技术领域
本发明涉及食品安全快速检测领域，特别涉及一种能同时检测猪肉和鸭肉源性成分的恒温扩增引物组及其试剂盒。
背景技术
肉制品是人体蛋白质的重要来源。动物源性食品消费市场中，猪、牛、羊肉制品是消费者最欢迎的动物源食品，占到日常消费肉制品的绝大部分，但由于不同物种的动物肉类品质和价格存在差异，给掺杂掺假创造了利润空间。比如羊肉和牛肉价格就要远高于猪肉，同时鸡鸭加工中还会产生许多下脚料，价格十分便宜。因此近年来以其它物种的肉类掺入羊肉和牛肉产品中进行销售的事件屡有发生。对动物源性成分进行现场检测，是解决肉掺假市场监管问题的有效方法。
目前，对于肉源成分的区分和鉴定主要是利用核酸序列的特异性，即利用核酸扩增技术。常规PCR检测和荧光定量PCR检测是应用最广的核酸扩增技术，为鉴定食品中动物源性成分提供了有效手段，但同时也存在一定的不足，如需要PCR仪器、不能现场快速鉴定、判定结果需要电泳或其它专用设备、耗时相对较长、使用毒性较强的荧光染料、存在假阳性等等，这些缺点限制了其在食品中动物源性成分的快速鉴定中的应用，这些PCR 技术主要适合在实验室进行检测。
交叉引物恒温扩增技术是一种操作简单、时间短、成本低的检测技术，已广泛用于病原体检测等领域。该技术还具有特异性强、灵敏度高的特点，特别适合用于现场检测。目前该技术结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、结核分歧杆菌、恶性疟疾、霍乱弧菌、志贺氏菌、瓜果类斑病菌等病原菌的检测。利用交叉引物恒温扩增技术用于动物肉源检测方面，已有部分报道，如利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法（专利申请号：201410750537.X）、、一种羊肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法（专利申请号：201510811021.6）、一种鸡肉源性成分核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法（专利申请号：201510811692.2）。但这些交叉引物恒温扩增快速检测方法一次仅能对一种肉源性成分进行快速检测，效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时检测猪肉和鸭肉源性成分的恒温扩增引物组及其试剂盒，能同时对两种肉源性（猪肉和鸭肉）成分进行交叉引物恒温扩增，结合核酸检测试纸条，能快速鉴定样品中的这两种肉源性成分。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种能同时检测猪肉和鸭肉源性成分的恒温扩增引物组，包括：
（1）用于检测猪肉源性成分的引物：
正向外围引物：5’-ATTACCATGCCGCGTGAAACCGC-3’ (SEQ ID No.1)，
反向外围引物：5’-TCCTGGAGTAAGATCCAGATG-3’ (SEQ ID No.2)；
正向交叉引物：
5’-TAAGCATAGTAGGCTGCAGTTGATTGGTTGCGAGTCATTG-3’ (SEQ ID No.3)，
反向交叉引物：
5’-TTGTGTTCTGGATTGTGGGAATAGAAGTTGA-3’ (SEQ ID No.4)，
检测探针引物：
检测探针引物1：5’-TCCGCCGGATTTCG-3’ (SEQ ID No.5)，
检测探针引物2：5’-TGCAGCTCCCGTCTTC-3’ (SEQ ID No.6)；
（2）用于检测鸭肉源性成分的引物：
正向外围引物：5’-TTACTCATGAAGCTGCGTACCAGA-3’ (SEQ ID No.7)，
反向外围引物：5’-CTGGAAGAGCCGCGATTA-3’ (SEQ ID No.8)；
正向交叉引物：5’-CGAGCATAAGTTGGCAAAAGAGATCATGCTTAGGCCCAGTG-3’ (SEQ ID No.9)，
反向交叉引物：5’-TGGCTTATGTGTGCTGGATAAAGTTGCGTGA-3’ (SEQ ID No.10)；
检测探针引物：
检测探针引物3：5’-CGAGGAACCGATTTCA-3’ (SEQ ID No.11)，
检测探针引物4：5’-CGCAGGGGTTGGGGGAA-3’ (SEQ ID No.12)。
本发明的引物特异性好。
作为优选，检测探针引物1的5’端标记修饰生物素，检测探针引物2的5’端标记修饰荧光素FAM。
作为优选，检测探针引物3的5’端标记修饰生物素，检测探针引物4的5’端标记修饰荧光素FAM。
一种能同时检测猪肉和鸭肉源性成分的试剂盒，包括核酸检测试纸条、玻璃化恒温扩增管、复溶缓冲液、石蜡油、无菌双蒸水及检测缓冲液，玻璃化恒温扩增管中添加有扩增液，扩增液中含有权利要求1所述恒温扩增引物组。核酸检测试纸条是包埋有用于检测猪肉源性成分特异性探针的胶体金试纸条、用于检测鸭肉源性成分特异性探针的胶体金试纸条或可同时检测猪肉源性成分和鸭肉源性成分特异性探针的胶体金试纸条。
作为优选，所述扩增液包括如下成分：用于检测猪肉源性成分的正向外围引物2.5fmol，用于检测猪肉源性成分的反向外围引物2.5fmol，用于检测猪肉源性成分的正向交叉引物20fmol，用于检测猪肉源性成分的反向交叉引物10fmol，用于检测鸭肉源性成分的正向外围引物2.5fmol，用于检测鸭肉源性成分的反向外围引物2.5fmol，用于检测鸭肉源性成分的正向交叉引物20fmol，用于检测鸭肉源性成分的反向交叉引物10fmol，检测探针引物1为10fmol，检测探针引物2为10fmol ，检测探针引物3为10fmol ，检测探针引物4为10fmol ，dNTPs为5.0pmol，甜菜碱5.0μmol，Bst DNA聚合酶16U。
作为优选，所述复溶缓冲液的组成为：10mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgSO4，0.1% TritonX-100；pH8.8。
作为优选，所述检测缓冲液的组成为：30 mmol/L、pH7.0柠檬酸缓冲液， 0.3mol/L NaCl。
本发明利用交叉引物恒温扩增同时快速检测肉制品中猪肉和鸭肉源性成分的试剂盒使用方法，包括以下步骤：
(1)、提取待测肉源样品的猪和鸭基因组DNA：可直接利用商业上使用的动物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的总DNA作为待测样品DNA模板；或者直接简易提取，取剪碎后肉样少许，加入500μL无菌双蒸水，盖上盖振荡15s，于95℃恒温水浴中保温5min，离心后取上清，上清液备用。
(2)、玻璃化恒温扩增管复溶：取玻璃化恒温扩增管，加入20ul复溶缓冲液，再滴加20uL石蜡油，室温静置2-3分钟，使玻璃化试剂充分溶解；再加入3uL上述提取的DNA模板溶液，并用移液枪将管内液体充分吹打混匀后盖紧管盖。
(3)、恒温扩增：将反应管置于65℃恒温水浴锅内保温40-50min。
(4)、试纸条检测：将扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，再将核酸试纸条放入检测缓冲液中，5-10min 后通过试纸条的显色进行判读，扩增产物通过核酸检测试纸条进行判读；
若在T1位置（猪肉源性成分检测位置）出现红色条带则结果为猪肉源性成分阳性，若在T2位置（鸭肉源性成分检测位置）出现红色条带则结果为鸭肉源性成分阳性，若T1和T2位置均出现红色条带则猪肉和鸭肉源性成分均阳性；样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条或三条红色条带，其中一条位于质控区，一条或二条位于检测区（T1或T2）；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
本发明的有益效果是：
(1) 可同时检测两种肉源性成分，既缩短了检测时间，又降低了单项检测成本；(2) 检测速度快，与传统的检测方法相比，本发明将检测时间缩短到50min，明显提高了检测效率；(3) 方便实用，扩增产物通过一次性试纸条进行检测，5-10min 即可完成检测结果的判读，尤其适用在基层现场检测。(4) 不需要复杂仪器设备。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
用本发明试剂盒同时检测猪肉和鸭肉源性成分核酸的具体方法
（1）提取待检测样品中DNA ：取剪碎后肉样少许，加入500μL无菌双蒸水，盖上盖振荡15s，于95℃恒温水浴中保温5min，离心后取上清，上清液备用。
(2)、玻璃化恒温扩增管复溶：取玻璃化恒温扩增管，加入20ul复溶缓冲液，再滴加20uL石蜡油，室温静置2-3分钟，使玻璃化试剂充分溶解；再加入3uL上述提取的DNA模板溶液，并用移液枪将管内液体充分吹打混匀后盖紧管盖。
玻璃化恒温扩增管中添加有扩增液，所述扩增液包括如下成分：用于检测猪肉源性成分的正向外围引物2.5fmol，用于检测猪肉源性成分的反向外围引物2.5fmol，用于检测猪肉源性成分的正向交叉引物20fmol，用于检测猪肉源性成分的反向交叉引物10fmol，用于检测鸭肉源性成分的正向外围引物2.5fmol，用于检测鸭肉源性成分的反向外围引物2.5fmol，用于检测鸭肉源性成分的正向交叉引物20fmol，用于检测鸭肉源性成分的反向交叉引物10fmol，检测探针引物1为10fmol，检测探针引物2为10fmol ，检测探针引物3为10fmol ，检测探针引物4为10fmol ，dNTPs为5.0pmol，甜菜碱5.0μmol，Bst DNA聚合酶16U。
（1）用于检测猪肉源性成分的引物：
正向外围引物：5’-ATTACCATGCCGCGTGAAACCGC-3’ (SEQ ID No.1)，
反向外围引物：5’-TCCTGGAGTAAGATCCAGATG-3’ (SEQ ID No.2)；
正向交叉引物：
5’-TAAGCATAGTAGGCTGCAGTTGATTGGTTGCGAGTCATTG-3’ (SEQ ID No.3)，
反向交叉引物：
5’-TTGTGTTCTGGATTGTGGGAATAGAAGTTGA-3’ (SEQ ID No.4)，
检测探针引物：
检测探针引物1：5’-TCCGCCGGATTTCG-3’ (SEQ ID No.5)，
检测探针引物2：5’-TGCAGCTCCCGTCTTC-3’ (SEQ ID No.6)；
（2）用于检测鸭肉源性成分的引物：
正向外围引物：5’-TTACTCATGAAGCTGCGTACCAGA-3’ (SEQ ID No.7)，
反向外围引物：5’-CTGGAAGAGCCGCGATTA-3’ (SEQ ID No.8)；
正向交叉引物：5’-CGAGCATAAGTTGGCAAAAGAGATCATGCTTAGGCCCAGTG-3’ (SEQ ID No.9)，
反向交叉引物：5’-TGGCTTATGTGTGCTGGATAAAGTTGCGTGA-3’ (SEQ ID No.10)；
检测探针引物：
检测探针引物3：5’-CGAGGAACCGATTTCA-3’ (SEQ ID No.11)，
检测探针引物4：5’-CGCAGGGGTTGGGGGAA-3’ (SEQ ID No.12)。
检测探针引物1的5’端标记修饰生物素，检测探针引物2的5’端标记修饰荧光素FAM。检测探针引物3的5’端标记修饰生物素，检测探针引物4的5’端标记修饰荧光素FAM。
所述复溶缓冲液的组成为：10mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L MgSO4，0.1% TritonX-100；pH8.8。
所述检测缓冲液的组成为：30 mmol/L、pH7.0柠檬酸缓冲液， 0.3mol/L NaCl。
(3)、恒温扩增：将反应管置于65℃恒温水浴锅内保温40min。
(4)、试纸条检测：将扩增产物滴加到核酸试纸条（为市售或现有公开的猪肉源性成分检测试纸、鸭肉源性成分检测试纸）的加样区，再将核酸试纸条放入检测缓冲液中，5min后观察试纸条C、T1、T2线标志处是否出现红色条带。若在T1位置（猪肉源性成分检测位置）出现红色条带则结果为猪肉源性成分阳性，若在T2位置（鸭肉源性成分检测位置）出现红色条带则结果为鸭肉源性成分阳性，若T1和T2位置均出现红色条带则猪肉和鸭肉源性成分均阳性；样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条或三条红色条带，其中一条位于质控区，一条或二条位于检测区（T1或T2）；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
反复重复实验3 次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要50分钟左右就能完成，大大缩短检测时间。
取市售猪肉卷和鸭肉卷各10份，使用本发明检测，结果为猪肉卷中猪肉源性成分检出10份、鸭肉源性成分检出0份，鸭肉卷中猪肉源性成分检出1份、鸭肉源性成分检出10份；相同样品，使用荧光定量PCR方法进行肉源性成分检测，结果为猪肉卷中猪肉源性成分检出10份、鸭肉源性成分检出0份，鸭肉卷中猪肉源性成分检出1份、鸭肉源性成分检出10份。本发明检测结果与传统荧光定量PCR检测结果一致。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州天迈生物科技有限公司
<120> 一种能同时检测猪肉和鸭肉源性成分的恒温扩增引物组及其试剂盒
<130> 2016.10
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attaccatgc cgcgtgaaac cgc 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcctggagta agatccagat g 21
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taagcatagt aggctgcagt tgattggttg cgagtcattg 40
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgtgttctg gattgtggga atagaagttg a 31
<210> 5
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccgccggat ttcg 14
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgcagctccc gtcttc 16
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttactcatga agctgcgtac caga 24
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctggaagagc cgcgatta 18
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgagcataag ttggcaaaag agatcatgct taggcccagt g 41
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tggcttatgt gtgctggata aagttgcgtg a 31
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgaggaaccg atttca 16
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgcaggggtt gggggaa 17