技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因单核苷酸多态性(SNP)的检测，特别涉及一种检测秦川牛microRNA-320a-1基因单核苷酸多态性的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是生物基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的变异。研究表明，基因组DNA序列发生单核苷酸替换，会造成DNA序列的改变或编码蛋白质的氨基酸发生改变，从而使不同基因型的生物体表现出不同的性状。
MicroRNAs是生物基因组DNA转录产生的一类长约22nt的非编码RNA，研究表明，microRNAs发挥作用的方式是与下游靶基因的mRNA碱基互补配对，使该mRNA降解或翻译受到抑制，从而影响生物体的性状。目前，对microRNA-320a基因的研究多集中在人类，主要包括该基因与癌细胞的转移和侵染等相关研究，未见microRNA-320a基因在黄牛上的遗传变异研究。黄牛microRNA-320a基因包括2个亚型，分别是microRNA-320a-1和microRNA-320a-2，这两个亚型发挥作用的途径相同。
目前黄牛microRNA-320a-1基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因多态位点的功能研究及其遗传变异与生长发育性状(如：体重、体高、体长、胸宽、胸深和胸围等性状)关联研究仍是空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种秦川牛microRNA-320a-1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用，加快具有优质经济性状秦川牛种群的建立。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
以包含microRNA-320a-1基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，以引物对P2为引物，PCR扩增秦川牛microRNA-320a-1基因片段；用限制性内切酶PvuII消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点的单核苷酸多态性；
所述的引物对P2为：
上游引物：AACTCCCACGTTGCGTCCAGC 21nt；
下游引物：GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT 20nt。
所述的PCR扩增反应程序为：
94℃预变性2min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸15s，30～36个循环；72℃延伸5min。
所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为3％的琼脂糖凝胶电泳。
所述的琼脂糖凝胶电泳结果鉴定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点的单核苷酸多态性为：CC基因型表现为188bp条带；CT基因型表现为188bp、168bp和20bp条带；TT基因型表现为168bp和20bp条带；其中，TT基因型为突变纯合基因型。
本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的秦川牛microRNA-320a-1基因单核苷酸多态性检测方法，针对(rs518926539:C>T)位点由C突变为T的突变，通过在设计的上游引物的3’端引入碱基错配，构造出被限制性内切酶PvuII所识别的切割位点。当没有突变发生时，PCR扩增microRNA-320a-1基因后在错配位置附近无法形成限制性内切酶Pvu II识别位点；当由C突变为T时，PCR扩增microRNA-320a-1基因后可形成Pvu II识别位点。通过琼脂糖凝胶电泳可以准确、快速的检测microRNA-320a-1基因单核苷酸多态性：CC基因型表现为188bp条带；CT基因型表现为188bp、168bp和20bp条带；TT基因型表现为168bp和20bp条带。可以对秦川牛群体的microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点的等位基因和基因型频率的变化进行监控。
同时，由于秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点的多态性与秦川牛体重、体长、十字部高等生长性状相互关联，本发明提供的检测方法为利用microRNA-320a-1基因SNP与生长性状的关系进行秦川牛肉用生长性状的标记辅助选择(MAS)奠定了基础，可快速建立遗传资源优良的秦川牛种群。
附图说明
图1为分型引物(引物对P2)设计思路示意图；
图2为错配引入PvuII酶切位点PCR产物酶切后鉴定秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点处单核苷酸多态性的电泳检测结果；其中DL500为Marker所在列。
图3为秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点处SNP的不同基因型(CC、CT、TT)测序图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明通过对秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点的单核苷酸多态性进行检测，以便用于中国秦川牛肉用生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的秦川牛种群。
1、秦川牛microRNA-320a-1基因含(rs518926539:C>T)突变的PCR引物的设计
以NCBI所公布的海福特牛(GCF_000003055.6)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增包含秦川牛microRNA-320a-1基因及其上下游各200bp的PCR引物对P1，其引物序列如下：
上游引物F1(SEQ.ID.NO.1)：CCGAGCCCAGCCTAGAGC 18nt；
下游引物R1(SEQ.ID.NO.2)：CGCACCCCTTCGCACCCA 18nt；
以上述引物对秦川牛基因组扩增，能够扩增秦川牛microRNA-320a-1基因的488bp片段，其中包含突变碱基的序列部分。
由于在此SNP位点处无自然酶切位点，不能通过直接酶切检测，而如果人工设计PCR引物错配，将CAGA(如图1下划线所示序列)错配为CAGC，在没有突变发生时，PCR扩增microRNA-320a-1基因后在错配位置附近无法形成限制性内切酶PvuII识别位点而由C突变为T时，PCR扩增microRNA-320a-1基因后可形成PvuII识别位点这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。所设计PCR扩增引物对P2为：
上游引物F2(SEQ.ID.NO.3)：TTCTCCCACGTTGCGTCCAGC 21nt；
下游引物R2(SEQ.ID.NO.4)：GCTCCCCTCCGCCTTCTCTT 20nt。
其中，上游引物第21bp的A被错配成C；引物对P2扩增的基因片段在引物对P1扩增的基因片段内部，大小是188bp，酶切分型后的电泳检测如图2所示。
2、以引物对P2 PCR扩增待测秦川牛的microRNA-320a-1基因片段
(1)秦川牛样本采集及基因组DNA提取
1)秦川牛样本的采集
本发明具体以中国优良秦川牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：陕西秦川牛(N＝227)，采集时间2014年6月；
表1.秦川牛样本的采集
2)血样基因组DNA的分离、提取
a)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；
b)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；
c)加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清。
d)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；
e)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
f)加氯仿、异戊醇混合液(24:1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；
g)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；
h)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；
i)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净；
j)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。
(2)PCR扩增
PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL或者2.0mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个200μL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；
PCR反应体系见表2：
表2.PCR反应体系
2×Taq PCR MasterMix 12.5μL 上游引物F2(10pmol/L) 0.5μL 下游引物R2(10pmol/L) 0.5μL DNA模板(50ng/μL) 1.0μL ddH2O 补足25μL
PCR反应程序：
3、Pvu II酶切消化PCR扩增的microRNA-320a-1基因片段
(1)Pvu II酶切反应消化体系(20μL)：17μL PCR产物，10×M buffer 2μL，Pvu II(15U/μL)为1μL；
(2)酶切消化条件：37℃恒温培养箱中消化过夜。
4、Pvu II消化PCR产物后琼脂糖凝胶电泳分析
(1)琼脂糖凝胶电泳
制作3％的琼脂糖凝胶，120V电压电泳50min，EB染色；
(2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；
(3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析SNP多态性：
用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，判断SNP的多态性：microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点发生由C到T的突变时，由于引入了碱基错配，PCR扩增microRNA-320a-1基因产物的序列为形成了限制性内切酶PvuII(CAG^CTG)的酶切位点；当没有发生突变时时，PCR扩增microRNA-320a-1基因产物的序列为限制性内切酶PvuII不能识别，这样就可以对该位点SNP多态性进行检测。秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点多态性的琼脂糖凝胶电泳结果为：CC基因型表现为188bp条带，CT基因型表现为188bp、168bp、20bp条带，TT基因型表现为168bp和20bp条带。由于20bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不易观察到，但通过188bp和168bp条带还是能够准确的鉴别CC基因型、CT基因型和TT基因型。如图2，不包含168bp条带为CC基因型个体，不包含188bp条带为TT基因型个体，同时包含188bp和168bp条带为CT基因型个体。
5、不同基因型个体PCR产物的测序验证
利用ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行SNP位置分析，结果见图3。包含188bp和168bp条带的杂合子CT基因型个体的测序结果的确为C或T，而CC基因型、TT基因型分别为C、T。
6、秦川牛种群microRNA-320a-1基因SNP位点的频率统计分析
(1)基因型频率
基因型频率是指一个群体中某种基因型个体数占总个体数的比率。
PCC＝NCC/N
PTT＝NTT/N
其中PCC、PTT代表某一位点的CC、TT基因型频率；NCC、NTT表示群体中具有CC、TT基因型的个体数；N为检测群体的总数量。
(2)等位基因频率
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：
PT＝(2NTT+NTT1+NTT2+NTT3+NTT4+……+NTTn)/2N
式中，PT表示等位基因T频率，NTT表示群体中具有TT基因型的个体数量，NTTi表示群体中具有TTi基因型个体数量，a1-an为等位基因T的n个互不相同的复等位基因。
本研究所涉及的等位基因为C和T，所以具体的基因频率计算公式为：
PC＝(2NCC+NGC)/2N
PT＝(2NTT+NGC)/2N
式中，PC，PT分别表示等位基因C和T等位基因的频率，NCC、NCT和NTT分别表示CC、CT和TT基因型的个体数量，N表示总群体数目。秦川牛microRNA-320a-1基因SNP中的C等位基因频率以及T等位基因频率如表3所示。
表3.秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点基因频率分布表
7、microRNA-320a-1基因SNP位点与秦川牛生长性状的相关性分析
(1)数据分析
测定的性状包括：体重，体高，体长，胸围，胸宽，胸深，坐骨端宽，腰角宽，十字部高，以及尻长。
关联分析一般线性的模型：用SPSS 17.0软件一般线性模型GLM(General LinearModels Procedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。依据本实验的其体情况建立如下统计模型：
Yijk＝μ+Ai+Gj+Eijk,
其中：Yijk：个体表型记录；μ：总体均数；Ai：年龄效应；Gj：基因型效应；Eijk：随机误差。
(2)关联分析结果
结果见表4。具有TT基因型的成年秦川牛个体在十字部高、体重上显著大于CT型个体(P<0.05)。以上结果表明，秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点不同基因型表型差异显著不同，如果倾向于选择体格高大、体重大的个体，应选择TT型。由此，在今后的育种工作中，可参考以上结果进行选种和淘汰，从而加快具有优质经济性状秦川牛种群的建立。
表4.秦川牛microRNA-320a-1基因(rs518926539:C>T)位点多态性与生长性状的关联分析
注：表中数值表示均值±标准误差。上角标具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，字母不同表示差异显著(P<0.05)。
核苷酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 秦川牛microRNA-320a-1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccgagcccag cctagagc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgcacccctt cgcaccca 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aactcccacg ttgcgtccag c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gctcccctcc gccttctctt 20