 蚕蛹 粉10份、 黄豆粉10份、 维生素B 1份、 维生素C1份、 蔗糖2份、 米糠20份； 其中， 固体培养基的厚 度为5.5cm， 液固接种的比例为1:1.2。 0040 本实施例中， 采用上述培养方法得到的球孢白僵菌孢子粉， 其含孢量为8.21010/ g， 孢子萌发率为95， 活孢率为98； 用松毛虫3龄幼虫。
28、进行孢子毒力的生物测定， 喷菌后 (孢子液0.1108/mL浓度， 温度为20-28， 湿度90以上)6天， 松毛虫出现死亡高峰， 8天 松毛虫死亡率达95。 0041 实施例3 0042 本实施例所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 除以下特征外， 其余均与实施例1相 同。 0043 所述培养方法中： 0044 (1)一级斜面培养： 所述斜面培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉30份、 蛋白胨2份、 乳糖10份、 蔗糖5份、 磷酸二氢钾0.1份、 硫酸镁0.1份、 琼脂2份； 0045 (2)二级液体培养： 所述种子罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA 培养基， 补充20蛋白。
29、胨、 10尿素、 20蔗糖、 15麦麸、 0.5磷酸二氢钾、 0.05硫酸 镁、 0.05维生素B、 0.05维生素C、 0.02硫酸锌、 0.02硫酸铜、 0.1氯化铁、 0.1氯 化钙； 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维 生素B6的重量比为1:2:2； 说明书 4/7 页 7 CN 106497805 A 7 0046 (3)三级液体扩大培养： 所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计 包括： PDA培养基， 补充20蛋白胨、 20蔗糖、 20黄豆粉、 0.5磷酸二氢钾、 0.1硫酸 镁、 0.05维生素B、 0.0。
30、2维生素C、 0.15氯化钙、 1.0海藻酸钠； 所述维生素B为维生素 B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量比为1:2:2； 0047 (4)四级固体培养： 所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸30份、 蚕蛹粉 20份、 黄豆粉20份、 维生素B3份、 维生素C2份、 蔗糖10份、 米糠40份； 其中， 固体培养基的厚度 为5.5cm， 液固接种的比例为1:1.3。 0048 本实施例中， 采用上述培养方法得到的球孢白僵菌孢子粉， 其含孢量为8.81010/ g， 孢子萌发率为97， 活孢率为98； 用松毛虫3龄幼虫进行孢子毒力的。
31、生物测定， 喷菌后 (孢子液0.1108/mL浓度， 温度为20-28， 湿度90以上)4天， 松毛虫出现死亡高峰， 8天 松毛虫死亡率达95。 0049 实施例4 0050 本实施例所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 除以下特征外， 其余均与实施例1相 同。 0051 所述培养方法中： 0052 (1)一级斜面培养： 所述斜面培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉20份、 蛋白胨2份、 乳糖5份、 蔗糖5份、 磷酸二氢钾0.05份、 硫酸镁0.1份、 琼脂1份； 0053 (2)二级液体培养： 所述种子罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA 培养基， 补充20蛋白胨、 5尿素、。
32、 20蔗糖、 10麦麸、 0.5磷酸二氢钾、 0.01硫酸镁、 0.05维生素B、 0.01维生素C、 0.02硫酸锌、 0.01硫酸铜、 0.1氯化铁、 0.05氯化 钙； 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生 素B6的重量比为1:1:2； 0054 (3)三级液体扩大培养： 所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计 包括： PDA培养基， 补充20蛋白胨、 10蔗糖、 20黄豆粉、 0.1磷酸二氢钾、 0.1硫酸 镁、 0.02维生素B、 0.02维生素C、 0.05氯化钙、 1.0海藻酸钠； 所述维生素B为维生素 B。
33、2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量比为1:2:1； 0055 (4)四级固体培养： 所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸20份、 蚕蛹粉 20份、 黄豆粉10份、 维生素B 3份、 维生素C1份、 蔗糖10份、 米糠20份； 其中， 固体培养基的厚 度为5.5cm， 液固接种的比例为1:1.3。 0056 本实施例中， 采用上述培养方法得到的球孢白僵菌孢子粉， 其含孢量为8.61010/ g， 孢子萌发率为95， 活孢率为98； 用松毛虫3龄幼虫进行孢子毒力的生物测定， 喷菌后 (孢子液0.1108/mL浓度， 温度为20-28，。
34、 湿度90以上)5天， 松毛虫出现死亡高峰， 7天 松毛虫死亡率达95。 0057 实施例5 0058 本实施例所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 除以下特征外， 其余均与实施例1相 同。 0059 所述培养方法中： 0060 (1)一级斜面培养： 所述斜面培养基的组分按重量份数计包括： 马铃薯淀粉30份、 蛋白胨1份、 乳糖10份、 蔗糖1份、 磷酸二氢钾0.1份、 硫酸镁0.05份、 琼脂2份； 说明书 5/7 页 8 CN 106497805 A 8 0061 (2)二级液体培养： 所述种子罐中的液体培养基的组分按重量百分比计包括： PDA 培养基， 补充10蛋白胨、 10尿素、 5蔗糖、。
35、 15麦麸、 0.1磷酸二氢钾、 0.05硫酸镁、 0.01维生素B、 0.05维生素C、 0.01硫酸锌、 0.02硫酸铜、 0.05氯化铁、 0.1氯化 钙； 所述维生素B为维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生 素B6的重量比为1:2:1； 0062 (3)三级液体扩大培养： 所述发酵罐中的液体扩大培养基的组分按重量百分比计 包括： PDA培养基， 补充10蛋白胨、 20蔗糖、 10黄豆粉、 0.5磷酸二氢钾、 0.05硫酸 镁、 0.05维生素B、 0.01维生素C、 0.15氯化钙、 0.2海藻酸钠； 所述维生素B为维生素 B2、 维生。
36、素B3、 维生素B6的组合物， 所述维生素B2、 维生素B3、 维生素B6的重量比为1:1:2； 0063 (4)四级固体培养： 所述固体培养基的组分按重量份数计包括： 麦麸30份、 蚕蛹粉 10份、 黄豆粉20份、 维生素B 1份、 维生素C2份、 蔗糖2份、 米糠40份； 其中， 固体培养基的厚度 为5.5cm， 液固接种的比例为1:1.2。 0064 本实施例中， 采用上述培养方法得到的球孢白僵菌孢子粉， 其含孢量为8.71010/ g， 孢子萌发率为95， 活孢率为98； 用松毛虫3龄幼虫进行孢子毒力的生物测定， 喷菌后 (孢子液0.1108/mL浓度， 温度为20-28， 湿度90以。
37、上)5天， 松毛虫出现死亡高峰， 6天 松毛虫死亡率达95。 0065 实施例6 0066 本实施例所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 除以下特征外， 其余均与实施例1相 同。 0067 所述培养方法中： 0068 (1)一级斜面培养： 将斜面培养基调节pH值至6.5， 再在压力为100kPa下保压灭菌 60min， 冷却后， 将球孢白僵菌菌体接种于一级斜面培养基中， 在24培养5天； 0069 (2)二级液体培养： 将步骤(1)培养后得到的菌种接种至种子罐中， 在24培养 24h； 0070 (3)将步骤(2)培养后得到的菌种接种至发酵罐中， 在25培养28h； 0071 (4)四级固体培养：。
38、 将步骤(3)扩大培养后的菌种接种到固体培养基中， 在22下 培养5d， 控制四级固体培养的湿度为95。 0072 本实施例中， 采用上述培养方法得到的球孢白僵菌孢子粉， 其含孢量为8.61010/ g， 孢子萌发率为95， 活孢率为98； 用松毛虫3龄幼虫进行孢子毒力的生物测定， 喷菌后 (孢子液0.1108/mL浓度， 温度为20-28， 湿度90以上)5天， 松毛虫出现死亡高峰， 7天 松毛虫死亡率达95。 0073 实施例7 0074 本实施例所述的一种球孢白僵菌的培养方法， 除以下特征外， 其余均与实施例1相 同。 0075 所述培养方法中： 0076 (1)一级斜面培养： 将斜面培。
39、养基调节pH值至6.8， 再在压力为110kPa下保压灭菌 40min， 冷却后， 将球孢白僵菌菌体接种于一级斜面培养基中， 在25培养5-6天； 0077 (2)二级液体培养： 将步骤(1)培养后得到的菌种接种至种子罐中， 在25培养 28h； 说明书 6/7 页 9 CN 106497805 A 9 0078 (3)将步骤(2)培养后得到的菌种接种至发酵罐中， 在28培养32h； 0079 (4)四级固体培养： 将步骤(3)扩大培养后的菌种接种到固体培养基中， 在25下 培养6d， 控制四级固体培养的湿度为98。 0080 本实施例中， 采用上述培养方法得到的球孢白僵菌孢子粉， 其含孢量为8.71010/ g， 孢子萌发率为96， 活孢率为98； 用松毛虫3龄幼虫进行孢子毒力的生物测定， 喷菌后 (孢子液0.1108/mL浓度， 温度为20-28， 湿度90以上)4天， 松毛虫出现死亡高峰， 6天 松毛虫死亡率达95。 0081 以上仅是本发明的优选实施方式， 应当指出的是， 上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制， 本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。 对于本技术领域的 普通技术人员来说， 在不脱离本发明的精神和范围内， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。 说明书 7/7 页 10 CN 106497805 A 10 。