一株可以高产聚谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌.pdf

《一株可以高产聚谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一株可以高产聚谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌.pdf（12页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611043607.3 (22)申请日 2016.11.11 (83)生物保藏信息 CCTCC No:M2016439 2016.08.30 CCTCC No:M208065 2008.04.28 (71)申请人 湖北大学 地址 430060 湖北省武汉市武昌区友谊大 道368号 (72)发明人 陈守文蔡冬波陆兴澄王勤 陈杨阳何鹏辉 (74)专利代理机构 武汉河山金堂专利事务所 (普通合伙) 42212 代理人 胡清堂 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.。

2、01) C12P 13/02(2006.01) C12R 1/10(2006.01) (54)发明名称 一株可以高产聚-谷氨酸的地衣芽胞杆菌 工程菌 (57)摘要 本发明提供了一株高产聚-谷氨酸的地衣 芽胞杆菌工程菌 ， 其保藏号为CCTCCNo: M2016439， 命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis(WX-02)/pHY-zwf， 并进一步提供 了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的构建方法及高 产聚-谷氨酸的方法。 通过基因工程改造增加 胞内NADPH的合成水平， 提高-PGA的产量。 通过 构建6-磷酸葡萄糖脱氢酶过表达载体pHY-zwf， 并转化至实验。

3、室之前保存的产-PGA地衣芽胞 杆菌WX-02中,重新构建了地衣芽胞杆菌产- PGA工程菌WX-02/pHY-zwf。 该菌株在优化培养基 和培养条件下可以显著提高-PGA的合成。 其聚 -谷氨酸产量高达51.13g/L； 与原始菌株相比 聚-谷氨酸产量显著提高49。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图1页 CN 106497857 A 2017.03.15 CN 106497857 A 1.一种地衣芽胞杆菌， 其特征在于： 所述地衣芽胞杆菌的保藏编号为CCTCC No: M2016439， 命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis(WX-02)/pHY-zwf。

4、。 2.权利要求1所述地衣芽胞杆菌在产聚-谷氨酸中的应用。 3.一种如权利要求1所述的地衣芽胞杆菌的构建方法， 其步骤包括： 在过表达质粒 pHY300PLK基础上， 构建过表达质粒pHY-zwf， 重组质粒转化地衣芽胞杆菌WX-02后得到地衣 芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf； 所述地衣芽胞杆菌WX-02， 该菌保藏编号为CCTCC No:M208065， 命 名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformisWX-02。 4.如权利要求3所述的地衣芽胞杆菌的构建方法， 其特征在于： 所述过表达质粒pHY- zwf， 其启动子为枯草芽胞杆菌168中P43启动子， zwf为地衣芽胞。

5、杆菌WX-02中6-磷酸-葡萄 糖脱氢酶基因， 终止子为地衣芽胞杆菌WX-02中amyL终止子。 5.权利要求1所述地衣芽胞杆菌发酵产聚-谷氨酸的方法， 其步骤包括： (1)种子培养： 将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf接至LB培养基中进行种子培养得到发酵 菌种； (2)发酵培养： 将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养， 所述发酵培养基配方为： 30-100g/L葡萄糖； 5-15g/L NH4Cl； 5-15g/L柠檬酸钠； 10-50g/L谷氨酸钠； 0.1-1.5g/ LK2HPO43H2O； 0.1-1.5g/LMgSO47H2O； 0.1-1.5g/LZnSO47H2O； 0。

6、.1-1.5g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 6.0-8.0； 所述发酵培养条件为： 发酵温度为30-40， 装液量为容器体积的 10-30， 摇床转速200-260r/min， 发酵周期30-38h。 6.如权利要求5所述地衣芽胞杆菌发酵产聚-谷氨酸的方法， 其特征在于： 所述种子 培养的条件为： 培养温度为30-39， 装液量为容器体积的15-25， 摇床转速160-200r/ min， 培养时间为8-12h。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106497857 A 2 一株可以高产聚-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌 技术领域 0001 本发明属于基因工程和微生物。

7、代谢工程技术领域， 特别是涉及一株可以高产聚 -谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌。 背景技术 0002 聚-谷氨酸是一种具有广泛用途的阴离子型高分子聚合物， 其具有诸多特点： 易 溶于水； 良好的保水能力； 吸附金属离子； 缓释性和可生物降解。 因为聚-谷氨酸特殊的生 物学性质， 其在农业， 医药， 食品， 化妆品等领域具有广泛用途。 0003 相关文献报道， 聚-谷氨酸的产生菌主要由枯草芽胞杆菌， 解淀粉芽胞杆菌和地 衣芽胞杆菌等。 一般来说， 聚-谷氨酸的合成主要由内源和外源两种途径。 外源途径主要 是在培养基中添加谷氨酸， 谷氨酸经转运至胞内从而形成聚-谷氨酸； 而内源途径则主要 是葡萄糖经糖。

8、酵解途径， TCA循环， 由 -酮戊二酸形成谷氨酸。 目前为止， 人们主要是通过以 下策略构建重组菌株来提高聚-谷氨酸产量有： 1、 强化谷氨酸合成途径； 2、 副产物合成途 径的中断； 3、 强化聚-谷氨酸合成酶表达和ATP供应等。 通过这些方面的基因工程改造， 都 能实现聚-谷氨酸产量的提高。 0004 NADPH的供给水平在目标产物的合成过程中具有重要作用。 而NADPH再生途径主要 有磷酸戊糖途径， TCA循环和转氢酶途径等三个途径， 其中磷酸戊糖在NADPH再生过程中起 着主要作用。 6-磷酸葡萄糖脱氢酶是6-磷酸葡萄糖进入磷酸戊糖途径的第一个酶， 也是其 整个磷酸戊糖途径的限速酶，。

9、 因而Zwf在NADPH再生中具有重要作用。 在之前的研究中， Wang et al(2012)在枯草芽孢杆菌中通过过表达Zwf将核黄素的产量提高了31。 然而， Zwf表达 水平与聚-谷氨酸发酵产量之间的关系并没有人研究。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的在于提供可以高产聚-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌。 0006 本发明第一方面提供了一种地衣芽胞杆菌， 所述地衣芽胞杆菌于年月日保藏于武 汉大学中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC No:M2016439， 命名为地衣芽胞杆菌 Bacillus licheniformis(WX-02)/pHY-zwf， 保藏日期： 201。

10、6年8月30日。 0007 本发明第二方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的构建方法， 其步骤包括： 在 过表达质粒pHY300PLK基础上， 构建过表达质粒pHY-zwf， 重组质粒转化地衣芽胞杆菌WX-02 后得到地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf； 所述地衣芽胞杆菌WX-02， 该菌保藏编号为CCTCC No: M208065， 命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformisWX-02， 保藏日期： 2008年4月28日。 0008 本发明第三方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf产聚-谷氨酸的方法， 其步 骤包括： 0009 (1)种子培养： 。

11、将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf接至LB培养基中进行种子培养得到 发酵菌种； 0010 (2)发酵培养： 将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养， 所述发酵培养基配方 说明书 1/6 页 3 CN 106497857 A 3 为： 30-100g/L葡萄糖； 5-12g/L NH4Cl； 5-15g/L柠檬酸钠； 10-50g/L谷氨酸钠； 0.1-1.5g/ LK2HPO43H2O； 0.1-1.5g/LMgSO47H2O； 0.1-1.5g/LZnSO47H2O； 0.1-1.5g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 6.0-8.0； 所述发酵培养条件为： 发。

12、酵温度为30-40， 装液量为容器体积的 10-30， 摇床转速200-260r/min， 发酵周期34-38h。 0011 本发明的有益效果是： 本发明通过基因工程改造增加胞内NADPH的合成水平， -酮 戊二酸形成谷氨酸过程中会消耗大量NADPH， 以此提高-PGA的产量。 通过构建6-磷酸葡萄 糖脱氢酶过表达载体pHY-zwf， 并转化至实验室之前保存的产-PGA地衣芽胞杆菌WX-02 中,重新构建了地衣芽胞杆菌产-PGA工程菌WX-02/pHY-zwf。 本发明的地衣芽胞杆菌WX- 02/pHY-zwf在液体发酵过程中可以高产聚-谷氨酸， 其聚-谷氨酸产量高达51.13g/L， 为以后。

13、的科学研究和工业化生产奠定了基础， 具有非常广阔的应用前景。 附图说明 0012 图1为zwf过表达载体中表达元件琼脂糖凝胶图； 0013 图2为zwf基因过表达载体质粒图谱； 0014 图3为重组载体转化地衣芽胞杆菌WX-02菌落PCR验证图； 0015 图4为地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中发酵终点测定聚-谷氨酸产 量示意图。 具体实施方式 0016 本发明第一方面提供了一种地衣芽胞杆菌， 所述地衣芽胞杆菌于年月日保藏于武 汉大学中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCC No:M2016439， 命名为地衣芽胞杆菌 Bacillus licheniformis(W。

14、X-02)/pHY-zwf。 0017 进一步的， 本发明提供了上述地衣芽胞杆菌在产聚-谷氨酸中的应用。 本发 0018 明第二方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的构建方法， 其步骤包括： 在过表 达质粒pHY300PLK基础上， 构建过表达质粒pHY-zwf， 重组质粒转化地衣芽胞杆菌WX-02后得 到地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf； 所述地衣芽胞杆菌WX-02， 该菌保藏编号为CCTCC No: M208065， 命名为地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformisWX-02。 0019 优选的， 所述过表达质粒pHY-zwf， 其启动子为枯草芽胞杆菌168。

15、中P43启动子， zwf 为地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因， 终止子为地衣芽胞杆菌WX-02中amyL 终止子。 0020 本发明第三方面提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf产聚-谷氨酸的方法， 其步 骤包括： 0021 (1)种子培养： 将地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf接至LB培养基中进行种子培养得到 发酵菌种； 0022 (2)发酵培养： 将发酵菌种接至发酵培养基中进行发酵培养， 所述发酵培养基配方 为： 30-100g/L葡萄糖； 5-12g/L NH4Cl； 5-15g/L柠檬酸钠； 10-50g/L谷氨酸钠； 0.1-1.5g/ LK2HPO43H。

16、2O； 0.1-1.5g/LMgSO47H2O； 0.1-1.5g/LZnSO47H2O； 0.1-1.5g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 6.0-8.0； 所述发酵培养条件为： 发酵温度为30-40， 装液量为容器体积的 10-30， 摇床转速200-260r/min， 发酵周期34-38h。 说明书 2/6 页 4 CN 106497857 A 4 0023 优选的， 所述种子培养的条件为： 培养温度为30-39， 装液量为容器体积的15- 25， 摇床转速160-200r/min， 培养时间为8-12h。 0024 下面将结合具体实施例对本发明提供的一株可以高。

17、产聚-谷氨酸的地衣芽胞杆 菌工程菌予以进一步说明。 下面描述的实施例是示例性的， 仅用于解释本发明， 而不能理解 为对本发明的限制。 0025 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的实 验材料如无特殊说明， 均为市场购买得到。 0026 实施例1 0027 本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf及其构建方法。 0028 1重组载体中表达元件的克隆 0029 以枯草芽胞杆菌168的总DNA为模板， 根据NCBI公布的枯草芽胞杆菌168的基因组 序列， 采用PCR的方法扩增出启动子P43的序列SEQ ID NO:1， 引物分别为P43-F SEQ。

18、 ID NO: 2、 P43-R SEQ ID NO:3； 以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模板， 根据NCBI上公布的地衣芽胞 杆菌WX-02基因组序列， 采用PCR的方法扩增出6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf序列SEQ ID NO:4， 引物为zwf-F SEQ ID NO:5、 zwf-R SEQ ID NO:6； 以地衣芽胞杆菌WX-02的总DNA为模 板， 根据NCBI上公布的地衣芽胞杆菌WX-02基因组序列， 采用PCR的方法扩增出淀粉酶基因 amyL终止子的序列SEQ ID NO:7， 引物为TamyL-F SEQ ID NO:8、 TamyL-R SEQ ID NO:9。 0。

19、030 对zwf过表达载体中表达元件进行了琼脂糖凝胶电泳检测， 其琼脂糖凝胶图如附 图1所示， 其中， 泳道1为5K DNA marker(从上到下依次为： 5000bp， 3000bp， 2000bp， 1500bp， 1000bp， 750bp， 500bp， 250bp， 100bp)， 泳道2为来源于枯草芽胞杆菌168中启动子P43的条带 (305bp)； 泳道3为来源地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸-葡萄糖脱氢酶基因zwf的条带 (1479bp)； 泳道4为来源于地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL终止子条带(501bp)。 0031 2以P43为启动子强化表达zwf基因的过表。

20、达载体的构建 0032 以实验室保存的表达载体pHY300PLK为初始载体构建zwf基因过表达载体， 所述表 达载体pHY300PLK可市场购买得到。 先将P43启动子、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf及淀粉酶 基因amyL的终止子片段通过SOE-PCR的方法连到一起。 通过EcoRI/XbaI双酶切， 纯化回收后 与同样经过EcoRI/XbaI双酶切的pHY300PLK空质粒酶连， 酶连温度为16， 时间为8h， 酶连 产物随后转化E.coli DH5 ， 挑转化子进行菌落PCR验证， 将PCR验证正确的转化子挑菌接至 含有5mL LB培养基的PA瓶中(50ug/mL氨苄抗生素)， 抽质粒并。

21、测序。 0033 所述zwf基因过表达载体质粒图谱如附图2所示， 以表达质粒pHY300PLK为原始质 粒， 在其基础上加入来源于枯草芽胞杆菌168的启动子P43， 来源于地衣芽胞杆菌WX-02中6- 磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf及来源于地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL的终止子， 构建 了重组质粒pHY-zwf。 0034 3地衣芽胞杆菌高产聚-谷氨酸工程菌株WX-02/pHY-zwf的构建将构建 0035 好的过表达载体pHY-zwf转化地衣芽胞杆菌WX-02。 首先做地衣芽胞杆菌WX-02感 受态， 在平板上活化菌种， 然后挑菌至含有5mL LB的PA瓶中， 37过夜培养， 随后以。

22、5的接 种量转接至生长培养基中， 37， 200rpm培养至OD600到0.85左右， 5500rpm离心6min收集菌 体， 用洗涤培养基重悬菌体， 5500rpm离心6min， 重复三次后加入1mL洗涤培养基重悬菌体， 分装至灭过菌的1.5mLEP管中， -80保存。 说明书 3/6 页 5 CN 106497857 A 5 0036 将吹干后的电转杯在冰上预冷15min， 然后将100ul的地衣芽胞杆菌WX-02感受态 细胞与10ul重组载体混匀后加入电转杯中， 冰上预冷3-5min后， 2.4kV条件下电击， 电击时 间4.8-5.2ms， 随后立即加入800ul恢复培养基并转移至1.。

23、5mLEP管中。 37， 100rpm培养3h 后涂LB平板(20ug/mL四环抗生素)。 待长出转化子后挑菌进行菌落PCR验证和抽质粒验证， 验证正确后保存菌种， 即得地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf。 0037 重组载体转化地衣芽胞杆菌WX-02菌落PCR验证图如附图3所示， 其中， 泳道1为采 用菌落PCR验证条带(2585bp)， 通道2为5K marker(从上到下依次为： 5000bp， 3000bp， 2000bp， 1500bp， 1000bp， 750bp， 500bp， 250bp， 100bp)。 0038 实施例2 0039 本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/。

24、pHY-zwf产聚-谷氨酸的方法， 通过地衣芽 胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同发酵条件下进行发酵实验， 得到高产聚-谷氨酸的方法。 0040 所述发酵实验得到的聚-谷氨酸均采用如下测定方法和定量方法： 0041 在2.0mL发酵液中加入2倍体积的无水乙醇， 震荡混合， 在8000r/min离心10min。 丢 弃上清， 其离心沉淀用2.0mL去离子水溶解， 震荡均匀。 取1.0mL溶液于比色管中， 加入1mL浓 盐酸， 密封后于100下水解24h。 水解结束后， 用1mol/L NaOH定容10mL， 再经0.22 m微孔滤 膜过滤。 HPLC测定采用Lichrospher C18色谱。

25、柱(25cm4.6mm)。 检测波长210nm。 流动相为 含5.0甲醇的100mmol/L KH2PO4(用磷酸调pH值至2.5)。 流速1.0mL/min。 进样量为1.0 L。 以聚-谷氨酸标准品作为对照， 对发酵液产物进行定量分析。 0042 一、 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在ME发酵培养基的发酵实验 0043 挑取WX-02和WX-02/pHY-zwf菌落分别接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振 荡培养过夜。 再以2的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的 接种量接种到预先准备好的ME发酵培养基中， 37， 240。

26、r/min， 发酵时间36h。 0044 所述LB培养基： 10g/L蛋白胨； 5g/L酵母浸出粉； 10g/L氯化钠； pH 7.0-7.2； 固体培 养基加琼脂18g/L。 0045 所述ME发酵培养基： 20g/L葡萄糖； 20g/L谷氨酸钠； 12g/L柠檬酸钠； 7g/L NH4Cl； 0.5g/LK2HPO43H2O； 0.5g/LMgSO47H2O； 0.5g/LZnSO47H2O； 0.15g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 7.2。 0046 在ME培养基中， 原始菌株WX-02和重组菌WX-02/pHY-zwf的聚-谷氨酸最高产量 分别达到22.2。

27、g/L和28.8g/L， 工程菌比原始菌株提高了27.1。 二、 0047 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同葡萄糖浓度下聚-谷氨酸的发酵 0048 挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 再以1的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种 到预先准备好的葡萄糖浓度为20-100g/L的优化培养基中， 37， 240r/min， 发酵时间36h。 0049 所述优化培养基： 20-100g/L葡萄糖； 20g/L谷氨酸钠； 12g/L柠檬酸钠； 7g/L NH4Cl； 0.5g。

28、/LK2HPO43H2O； 0.5g/LMgSO47H2O； 0.5g/LZnSO47H2O； 0.15g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 7.2。 0050 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚-谷氨酸最高产量达到38.6g/L， 工程菌比原 始菌株提高了39.2。 0051 三、 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同NH4Cl浓度下聚-谷氨酸的发酵 说明书 4/6 页 6 CN 106497857 A 6 0052 挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 再以1的接种量转接到50mL新鲜。

29、的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种 到预先准备好的NH4Cl浓度为5-15g/L的优化培养基中， 37， 240r/min， 发酵时间36h。 0053 所述优化培养基： 20g/L葡萄糖； 20g/L谷氨酸钠； 12g/L柠檬酸钠； 5-15g/L NH4Cl； 0.5g/LK2HPO43H2O； 0.5g/LMgSO47H2O； 0.5g/LZnSO47H2O； 0.15g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 7.2。 0054 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚-谷氨酸最高产量达到36.2g/L， 工程菌比原 始菌株提高了38.6。

30、。 0055 四、 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同柠檬酸钠浓度下聚-谷氨酸的发酵 0056 挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 再以1的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种 到预先准备好的柠檬酸钠浓度5-15g/L的优化培养基中， 37， 240r/min， 发酵时间36h。 0057 所述优化培养基： 20g/L葡萄糖； 20g/L谷氨酸钠； 5-15g/L柠檬酸钠； 7g/L NH4Cl； 0.5g/LK2HPO43H2O； 0.5g/LMgSO47H2O； 。

31、0.5g/LZnSO47H2O； 0.15g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 7.2。 0058 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚-谷氨酸最高产量达到34.5g/L， 工程菌比原 始菌株提高了36.4。 0059 五、 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在不同谷氨酸钠浓度下聚-谷氨酸的发酵 0060 挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 再以1的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种 到预先准备好的谷氨酸钠浓度10-50g/L的优化培养基中，。

32、 37， 240r/min， 发酵时间36h。 0061 所述优化培养基： 20g/L葡萄糖； 10-50g/L谷氨酸钠； 12g/L柠檬酸钠； 7g/L NH4Cl； 0.5g/LK2HPO43H2O； 0.5g/LMgSO47H2O； 0.5g/LZnSO47H2O； 0.15g/LCaCl2； 0.10g/ LMnSO4H2O； pH 7.2。 0062 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚-谷氨酸最高产量达到44.8g/L， 工程菌比原 始菌株提高了43.6。 0063 六、 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中聚-谷氨酸的发酵挑取 0064 菌落WX-02/pH。

33、Y-zwf接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 再以 1的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种到预 先准备好的优化培养基中， 37， 240r/min， 发酵时间36h。 0065 所述优化培养基： 30-100g/L葡萄糖； 5-12g/L NH4Cl； 5-15g/L柠檬酸钠； 10-50g/L 谷氨酸钠； 0.1-1.5g/LK2HPO43H2O； 0.1-1.5g/LMgSO47H2O； 0.1-1.5g/LZnSO47H2O； 0.1-1.5g/LCaCl2； 0.10g/LMnSO4H2O； pH 6。

34、.0-8.0. 0066 地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf的聚-谷氨酸最高产量达到51.13g/L， 见附图4， 工 程菌比原始菌株提高了49。 0067 实施例3 0068 本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中产聚-谷氨酸的 方法， 具体步骤包括： 0069 挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 说明书 5/6 页 7 CN 106497857 A 7 再以1的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种 到预先准备好的优化培养基中， 40， 240。

35、r/min， 发酵时间36h。 0070 所述优化培养基： 100g/L葡萄糖； 12g/L NH4Cl； 5g/L柠檬酸钠； 10g/L谷氨酸钠； 1.5g/LK2HPO43H2O； 1.5g/LMgSO47H2O； 1.5g/LZnSO47H2O； 1.5g/LCaCl2； 0.15g/ LMnSO4H2O； pH 8.0。 0071 所得发酵结果与实施例2基本一致， 聚-谷氨酸产量相比于原始菌株有明显提 高。 0072 实施例4 0073 本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中产聚-谷氨酸的 方法， 具体步骤包括： 0074 挑取菌落WX-02/pHY-zwf。

36、接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 再以1的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种 到预先准备好的优化培养基中， 30， 240r/min， 发酵时间36h。 0075 所述优化培养基： 50g/L葡萄糖； 8g/L NH4Cl； 10g/L柠檬酸钠； 10g/L谷氨酸钠； 0.8g/LK2HPO43H2O； 0.8g/LMgSO47H2O； 0.8g/LZnSO47H2O； 0.8g/LCaCl2； 0.15g/ LMnSO4H2O； pH 7.0. 0076 所得发酵结果与实施例2基本一致， 聚-谷氨酸产量相。

37、比于原始菌株有明显提 高。 0077 实施例5 0078 本实施例提供了地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-zwf在优化培养基中产聚-谷氨酸的 方法， 具体步骤包括： 0079 挑取菌落WX-02/pHY-zwf接种于5mL LB培养基中， 37， 240r/min振荡培养过夜。 再以1的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中， 直到OD600为1.0时， 以1的接种量接种 到预先准备好的优化培养基中， 34， 240r/min， 发酵时间36h。 0080 所述优化培养基： 30g/L葡萄糖； 10g/L NH4Cl； 5g/L柠檬酸钠； 50g/L谷氨酸钠； 0.8g/LK2HPO43H2O；。

38、 0.8g/LMgSO47H2O； 0.8g/LZnSO47H2O； 0.8g/LCaCl2； 0.15g/ LMnSO4H2O； pH 6.0. 0081 所得发酵结果与实施例2基本一致， 聚-谷氨酸产量相比于原始菌株有明显提 高。 0082 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 106497857 A 8 SEQUENCE LISTING 湖北大学 一株高产聚-谷氨酸的地衣芽胞杆菌工程菌 2016 9 PatentIn version 3。

39、.3 1 305 DNA 枯草芽胞杆菌168中P43启动子 1 tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60 taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120 tttgcgtttt taccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180 aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaa。

40、aagcgc 240 gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300 atgaa 305 2 20 DNA 人工序列 2 tgataggtgg tatgttttcg 20 3 18 DNA 人工序列 3 ttcatgtgta cattcctc 18 4 1479 DNA 地衣芽胞杆菌WX-02中6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因zwf 4 ttgaaaaaag atcaaatgga accaaaagca gttatcgtaa tatttggcgc aacaggggat 60 ttggcaaaac gaaaacta。

41、ta tccttctatc cacaggctct acgaaaacgg acaaatcggg 120 aatgaattcg cggttgtcgg agtcggcaga cgcccttgga caaatgaaga ctttcgcagt 180 actgtacagc aatcggtttc gaagtttccg ttaaacgaaa aggatgtaga cgagtttaca 240 序列表 1/3 页 9 CN 106497857 A 9 tctcacttct actatcatcc ttttgatgtt acaaattccg gctcataccg ggaattgaac 300 gaacttttag。

42、 agaagctgga aagtacatat gatattccga ataaccggat gttttactta 360 gcgatggctc ctgaattttt cggaacgatt gcaaagttcc taaaatcaga gggtgtcact 420 tcaacaacag gctggtcaag gctcgtgatc gagaagcctt tcggacatga tctgccgagc 480 gcaaaatcct tgaatcagga aattcgtgaa gcctttacag aagatcaaat ctatcggatt 540 gaccattatc taggaaagca aatggtgc。

43、ag aacatcgaag tcatccgctt tgccaacgcg 600 atttttgagc cgctttggac aaacagatac atctcgaata ttcaaatcac gtcaagtgaa 660 gatttgggtg tggaagacag agcgagatat tatgaaaaat ccggtgcgct tcgagacatg 720 gttcaaaacc acattcttca aatggtggcg ctgcttgcga tggaaccgcc gatcaagctg 780 aacacggaag agatccgcag cgaaaaagtg aaggtgctca gagccc。

44、ttcg tccgattcga 840 aaagacgaag tcgatcagtt ttttgtgcgc ggccagtatg acgcgggtgt cgttgacgaa 900 aaacaggttc cggcttatcg cgatgagcaa aatgtagcaa aagagtcgaa tacggaaacg 960 ttcgttgccg gcaaactgct gatcgacaac ttcagatggg ccggtgtgcc gttctacatc 1020 cggacaggga aacggatgca gaaaaaatca acgcagattg tcgtccaatt taaagacatt 108。

45、0 ccgatgaatc tttattacgg aaacggcaac acgatgcatc ctaacctgct ggtgatccat 1140 attcaacctg atgaaggcat cacccttcat ttaaacgcaa ggaagcttgg aggcggcact 1200 tttgcccagc cgatcaagct cgactactgc cataactgcg gggacggcat caacacgcct 1260 gaagcttatg aaaagctgat tttggactgt ttgcacggag acgcgacaaa ctttgcccac 1320 tgggatgaag ttg。

46、cgctttc ctggagtttt gttgatgcga tttctcaaaa ctgggaggaa 1380 aacaaaaccc tttcccctaa ctatgaggcg ggctctatgg gaccgaaagc ttctgatgac 1440 ctgctcgcaa aagacggctt tcattggtgg ccgctttaa 1479 5 20 DNA 人工序列 5 ttgaaaaaag atcaaatgga 20 6 19 DNA 人工序列 6 ttaaagcggc caccaatga 19 7 501 DNA 地衣芽胞杆菌WX-02中淀粉酶基因amyL的终止子 7 aagag。

47、cagag aggacggatt tcctgaagga aatccgtttt tttattttgc ccgtcttata 60 序列表 2/3 页 10 CN 106497857 A 10 aatttctttg attacatttt ataattaatt ttaacaaagt gtcatcagcc ctcaggaagg 120 acttgctgac agtttgaatc gcataggtaa ggcggggatg aaatggcaac gttatctgat 180 gtagcaaaga aagcaaatgt gtcgaaaatg acggtatcgc gggtgatcaa tcatcctgag。

48、 240 actgtgacgg atgaattgaa aaagcttgtt cattccgcaa tgaaggagct caattatata 300 ccgaactatg cagcaagagc gctcgttcaa aacagaacac aggtcgtcaa gctgctcata 360 ctggaagaaa tggatacaac agaaccttat tatatgaatc tgttaacggg aatcagccgc 420 gagctggacc gtcatcatta tgctttgcag cttgtcacaa ggaaatctct caatatcggc 480 cagtgcgacg gcattattgc g 501 8 20 DNA 人工序列 8 aagagcagag aggacggatt 20 9 21 DNA 人工序列 9 cgcaataatg ccgtcgcact g 21 序列表 3/3 页 11 CN 106497857 A 11 图1 图2 图3 图4 说明书附图 1/1 页 12 CN 106497857 A 12 。