新型取代酰胺、其制备及应用 本发明涉及一种新型酰胺，它是酶的抑制剂，特别是对半胱氨酸蛋白酶，如钙蛋白酶(calpain)(=钙依赖性半胱氨酸蛋白酶)及其同功酶和组织蛋白酶例如B和L，等的抑制剂。
钙蛋白酶是源于所谓半胱氨酸蛋白酶类的细胞内蛋白水解酶，存在于多种细胞中。钙蛋白酶可因钙浓度增高而激活，这方面，钙蛋白酶Ⅰ或μ-钙蛋白酶不同于钙蛋白酶Ⅱ或m-钙蛋白酶，前者随钙离子的μ-摩尔浓度(增高)而激活，后者则随钙离子的m-摩尔浓度而激活(P.Johnson《国际生物化学会报》1990,22(8),811～22)。目前，还推测存在另一些钙蛋白酶同功酶(K.Suzuki等人，《生物化学。Hoppe-Seyler》1995,376(9),523～9)。
人们怀疑钙蛋白酶在各种生理过程中起重要作用。这些作用包括使调节蛋白发生断裂，例如导致蛋白激酶C、细胞支架蛋白，如MAP 2以及膜收缩蛋白、肌肉蛋白的分裂；蛋白断裂，例如在类风湿关节炎中的蛋白断裂、血小板激活过程中的蛋白断裂、神经肽代谢中的、有丝分裂中的蛋白断裂，以及其他M.J.Barrett等人在《生命科学》1991,48,1659～69以及K.K.Wang等人，《药理科学动态》1994,15,412～9中所列举的。
钙蛋白酶水平的升高已在下列各种病理生理过程中测出，例如局部缺血：心脏(例如，心肌梗死)的、肾脏的、或者中枢神经系统的(例如，“中风”)缺血；炎症、肌肉营养不良；眼睛内障；中枢神经系统的伤害(例如，损伤)、早老性痴呆等(例如参见，上面的K.K.Wang)。人们怀疑，这类疾病与细胞内钙水平的持续增高有关。结果，过度激活了钙依赖性过程，从而该过程不再接受生理调节作用。因此，钙蛋白酶的过度激活还会引发各种病理生理过程。
于是人们推断，钙蛋白酶酶的抑制剂可能对治疗这类疾病有用。各种各样地研究证实了这一点。譬如，Seung-Chyul Hong等人，《中风》1994,25(3),663-9以及R.T.Bartus等人，《神经学研究》，1995,17,249～58，也证明钙蛋白酶抑制剂在急性神经变性疾病或局部缺血，例如在脑中风以后出现的症状等方面的神经保护作用。同样，钙蛋白酶抑制剂还曾改善实验脑创伤以后出现的记忆力缺乏以及神经肌运动障碍的恢复(K.E.Saatman等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)》1996,93,3428～3433)。C.L.Edelstein等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)》19955,92,7662～6，发现钙蛋白酶抑制剂对缺氧引起肾损伤的保护作用。Yashida,Ken,Ischi等人，《Jap.Circ.J(日本循环系统会报)》1995,59(1),40～8，也成功地证明钙蛋白酶抑制剂对因局部缺血或再灌注引起心脏受损之后的有利效应。鉴于钙蛋白酶抑制剂能抑制β-AP4蛋白的释放，曾提出用它作为早老性痴呆的一种疗法的可能(J.Higaki等人，《Neuron(神经元)》，1995,14,651～59)。白细胞介素-1α的释放也受到钙蛋白酶抑制剂的抑制(N.Watanabe等人，《Cytokine》1994,6(6),597～601)。还发现，钙蛋白酶抑制剂显示出对癌细胞的细胞毒性效应(E.Shiba等人，“第20届国际乳腺癌研究协会研讨会”，Sendai，日本，1994,25～28,9月，《Int.J.Oncol.》5期(增补)，1994,381)。
钙蛋白酶抑制剂的另一些可能的用途载于K.K.Wang，《药理科学动态》，1994,15,412～8中。
钙蛋白酶抑制剂已见诸于文献描述。然而，这些主要是不可逆或者肽抑制剂。通常，不可逆抑制剂是烷基化物质，缺点在于，它们不加选择地作用于身体，或者不稳定。因此，这样的抑制剂经常表现出不希望的副作用，例如毒性，因此其使用受到限制或者不能使用。在不可逆抑制剂当中包括，例如环氧化物E 64(E.B.McGowan等人，《生物化学与生物物理研究通讯》1989,158,432～5)、α～卤代酮(H.Angliker等人，《药物化学会报》1992,35,216～20)或者二硫化物(R.Matsueda等人，《Chem.Lett.》1990,191～194)。
许多已知的可逆半胱氨酸蛋白酶如钙蛋白酶的抑制剂，是肽醛类，尤其是二肽醛和三肽醛，例如z-Val-Phe-H(MDL 28170)(S.Mehdi，《生物科学动态》1991,16,150～3)。在生理条件下肽醛的缺点在于，由于它们反应性过大故常常不稳定，会被迅速地代谢，并容易发生导致毒性效应的非特异反应(J.A.Fehrentz和B.Castro，《合成》1983,676～78)。
在JP 08183771(CA 1996,605307)和EP 520336中，描述了一种由4-哌啶酰胺和1-羰基哌啶-4-基酰胺衍生的醛类作为钙蛋白酶抑制剂。然而，文章所公开的醛，即由通式Ⅰ结构的杂原子芳族取代的酰胺衍生的，此前曾公开过。其他醛类衍生物描述在Chatterjee等人，《Bioorganic＆Medicinal Chemistry Letter(生物有机与药物化学文献)1997,7,287～290；Chatterjee等人，《生物有机与药物化学文献》1996,6,1619～1622；WO 97/10231及WO97/21690中。
肽酮衍生物也是半胱氨酸蛋白酶的，特别是钙蛋白酶的抑制剂。譬如，在丝氨酸蛋白酶的情况下，作为抑制剂的酮衍生物是已知的，但其酮基基团能被吸电子基团如CF3激活。在半胱氨酸蛋白酶的情况下，由CF3激活其酮基基团的衍生物既不非常活泼也不不活泼(M.R.Angelastro等人，《药物化学会报》1990,33,11～13)。令人惊奇的是，在钙蛋白酶的情况下据发现，迄今只有那些一方面在其α-位上的离去基团能导致不可逆抑制的，另一方面某种羧酸衍生物又可激活其酮基基团的酮衍生物，才是有效的抑制剂(参见，上面的M.R.Angelastro等人；WO 92/11850；WO 92,12140；WO 94/00095以及WO95/00535)。然而，在这些酮酰胺及酮酯当中，实际上只有肽衍生物据说有效(Zhaozhao Li等人，《药物化学会报》1993,36,3472～80；S.L.Harbenson等人《药物化学会报》1994,37,2918～29，还可参见上面的，M.R.Angelastro等人)。只有Chatterjee等人(见前面)描述了一种作为钙蛋白酶抑制剂的酮基苯甲酰胺的呫吨衍生物。
酮基苯甲酰胺在文献中是已知的。譬如，酮酯PhCO-Abu-COOCH2CH3描述在WO 91/09801、WO 94/00095以及92/11850中。类似的苯基衍生物Ph-CONH-CH(CH2Ph)-CO-COCOOCH3可见诸于M.R.Angelastro等人，《药物化学会报》1990,33,11～13，然而，却只是一种弱钙蛋白酶抑制剂。该衍生物还描述于J.P.Burkhardt,《Tetrahedron Lett.(四面体文献)》1988,3433～36中。然而，迄今，取代的苯甲酰胺的重要意义却从未被研究过。
在众多疗法中，例如关于中风的，该活性化合物是以灌注液形式通过静脉灌注给药的。为此，手头必须具备可用的物质，在这种情况下，钙蛋白酶抑制剂必须具有足够水溶解性方能制备灌注液。然而，所描述的许多钙蛋白酶抑制剂的缺点就在于，它们表现出很小的水溶性，或者根本不溶解，因此不适合静脉给药。这种类型的活性化合物只有采用助剂以赋予其水溶性，方能实现给药(参见，R.T.Bartus等人，《脑血流代谢会报》1994,14,537～544)。这类助剂，例如聚乙二醇，却常常具有副作用，或者甚至不可容忍。因此，非肽钙蛋白酶抑制剂由于无需助剂便可溶于水，可能在给药方面具有较好耐受性，故具有较大优势。高效力非肽钙蛋白酶抑制剂，又具有足够高的水溶性者，此前从未公开过，因此应算作新的。
在本发明中，描述了一种非肽醛类、酮羧酸酯类以及酮酰胺衍生物。这些化合物是新的，并且通过结合进刚性结构片段令人惊奇地展示制取对半胱氨酸蛋白酶，例如钙蛋白酶的高效非肽抑制剂的可能。再有，在通式Ⅰ的本发明化合物的情况下，由于全都带有至少1个脂族胺基团，因此能够与酸生成盐键。这将导致水溶性的改善，因此该化合物表现出静脉内给药所要求的基本性能，例如在中风疗法中所要求的。
本发明涉及一种通式Ⅰ的取代酰胺及其互变异构和异构形式、可能的对映及非对映异构形式，乃至可能的生理学容许的盐，其中诸变量的含义如下：
R1可以是C1～C6-烷基、苯基、萘基、喹啉基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基(pyridazyl)、喹唑啉基及喹喔啉基，其中的环可另外取代上最多2个基团R4，以及
R2是-(CH2)m-R8，其中R8可以是苯基、环己基-，或吲哚基，m=1～6，以及
X是一条键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH=CH-、-C≡C-、-CONH-、-SO2NH-以及
R1-X合在一起还可以是
以及
R3是氢、以及CO-NR6R7，
R4是氢，C1～C4-烷基，后者是支链或非支链的，以及-O-C1～C4-烷基；
R5是氢、C1～C4-烷基，后者是支链或非支链的，以及-O-C1～C4-烷基；
R6是氢、C1～C6-烷基，后者是支链及非支链的，以及
R7是氢、C1～C6-烷基，后者是支链或非支链的，以及
n是0、1或2的数值。
通式Ⅰ的化合物可以以外消旋的、以对映体意义的纯化合物或者以非对映异构体等形式使用。如果要求是对映体意义的纯化合物，则可采用适当光学活性碱或酸对通式Ⅰ化合物或其中间体实施经典的外消旋拆开以获得这样的化合物。另一方面，对映异构化合物也可采用市售化合物，例如光学活性氨基酸，如苯丙氨酸、色胺酸及酪氨酸来制备。
本发明还涉及与通式Ⅰ化合物之间的内消旋或互变异构的化合物，例如，那些在通式Ⅰ中的醛或酮基基团以烯醇互变异构形式存在的情况。
本发明还涉及可通过化合物Ⅰ与适当酸或碱起反应获得的化合物Ⅰ的生理学可接受盐。合适的酸和碱例如列举在《Fortschritter derArzneimittelforschung(药物研究进展)》1996中，Birkhuser出版公司，卷10,pp.224～285。这些化合物例如包括，盐酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、磷酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、马来酸、富马酸等，或者氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钾以及Tris。
本发明的酰胺Ⅰ，其中带有醛基团者，可采用各种各样的方式制备，它们可概括为合成路线1。
合成路线1羧酸Ⅱ与适当氨基醇Ⅲ连接起来生成相应的酰胺Ⅳ。这里采用惯用的肽偶联方法，这些方法描述于C.R.Larock的《综合有机转化》VCH出版，1989,p.972起；或者在Houben-Weyl，《有机化学方法》，第4版，E5，第Ⅴ章。反应优选采用“活化的”通式Ⅱ的酸衍生物，其中酸基团COOH已转化为COL。L是离去基团，例如Cl、咪唑或N-羟基苯并三唑。此种活化酸随后利用胺转化为酰胺Ⅳ。反应在无水、惰性溶剂，如二氯甲烷、四氢呋喃和二甲基甲酰胺中在-20～+250℃的温度下进行。
该羧酸酯Ⅳ(R’=O-烷基)借助酸，例如三氟乙酸或者盐酸或者碱例如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，在水介质或者在水与有机溶剂如醇或四氢呋喃的混合物中，在室温或提高的温度，如25～100℃下，转化为酸Ⅳ(R’=H)。
所获得的这些衍生物Ⅳ(R’=H)可氧化为本发明的醛衍生物Ⅰ。为此可采用各种各样惯用氧化方法。(参见，C.R.Larock，《综合有机转化》VCH出版，1989,p.604起)，例如Swern and Swern-类似物氧化方法(T.T.Tidwell，《合成》1990,857～70)，次氯酸钠(sodiumhypochlorid)/TEMPO(参见前面的S.L.Harbenson等人)或者Dess-Martin(有机化学会报，1983,48,4155)。这里所说的反应优选在诸如二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷之类的惰性非质子溶剂中，采用诸如DMSO/py x SO3或DMSO/草酰氯之类的氧化剂，在-50～+250C，具体根据所采用的方法(见前面的参考文献)，等条件下进行。
替代地，可令羧酸Ⅱ与氨基异羟肟酸衍生物Ⅵ起反应，生成苯甲酰胺Ⅶ。在这种情况下，采用与制备Ⅳ中相同的反应程序。该异羟肟酸衍生物Ⅵ可通过该(官能团)保护的氨基酸V与一种羟胺起反应制取。此种方法，也采用前面已描述的酰胺制备方法。该保护用基团X，例如Boc，的脱除，按照惯用方式，例如采用三氟乙酸来实施。如此获得的氨基异羟肟酸Ⅶ可通过还原转化为本发明的醛Ⅰ。该方法采用例如氢化锂铝作为还原剂，在-60～0℃的温度，在诸如四氢呋喃或乙醚之类的惰性溶剂中进行。
类似于前面最后一种方法，还可制成羧酸或羧酸衍生物，例如酯Ⅸ(Y=COOR’、COSR’)，该产物也同样可经过还原反应转化为本发明的醛Ⅰ。这些方法载于R.C.Larock，《综合有机转化》，VCH出版，1989，p.619～26。
本发明的取代酰胺Ⅰ，其中带有酮酰胺或酮酯基团者，的制备可按照各种各样的方式实施，概括为以下的合成路线2。
合成路线2羧酸Ⅱ与氨基羟基羧酸衍生物X起反应(关于Ⅺ的制备，可参见S.L.Harbenson等人，《药物化学会报》1994,37,2918～29或J.P.Burkhardt等人《四面体通讯》1988,29,3433～3436)按照惯用的肽偶联方法(参见上面，Houben-Weyl)，从而获得酰胺ⅩⅢ。
该羧酸酯ⅩⅢ(R’=O-烷基)可转化为酸ⅩⅢ(R’=H)：采用诸如三氟乙酸或盐酸之类的酸，或者诸如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾之类的碱在水介质或者在水与诸如醇或四氢呋喃之类有机溶剂的混合物中，在室温或提高的温度，例如25～100℃下进行。
所获得的衍生物ⅩⅢ可氧化为本发明的酮羧酸衍生物Ⅰ’。为此可采用各种各样惯用氧化反应(参见，C.R.Larock，《综合有机转化》VCH出版，1989,p.604起)，例如Swern and Swern-类似物氧化方法，优选用二甲基亚砜/吡啶-三氧化硫配合物，在诸如二氯甲烷或四氢呋喃之类的溶剂中，合适的话加入二甲基亚砜，在室温或-50～25℃的温度进行(T.T.Tidwell，《合成》1990,857～70)或者次氯酸钠/TEMPO(参见上面，S.L.Harbenson等人)。
如果Ⅺ是α-羟基酯(X=O-烷基)，则该化合物可水解生成羧酸Ⅻ，该反应按照类似于以上所描述的方法进行，但优选采用氢氧化锂在水/四氢呋喃混合物中，室温下，然而必须考虑到，在此种情况下，作为保护性基团R’，应选择诸如叔丁氧基，这样的基团允许选择性地裂解掉2个酯基团之一。另一种酰胺ⅩⅢ的制备是通过与胺，在上面已经提到的偶联条件下起反应实现的。该醇衍生物ⅩⅢ可再氧化为本发明的酮羧酸衍生物Ⅰ’。
羧酸酯Ⅱ的制备，某些情况已经描述过，或者可按照惯用化学方法进行。
其中X是一条键的化合物可采用惯用芳族偶联法，例如用硼酸衍生物和卤化物的Suzuki偶联法在钯催化作用下，或者通过芳族卤化物的铜催化偶联来制备。该烷基桥连的基团(X=-(CH2)m-)可通过类似的酮的还原，或者通过有机锂，如邻苯基噁唑烷的，或其以他有机金属化合物的烷基化来制备(参见I.M.Dordor等人，《J.Chem.Soc.PerkinTrans.I,1984,1247～52)。
链烯-及炔烃桥连的化合物，例如可采用Heck反应，由芳族卤化物与适当的链烯和炔烃来制备(参见，I.Sakamoto等人《Chem.Pharm.Bull.(药物化学公报)》，1986,34,2754～59)。
酰胺和磺酰胺可由胺和酸衍生物按照类似于上述方法来制备。
替代地，通式Ⅰ的化合物也可通过对路线1和2所列举的反应顺序做某种修改或交换来合成。例如，磺酰胺Ⅰ(R1X=RSO2NH)可由衍生物Ⅳ(R1X=NO2)出发来制备，即按惯用方式用氢气在催化剂下将硝基催化还原为胺，其中催化剂例如是钯/碳，然后令所获得的胺与磺酰氯起反应生成衍生物Ⅳ(R1X=RSO2NH)。进一步生成Ⅰ的反应是，如反应路线所示，酯的水解和氧化。类似地，中间体Ⅳ和Ⅺ(R1X=诸如硝基、氨基、卤素之类的化学基团)可转化为所含R1X对应于总权利要求中提到的另一些基团的衍生物。这种情况下的反应可按照类似于上面所描述的方法或者类似于普通或惯用的方法实施。
本发明涵盖的杂环取代的酰胺Ⅰ是半胱氨酸蛋白酶的抑制剂，特别是诸如钙蛋白酶Ⅰ和Ⅱ以及组织蛋白酶B和L的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
杂环取代的酰胺Ⅰ的抑制作用，采用文献中惯用的酶试验测定，其中以50％的酶活性受到抑制时的抑制剂浓度(=IC50)作为衡量其作用大小的尺度。按此方式测定了该酰胺Ⅰ对钙蛋白酶Ⅰ、钙蛋白酶Ⅱ以及组织蛋白酶B的抑制作用。
组织蛋白酶B试验
组织蛋白酶B的抑制能力按照类似于S.Hasnain等人，《生物化学会报》1993,268,235～40中的方法测定。
2μL抑制剂溶液，由抑制剂与DMSO配制(最终浓度：100μM～0.01μM)，被加入到88μL组织蛋白酶B(取自人体肝脏的组织蛋白酶B(Calbiochem公司)中，稀释到5单位每500μM缓冲剂)中。该混合物在室温(25℃)预先孵化60min，然后通过加入10μL 10mM Z-Arg-Arg-pNA(在含有10％DMSO的缓冲液中)启动反应。反应在“微滴定板读取器”中在405 nM处监测30 min。然后，根据最大梯度确定IC50。
钙蛋白酶Ⅰ和Ⅱ试验
钙蛋白酶抑制剂的抑制性能试验的程序如下：在缓冲剂中，采用50mM tris盐酸，pH7.5；0.1 M氯化钠；1 mM二硫苏糖醇(dithiotreitho1)；0.11 mM氯化钙，并采用发荧光的钙蛋白酶底物Suc-Leu-Tyr-AMC(25mM溶解在DMSO中，Bachem公司，瑞士)。从红细胞中分离出人体μ-钙蛋白酶，经过若干色谱处理步骤(DEAE-琼脂糖、苯基-琼脂糖、Superdex 200以及Blue琼脂糖)之后，获得纯度大于95％的酶，该评估方法按照SDS-PAGE，Western印迹分析法以及N-端基序列分析。在Spex-Fluorolog荧光光度计中在λex=380 nm和λem=460 nm处监测裂解产物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的荧光。在60min的测定范围内，底物的裂解呈线性，并且当实验在12℃的温度进行时钙蛋白酶的自催化活性很低。将抑制剂和钙蛋白酶底物加入到DMSO溶液形式的实验批料中，其中DMSO的最终浓度不应超过2％。
在一个实验批料中，先将10μL底物(最终250μM)，然后将10μLμ-钙蛋白酶(最终2μg/mL即18 nM)加入到1 mL装有缓冲液的比色杯中。对该底物的钙蛋白酶介导的裂解进行15～20 min的测定。然后，加入10μL抑制剂(50～100μM在DMSO中的溶液)，再针对裂解的抑制效果测定40min。
按照可逆抑制的经典公式确定Ki值：
Ki=I/(v0/vi)-1；其中Ⅰ=抑制剂浓度；v0=加入抑制剂以前的初始速度；vi=平衡状态的反应速度。
该速度是根据v=AMC的释放量/时间，即高度/时间，算出的。
钙蛋白酶是一种细胞内的半胱氨酸蛋白酶。钙蛋白酶抑制剂必须穿透细胞膜，才能阻止钙蛋白酶造成的细胞内蛋白断裂。某些已知的钙蛋白酶抑制剂，例如E64和leupeptin，只能困难地穿过细胞膜，因此，尽管它们是优良钙蛋白酶抑制剂，也只能对细胞产生很差的作用。目标是要找到一种具有较好膜-可进入性的化合物。我们利用人体血小板来证实钙蛋白酶抑制剂的膜-可进入性。
血小板中酪氨酸激酶pp60src由钙蛋白酶介导的断裂
血小板经过激活以后，用钙蛋白酶来裂解酪氨酸激酶pp60src。这一情况已由Oda等人在《生物化学会报》1993,268,12603～12608中做了详细描述。文章显示，pp60src的断裂可采用calpeptin，即一种钙蛋白酶的抑制剂予以防止。本发明物质的细胞有效性就是按照该文章进行试验的。新鲜人血经过以柠檬酸盐处理后，在200 g条件下离心处理15min。收集富血小板血浆，并以1∶1的血小板缓冲液(血小板缓冲液：68mM氯化钠、2.7mM氯化钾、0.5mM氯化镁x 6H2O、0.24mM磷酸二氢钠x H2O、12 mM碳酸氢钠、5.6mM葡萄糖、1mMEDTA,pH7.4)进行稀释。离心分离并以血小板缓冲液洗涤之后，将血小板调节到107个细胞/mL。人体血小板的分离是在室温进行的。
在该实验批料中，分离出的血小板(2×106)在37℃用不同浓度抑制剂(溶解在DMSO中)进行5min预孵化。然后用1μM离子载体A23187和5mM氯化钙将血小板激活。孵化5 min后，在13000rpm条件下迅速分离出血小板，然后该粒料置于SDS样品缓冲液(SDS样品缓冲液：20mM tris盐酸、5mM EDTA、5mM EGTA、1mMDTT、0.5mMPMSF、5μg/mL leupeptin、10μg/mL胃酶抑制素、10％甘油以及1％SDS)中进行提取。蛋白以12％浓度凝胶形式分离出来，而pp60src及其52 kDa和47 kDa裂解产物则按照Western印迹法进行鉴定。所使用的多克隆野兔抗体anti-Cys-src(pp60src)购自Biomol Feinchemikalien公司(汉堡)。该一次抗体，采用HRP-偶联的二次抗体(来自山羊)(Boehringer Mannheim，FRG)予以检测。按照已知的方法进行Western印迹试验。采用密度测定法对pp60src的断裂程度进行定量分析，所采用的对照样为非激活的血小板(对照样1：无断裂)以及以离子载体和钙激活的血小板(对照样2：对应于100％断裂)。ED50值对应于颜色反应强度降低50％时的抑制剂浓度。
谷氨酸盐诱导皮层神经元中的细胞死亡
该试验按照Choi D.W.,Maulucci-Gedde M.A.以及kriegsteinA.R.，“谷氨酸在皮层细胞培养物中的神经毒性”，《神经科学会报》1989,7,357～368中的方法进行。15日大的老鼠胚胎外皮被剖成两半，并通过酶法(胰蛋白酶)取得单个细胞。这些细胞(神经胶质及皮层神经元)被接种到24-点琼脂平面上。3日(laminin-涂布的平面)或7日(鸟氨酸-涂布的平面)之后，采用FDU(5-氟-2-脱氧尿苷)进行有丝分裂处理。细胞制备15日后，加入谷氨酸盐以诱导细胞死亡(15 min)。清除谷氨酸盐之后，加入钙蛋白酶抑制剂。24h后，通过对细胞培养物上层物中乳酸脱氢酶(LDH)的测定确定细胞损伤。
人们推测，钙蛋白酶也在细胞程序死亡中起作用(M.K.T.Squier等人《细胞生理学会报》1994,159,229～237；T.Patel等人，《FasebJournal》1996,590,587～597)。于是，在另一个模型中，在人体细胞系中，用在钙离子载体存在下诱导细胞死亡。钙蛋白酶抑制剂必须穿过细胞并抑制那里的钙蛋白酶，才能防止其诱导的细胞死亡。
NT2细胞中钙介导的细胞死亡
在人体细胞系NT2中的细胞死亡可由钙在离子载体A 23187存在下诱发。实验前20 h，在微滴定板上点滴上105个细胞/点。经过这20h后，该细胞用各种不同浓度抑制剂，在2.5μM离子载体以及5 mM钙存在下进行孵化。5h后，在反应批料中加入0.05mL XTT(细胞增殖试剂盒Ⅱ,Boehringer Mannheim)。大约17 h后，在Easy Reader EAR400(SLT公司)中测定光密度，方法按照制造商说明书。根据2个对照样，其中样品的细胞中未加入抑制剂，相应地在，不存在或存在离子载体条件下进行孵化的结果，确定一半细胞死亡所对应的光密度。
在大量神经学和心理学疾病中，出现谷氨酸盐活性的增高，这将导致中枢神经系统(CNS)处于过度刺激状态或受到中毒效应。谷氨酸盐导致这种效应需借助各种受体。这类受体中有2种可归纳为特殊的促效药NMDA受体和AMPA受体。因此，可采用抗拒此种谷氨酸盐介导效应的促效药来治疗这类疾病，特别是，对抗神经变性疾病例如享廷顿舞蹈病和帕金森氏疾病的神经毒性疾病，供氧不足、缺氧、局部缺血，以及在诸如中风或创伤之类的损伤之后的神经毒性疾病的治疗给药；或者替代地，作为抗癫痫药物(参见，《Arzneim.Forschung》1990,40,511～514,《TIPS》,1990,11,334～338；《未来药物》1989,14,1059～1071)。
防止兴奋氨基酸(在小鼠中的NMDA或AMPA拮抗作用)引起的大脑过度刺激的保护作用
由于兴奋氨基酸(EAA)在脑内给药的结果，将诱导大面积过度刺激，它将在短时间内引起例如动物(小鼠)的痉挛和死亡。这种症状可通过系统的，例如中枢活性化合物(EAA拮抗剂)的腹腔注射给药予以抑制。鉴于中枢神经系统的EAA受体的大量激活在各种神经学疾病发病中所起的重要作用，从EAA在活体内所展示的对抗作用得出结论，即，有可能利用这类物质来治疗这类型CNS(中枢神经系统)疾病。作为该物质效力的度量，测定了ED50，即，在这种给药水平，由于先前腹膜内给药该标准物质导致NMDA或AMPA的固定剂量的结果50％的动物症状消失。
杂环取代的酰胺Ⅰ是对半胱氨酸衍生物，如对钙蛋白酶Ⅰ或钙蛋白酶Ⅱ以及组织蛋白酶B或L的抑制剂，因此可用来控制与钙蛋白酶酶或组织蛋白酶的酶活性增高所引起的疾病。因此，本发明酰胺Ⅰ可用于治疗局部缺血引起的神经变性疾病、例如，因脉管闭塞创伤后再灌注引起的损伤、蛛网膜下出血、中风，以及诸如多发性梗塞、痴呆、早老性痴呆、享廷顿舞蹈病等神经变性疾病，以及癫痫，乃至用于治疗心肌局部缺血后的心脏受损、肾脏局部缺血后的肾脏损伤、骨骼肌损伤、肌肉营养不良、平滑肌细胞增生后出现的损伤、冠状血管痉挛、脑血管痉挛、眼睛内障、血管成形术之后血流再狭窄。再有，该酰胺Ⅰ还可用于癌肿及其转移的化学疗法以及用于治疗出现白细胞介素-1水平增高的疾病，例如炎症和风湿等疾病。
除了一般药物辅剂之外，本发明药物制剂包含有疗效数量的化合物Ⅰ。
作为局部外用，例如粉末、软膏或喷雾剂等形式，该活性化合物可按照习惯浓度包含在制剂内。一般地，该活性化合物的含量介于0.001～1wt％，优选0.001～0.1wt％。
在内服情况下，该制剂可以单个剂量形式给药。每千克体重提供0.1～100mg的单个剂量。该制剂可按每天一次或多次剂量投药，视疾病的性质和严重程度而定。
按照要求类型的投药，本发明药物制剂除包含该活性化合物之外还包含惯用赋形剂和稀释剂。作为局部外用，可使用药物助剂例如，乙醇、异丙醇、乙氧基化蓖麻油、乙氧基化氢化蓖麻油、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚乙二醇硬脂酸酯、乙氧基化脂族醇、石蜡油、凡士林以及羊毛脂。作为内服，合适的例如是乳糖、丙二醇、乙醇、淀粉、滑石粉以及聚乙烯基吡咯烷酮。
另外还包含抗氧剂，例如生育酚及丁基化羟基苯甲醚，以及丁基化羟基甲苯、调味剂、稳定剂、乳化剂和润滑剂。
除了该活性化合物及在药物制剂生产中通常使用的物质之外，该制剂所包含的物质都应是毒理学可接受以及与相应活性化合物相容的。该药物制剂可按照惯用方法，例如将该活性化合物与其他惯用赋形剂和稀释剂进行混合来制备。
该药物制剂可按各种给药程序投药，例如口服、肠胃以外地，如静脉输注、皮下给药、腹膜内以及局部给药。因此，诸如片剂、乳剂、灌注以及注射液、糊剂、软膏、凝胶、乳膏、洗剂、粉末以及喷雾剂等药物制剂形式均可。
实施例
实例1
(S)-3-羧基-5-(2-萘磺酰氨基)-N-(3-苯基丙-1-醛-2-基)苯甲酰胺
a)(S)-3-(乙氧基羰基-5-硝基-N-(3-苯基丙-1-醇-2-基)-苯甲酰胺
10g(41.8mmol)5-硝基间苯二甲酸单乙基酯、6.3g(41.8mmol)(S)-苯丙氨醇(phenylalaninol)及10.6g(104.5mmol)三乙胺，在室温下溶解在200mL二氯甲烷中，并搅拌30min。随后，在冰冷却下加入1.9g(13.9mmol)1-羟基苯并三唑，然后分数份加入8g(41.6mmol)(N-二甲氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺。整个混合物在室温搅拌16h。反应批料以二氯甲烷稀释到2倍的体积，随后相继以2M盐酸、水、2M氢氧化钠溶液并再次用水进行洗涤。分离出有机相，在减压下干燥并浓缩。获得9.1g中间产物。
b)(S)-5-氨基-3-乙氧基羰基-N-(3-苯基丙-1-醇-2-基)苯甲酰胺
9g(24.3mmol)中间产物1a，溶解在300mL乙醇中，加入1g钯/碳(10％浓度)之后进行氢化。然后，反应批料经过过滤，滤液在减压下浓缩。获得8.1g中间产物。
c)(S)-3-乙氧基羰基-5-(2-萘磺酰氨基)-N-(3-苯基丙-1-醇-2-基)苯甲酰胺
2g(5.84mmol)中间产物1b和2.4mL(17.4mmol)三乙胺，溶解在50mL四氢呋喃中。然后，在0℃下滴加1.32g(5.82mmol)2-萘磺酰氯溶于30mL四氢呋喃的溶液，随后，反应批料在40℃搅拌8h。然后，反应批料在减压下浓缩，于是残留物分配在水与乙酸乙酯之间。该乙酸乙酯相另外以2M盐酸和水洗涤，然后在减压下干燥并浓缩。如此获得的残留物在硅胶上进行色谱术提纯(洗脱液：二氯甲烷/乙醇=20/1)，于是获得0.65g中间产物。
d)(S)-3-羧基-5-(2-萘磺酰氨基)-N-(3-苯基丙-1-醇-2-基)苯甲酰胺
0.65g(1.2mmol)中间产物1c，溶解在30 mL四氢呋喃中，并以0.15g(6.3mmol)氢氧化锂溶于15mL水的溶液进行处理。整个混合物在室温搅拌26h。减压下赶出有机溶剂，含水残余物以2M盐酸进行酸化。抽滤出获得的沉淀并干燥。获得0.46g中间产物。
e)(S)-3-羧基-5-(2-萘磺酰氨基)-N-(3-苯基丙-1-醛-2-基)苯甲酰胺
0.46g(0.91mml)中间产物化合物1d和0.37g(3.65mmol)三乙胺，溶解在10mL无水二甲基亚砜中并以0.44g(2.76mmol)吡啶/三氧化硫配合物处理。整个混合物在室温搅拌16h。反应混合物随后倒入到冰水中，以1M盐酸进行酸化，抽滤出沉淀。获得0.36g产物。1H-NMR(D6-DMSO):δ=2.9(1H),3.3(1H),4.5(1H),7.2(5H),7.6-7.9(5H),8.0-8.2(4H),8.5(2H),9.1(1H),9.6(1H)和10.9(1H)ppm.
实例2
N-(1-氨基甲酰基-2-氧代-4-苯基丙-2-基)-3-羧基-5-(2-萘磺酰氨基)苯甲酰胺
a)N-(1-氨基甲酰-2-羟基-4-苯基丙-2-基)-3-乙氧基羰基-5-硝基苯甲酰胺
5.2g(21.7mmol)5-硝基间苯二甲酸单乙基酯、5g(21.7mmol)3-氨基-2-羟基-3-苯基丁酰胺以及11.2g(110.5mmol)三乙胺，室温下溶解在200mL二氯甲烷中并搅拌30min。在冰冷却下加入2.9g(21.6mmol)1-羟基苯并三唑，随后分数份加入4.6g(22.8mmol)(N-二甲基-氨基丙基)-N-乙基碳化二亚胺。整个混合物在室温搅拌16h。反应批料以二氯甲烷稀释到2倍体积，随后相继用2M盐酸、水、2M氢氧化钠溶液并再次用水进行洗涤。分离出有机相，在减压下干燥并浓缩。获得2.6g中间产物。
b)5-氨基-N-(1-氨基甲酰基-2-羟基-4-苯基丙-2-基)-3-乙氧基羰基苯甲酰胺
2.6g(6.25mmol)中间产物2a，溶解在50mL二甲基甲酰胺中，以200mL乙醇稀释，在加入1g钯/碳(10％浓度)之后进行氢化。反应批料随后过滤，滤液在减压下浓缩。获得1.8g中间产物。
c)N-(1-氨基甲酰基-2-羟基-4-苯基丙-2-基)-3-乙氧基-羰基-5-(2-萘磺酰氨基)苯甲酰胺
1.8g(4.7mmol)中间产物2b和一勺尖4-二甲氨基吡啶，溶解在30mL吡啶中。在室温下滴加1.2g(5.1mmol)萘磺酰氯，整个混合物另外再搅拌16h。随后，反应批料倒入到冰水中并以2M盐酸进行酸化。以乙酸乙酯萃取该水相若干次。合并的有机相在减压下干燥并浓缩。如此获得的残余物另外相继以乙醚和少量乙酸乙酯进行处理。获得1.3g中间产物。
d)N-(1-氨基甲酰基-2-羟基-4苯基丙-2-基)-3-羧基-5-(2-萘磺酰氨基)苯甲酰胺
1.25g(2.2mmol)中间产物3c，溶解在10mL四氢呋喃中并以0.21g(8.7mmol)氢氧化锂溶于50 mL水的溶液进行处理。整个混合物在室温搅拌1 h。然后，在减压下赶出溶剂，含水残余物以2M盐酸进行酸化。抽滤出形成的沉淀并干燥。获得1.0g中间产物。
e)N-(1-氨基甲酰基-2-氧代-4-苯基丙-2-基)-3-羧基-5-(2-萘磺酰氨基)苯甲酰胺
0.9g(1.6mmol)中间产物化合物2d和1.4mL(9.9mmol)三乙胺，溶解在25 mL无水二甲基亚砜中，并在室温以0.78g(4.9mmol)吡啶/三氧化硫配合物溶于13mL二甲基亚砜的溶液进行处理。整个混合物在室温搅拌1h。然后，反应混合物倒入到冰水中，以1M盐酸进行酸化，抽滤出沉淀，于是获得0.59g产物。1H-NMR(CF3,COOD):δ=2.9(1H),3.1(1H),5.3(1H),7.0-8.3(17H),8.4(1H)和9.1(1H)ppm。
下面的实施例可按照类似于上面的程序制备：
实施例 R’ R2 R3 R1X 2 3-COOH (CH2)3CH3 CONH2 5-萘-2-基-SO2NH 3 3-COOH CH2Ph H 5-苯基-SO2NH 4 3-COOH CH2Ph CONH2 5-苯基-SO2NH 5 3-COOH CH2Ph H 5-n-丁基-SO2NH 6 3-COOH CH2Ph CONH2 5-n-丁基-SO2NH 7 4-COOH CH2Ph H 3-苯基-SO2NH 8 4-COOH CH2Ph H 5-萘-2-基-SO2NH 9 4-COOH CH2Ph CONH2 5-萘-2-基-SO2NH10 4-COOH CH2Ph H 3-CH=CH-苯基11 4-COOH CH2Ph H 3-(吡啶-2-基)12 3-COOH CH2Ph H 4-CH=CH-苯基
如果R3=H，则C2原子的构型是(S)；在R3=CONH2的情况下，则是(R,S)。