技术领域
本发明生物技术领域，具体地涉及一种人类微卫星不稳定性MSI检测扩增引物组合物及试剂盒。
背景技术
微卫星是广泛分布于人类基因组中单个、两个、三个甚至更多个的串联重复核苷酸序列。微卫星不稳定性MSI的产生是由于DNA错配修复系统(MMR)缺陷导致的微卫星序列丢失或增加，出现新的微卫星等位基因，它与MMR基因的异常相关。临床研究表明：微卫星高不稳定性(MSI-H)的Ⅱ期结直肠癌患者预后较好，但不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗中获益；MSI检测有助于辅助诊断遗传性非息肉病性结直肠癌HNPCC(林奇综合征)。实验室常用的MSI检测方法：荧光多重PCR片段分析法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人类微卫星不稳定性MSI检测扩增引物组合物及试剂盒。
本发明提供的技术方案如下：
一种人类微卫星不稳定性MSI检测扩增引物组合物，包括检测如下位点的引物对：
NR-24-F:5’-GCTGAATTTTACCTCCTGACT-3’(SEQ ID NO.1)
NR-24-R：5’-CGGAGATTGTGCCATTGCA-3’(SEQ ID NO.2)
BAT-25-F：5’-CGCCTCCAAGAATGTAAGTG-3’(SEQ ID NO.3)
BAT-25-R：5’-TTCTGCATTTTAACTATGGCTCT-3’(SEQ ID NO.4)
CAT-25-F：5’-TTATTGTTTTCAACCTAGAAACC-3’(SEQ ID NO.5)
CAT-25-R：5’-CAGTGAGCTGAGATCGTG-3’(SEQ ID NO.6)
BAT-26-F：5’-CTTATCAGATGATTCCAACTTTG-3’(SEQ ID NO.7)
BAT-26-R：5’-GCTTCTTCAGTATATGTCAATGA-3’(SEQ ID NO.8)
MONO-27-F：5’-GAGACAGAGCAAGACTCT-3’(SEQ ID NO.9)
MONO-27-R：5’-GTTCTGTCTCCTTTCTTAAGG-3’(SEQ ID NO.10)
Penta D-F：5’-GAGCCTGGAAGGTCGAA-3’(SEQ ID NO.11)
Penta D-R：5’-GAAATATTTGCCTAACCTATGGTC-3’(SEQ ID NO.12)
Penta E-F：5’-GACTGAGCAAGACTCAGTCT-3’(SEQ ID NO.13)
Penta E-R：5’-GATTACATAACATACATGTGTGTAAA-3’(SEQ ID NO.14)
本发明的又一技术方案为：
一种人类微卫星不稳定性MSI检测扩增体系，包括前述的扩增引物组合物。
本发明试剂盒由荧光标记特异性引物、PCR缓冲液、核苷酸单体(dNTPs)等成分组成，以荧光多重PCR技术为基础，检测人类细胞中微卫星不稳定性MSI状态。试剂盒含有7对荧光标记特异性引物，分别扩增5个单核苷酸重复标志物和2个五核苷酸重复标志物(详见表1)。5个单核苷酸重复标志物分别为NR-24、BAT-25、CAT-25、BAT-26、MONO-27，这些标志物均为准单态性，即群体中几乎所有个体该位点为同一等位基因纯合状态。2个五核苷酸重复标志物为Penta D和Penta E，具有较高的多态性和较低的微卫星不稳定性，用于判断肿瘤组织和正常组织是否来源于同一个患者。PCR扩增产物用ABI3500Dx基因分析仪进行毛细管电泳分离，结果数据用GeneMapper软件分析确定微卫星不稳定性状态。
本发明的试剂盒优点如下：
1、所需样本量少，可同时检测五个单核苷酸标志物变异情况，定性检测微卫星不稳定性状态；
2、带有质控样本是否来源于同一患者的两个五核苷酸重复标志物，避免样本混淆错误；
3、操作简便，结果判读客观简单。
附图说明
图1为使用本发明试剂盒微卫星稳定性(MSS)样本BAT-25与Penta D标志物毛细管电泳图；
图2为使用本发明试剂盒微卫星稳定性(MSS)样本MONO-27、CAT-25与BAT-26标志物毛细管电泳图；
图3为使用本发明试剂盒微卫星稳定性(MSS)样本NR-24与Penta E标志物毛细管电泳图；
图4为使用Promega试剂盒微卫星稳定性(MSS)样本BAT-26与Penta D标志物毛细管电泳图；
图5为使用Promega试剂盒微卫星稳定性(MSS)样本NR-21、BAT-25与MONO-27标志物毛细管电泳图；
图6为使用Promega试剂盒微卫星稳定性(MSS)样本NR-24与Penta C标志物毛细管电泳图；
图7为使用本发明试剂盒微卫星高不稳定性(MSI-H)样本BAT-25与Penta D标志物毛细管电泳图；
图8为使用本发明试剂盒微卫星高不稳定性(MSI-H)样本MONO-27、CAT-25与BAT-26标志物毛细管电泳图；
图9为使用本发明试剂盒微卫星高不稳定性(MSI-H)样本NR-24与Penta E标志物毛细管电泳图；
图10为使用Promega试剂盒微卫星高不稳定性(MSI-H)样本BAT-26与Penta D标志物毛细管电泳图；
图11为使用Promega试剂盒微卫星高不稳定性(MSI-H)样本NR-21、BAT-25与MONO-27标志物毛细管电泳图；
图12为使用Promega试剂盒微卫星高不稳定性(MSI-H)样本NR-24与Penta C标志物毛细管电泳图；
具体实施方式
本试剂盒由荧光标记特异性引物、PCR缓冲液、核苷酸单体(dNTPs)等成分组成，以荧光多重PCR技术为基础，检测人类细胞中微卫星不稳定性MSI状态。试剂盒含有7对荧光标记特异性引物，分别扩增5个单核苷酸重复标志物和2个五核苷酸重复标志物(详见表1)。5个单核苷酸重复标志物分别为NR-24、BAT-25、CAT-25、BAT-26、MONO-27，这些标志物均为准单态性，即群体中几乎所有个体该位点为同一等位基因纯合状态。2个五核苷酸重复标志物为Penta D和Penta E，具有较高的多态性和较低的微卫星不稳定性，用于判断肿瘤组织和正常组织是否来源于同一个患者。PCR扩增产物用ABI3500Dx基因分析仪进行毛细管电泳分离，结果数据用GeneMapper软件分析确定微卫星不稳定性状态。
主要组成成分
本试剂盒提供1管MSI-PCR反应液，1管MSI质控品、1管MSI-Taq酶及1管内标ILS600(详见表2)。需要自备的试剂：ABI3500Dx基因分析仪光谱校正试剂、核酸提取试剂、无核酸酶纯化水、Hi-Di甲酰胺。MSI质控品为细胞系H1975所提取的DNA，质控品相应Markers等位基因大小见表1。
表1.微卫星不稳定性MSI检测试剂盒标志物信息
表2.试剂盒组成
适用仪器
PCR仪：Bio-Rad T100Thermal Cycler、ABI2720Thermal Cycler或GeneAmp 9700Thermal Cycler。
基因分析仪：ABI3500Dx Genetic Analyzer。
表3.各引物对
NR-24-F: 5’-GCTGAATTTTACCTCCTGACT-3’ NR-24-R： 5’-CGGAGATTGTGCCATTGCA-3’ BAT-25-F： 5’-CGCCTCCAAGAATGTAAGTG-3’ BAT-25-R： 5’-TTCTGCATTTTAACTATGGCTCT-3’ CAT-25-F： 5’-TTATTGTTTTCAACCTAGAAACC-3’ CAT-25-R： 5’-CAGTGAGCTGAGATCGTG-3’ BAT-26-F： 5’-CTTATCAGATGATTCCAACTTTG-3’ BAT-26-R： 5’-GCTTCTTCAGTATATGTCAATGA-3’ MONO-27-F： 5’-GAGACAGAGCAAGACTCT-3’ MONO-27-R： 5’-GTTCTGTCTCCTTTCTTAAGG-3’ Penta D-F： 5’-GAGCCTGGAAGGTCGAA-3’ Penta D-R： 5’-GAAATATTTGCCTAACCTATGGTC-3’ Penta E-F： 5’-GACTGAGCAAGACTCAGTCT-3’ Penta E-R： 5’-GATTACATAACATACATGTGTGTAAA-3’
样本处理
1.检测所用DNA优选使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的核酸提取试剂(①型号：FFPE DNA，Cat NO.ADx-FF01；②型号：新鲜血液DNA，Cat NO.ADx-BL01)，所提DNA的OD260/OD280应在1.8～2.1范围内。提取完的DNA立即进行检测，否则于-20±5℃保存，保存时间不超过6个月。
2.检测样品推荐使用石蜡包埋病理组织或切片，取样组织应经病理质控确定至少含有30％肿瘤病变组织，所用石蜡包埋病理组织或切片样品选择保存尚未超过2年的样品。
3.对照正常组织可以是癌旁组织或全血，癌旁组织需经病理质控不含有肿瘤组织，全血样本一般不少于5mL，优选使用EDTA抗凝采血管或使用厦门艾德生物医药科技股份有限公司生产的一次性真空采血管(Cat NO.ADx-VT01)采集样本，禁止使用肝素抗凝。
检验方法
1.PCR扩增
(1)取出MSI质控品和MSI-PCR反应液解冻，振荡混匀后与MSI-Taq酶快速离心5秒待用。
(2)分装：根据样本、MSI质控品及阴性对照(NTC，自备无核酸酶纯化水)所需反应管总数，按每测试中含20μL MSI-PCR反应液和0.40μL MSI-Taq酶的比例将两者混合，振荡混匀5-10秒，快速离心5-10秒，以每管20μL分装到PCR反应管中。建议每次多算一份的量混合。(推荐在冰盒上操作)
(3)加样：相应加入5μL待检样品DNA(肿瘤组织提取DNA、正常对照组织或白细胞提取DNA)、5μL MSI质控品和5μL阴性对照，快速离心5-10秒。待检样本DNA推荐稀释至5ng/μL，应根据每个实验室不同情况摸索最适合DNA上样量。
上机前确认PCR管内总体积为25uL(20uL试剂加5uL模板)。
(4)将PCR反应管放入PCR仪。
(5)反应程序设置：
第一阶段：95℃ 5min 1个循环；
第二阶段：95℃ 25s 62℃ 40s 65℃ 30s 10个循环；
第三阶段：93℃ 25s 58℃ 40s 65℃ 30s 21个循环；
第四阶段：65℃ 10min 1个循环，4℃/∞。
2.毛细管电泳分离
(1)光谱校正，采用PromegaMatrix Standards 3100/3130(Cat.#DG4650)光谱校正试剂盒对ABI3500Dx基因分析仪进行光谱校正，详细操作参照校准试剂盒说明书。
(2)检测体系配制，按每管0.2μL内标ILS600，9μL Hi-Di甲酰胺(自备)混匀后加入96孔板中，每孔分装9μL，分别加入1μL待检样本、NTC及MSI质控品PCR扩增产物。95℃变性3min，迅速置于冰上或4℃2min，准备上机。
(3)上机检测，将96孔板安装至板架上，放置于基因分析仪托盘上，
打开数据收集软件，建板命名，设置运行参数，选择片段分析默认程序，连板运行，详细操作请参照基因分析仪说明书。
(4)数据分析，将结果数据导入分析软件GeneMapper中，建立文件，命名，选择分析方法(微卫星默认程序)、内标ILS600及Panel，点击分析。
阳性判断值及检验结果的解释
1.阴性对照NTC的7对引物均无产物扩增出。若其中任意一对引物有产物扩增出，此次实验结果无效，建议重新检测。
2.MSI质控品的7对引物必须有产物扩增出，片段大小与表1所列的一致或相差不超过3bp，若任一对引物无产物扩增出，此次实验结果无效，建议重新检测。
3.所有待检样本(肿瘤组织和正常对照组织)7对引物均需有产物扩增出，片段大小在有效范围内。以正常组织扩增的荧光峰图做对照，肿瘤组织与正常组织的两个五核苷酸重复标志物Penta D和Penta E片段大小需要一致，表明肿瘤组织与正常组织来源于同一患者，若不一致，可能由于样本混淆，需要重复实验；五个单核苷酸重复标志物用于结果判定(详见表4)。结果判定采用美国国家癌症研究所NCI工作组推荐标准，片段大小发生改变标准参考文献资料确定。
表4.结果判定
总体积25μL，各组分浓度
优选的体系为：
总体积25μL，各组分浓度
终浓度范围 无核酸酶纯化水 PCR缓冲液pH9.0 1.0× 25mM MgCl2 2.0mM 25mM dNTPs 0.2mM NR-24-F(100μM) 0.075μM NR-24-R(100μM) 0.075μM BAT-25-F(100μM) 0.055μM BAT-25-R(100μM) 0.055μM CAT-25-F(100μM) 0.035μM CAT-25-R(100μM) 0.035μM BAT-26-F(100μM) 0.20μM BAT-26-R(100μM) 0.20μM MONO-27-F(100μM) 0.04μM MONO-27-R(100μM) 0.04μM PentaD-F(100μM) 0.04μM PentaD-R(100μM) 0.04μM PentaE-F(100μM) 0.12μM PentaE-R(100μM) 0.12μM Taq-HS(5U/μL) 2.0U
以下为实施例
实施例1
一例样本(样本1)肿瘤与癌旁FFPE组织采用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的核酸提取试剂盒(Cat NO.ADx-FF01)，按照试剂盒说明书操作提取样本DNA。肿瘤组织提取DNA浓度为241.3ng/μL，癌旁组织提取DNA浓度为49.05ng/μL，将DNA浓度分别稀释至5ng/μL与2ng/μL备用。
采用人类为卫星不稳定性MSI检测试剂盒(PCR片段分析法)和Promega MSI Analysis system，version1.2两个试剂盒，根据各试剂盒说明书同时对样本1的肿瘤与癌旁组织提取DNA进行扩增。
人类微卫星不稳定性MSI检测试剂盒(PCR片段分析法)操作步骤：取出MSI-PCR反应液与MSI质控品，解冻后取80μL MSI-PCR反应液，加入1.6μL MSI-Taq酶，振荡约5～10s混匀后瞬时离心，分装PCR八联管每孔20μL，依次加入5μL无核酸酶纯化水，5ng/μL肿瘤组织DNA、5ng/μL癌旁组织DNA及MSI质控品，盖上八联管管盖后瞬时离心，置于ABI2720Thermal Cycler上，设置PCR程序运行。运行结束后取1μL PCR产物于ABI3500Dx基因分析仪进行毛细管电泳分离，导出数据用GeneMapper软件分析。结果见图1至图3：
根据说明书判读标准进行结果判读：毛细管电泳图中，上图为癌旁正常对照组织峰图，下图为肿瘤组织峰图，横坐标代表扩增产物片段大小，纵坐标代表扩增产物量(荧光强度)。无核酸酶纯化水(NTC)无产物扩增出，MSI质控品的7个生物标志物均有产物扩增出，且片段大小与表1对应的大小一致。肿瘤组织与正常组织的两个五核苷酸标志物Penta D与Penta E扩增片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，肿瘤组织5个单核苷酸标志物BAT-25、MONO-27、CAT-25、BAT-26和NR-24均未发生片段大小改变，因此样本1的微卫星不稳定性MSI状态为微卫星稳定性(MSS)。
Promega MSI Analysis system，version1.2操作步骤：取出Gold ST
R 10×Buffer、MSI 10×Primer Pair Mix和Nuclease-Free Water，解冻后每人份PCR反应体系按表5配制：
表5 Promega MSI PCR反应体系
PCR反应Mix配制完成后振荡约5～10s混匀后瞬时离心，分装PCR八联管每孔8μL，依次加入2μL无核酸酶纯化水，2ng/μL肿瘤组织DNA、2ng/μL癌旁组织DNA及K562阳性质控品，盖上八联管管盖后瞬时离心，置于GeneAmp PCR System 9700上(注：仅适用于GeneAmp PCR System 9700)，设置PCR程序运行。运行结束后取1μL PCR产物于ABI3500Dx基因分析仪进行毛细管电泳分离，导出数据用GeneMapper软件分析。结果见图4至图6：
判读标准一致：毛细管电泳图中，上图为癌旁正常对照组织峰图，下图为肿瘤组织峰图，横坐标代表扩增产物片段大小，纵坐标代表扩增产物量(荧光强度)。无核酸酶纯化水(NTC)无产物扩增出，K562质控品的7个生物标志物均有产物扩增出，且片段大小在合理的范围内。肿瘤组织与正常组织的两个五核苷酸标志物Penta C与Penta D扩增片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，肿瘤组织5个单核苷酸标志物BAT-26、NR-21、BAT-25、MONO-27和NR-24均未发生片段大小改变，样本1的微卫星不稳定性MSI状态为微卫星稳定性(MSS)。需要注意到，样本1的NR-21单核苷酸标志物肿瘤组织与癌旁对照峰图均发生5bp片段大小改变，若无癌旁组织做对照，则该例样本判读结果为微卫星低不稳定性(MSI-L)，因此NR-21单核苷酸标志物在中国人群体中为非准单态性。
实施例2
一例样本(样本2)肿瘤与癌旁FFPE组织采用厦门艾德生物医药科技股份有限公司的核酸提取试剂盒(Cat NO.ADx-FF01)，按照试剂盒说明书操作提取样本DNA。肿瘤组织提取DNA浓度为258.7ng/μL，癌旁组织提取DNA浓度为96.2ng/μL，将DNA浓度分别稀释至5ng/μL与2ng/μL备用。
采用人类为卫星不稳定性MSI检测试剂盒(PCR片段分析法)和Promega MSI Analysis system，version1.2两个试剂盒，根据各试剂盒说明书同时对样本1的肿瘤与癌旁组织提取DNA进行扩增。
人类微卫星不稳定性MSI检测试剂盒(PCR片段分析法)操作步骤：取出MSI-PCR反应液与MSI质控品，解冻后取80μL MSI-PCR反应液，加入1.6μL MSI-Taq酶，振荡约5～10s混匀后瞬时离心，分装PCR八联管每孔20μL，依次加入5μL无核酸酶纯化水，5ng/μL肿瘤组织DNA、5ng/μL癌旁组织DNA及MSI质控品，盖上八联管管盖后瞬时离心，置于ABI2720Thermal Cycler上，设置PCR程序运行。运行结束后取1μL PCR产物于ABI3500Dx基因分析仪进行毛细管电泳分离，导出数据用GeneMapper软件分析。结果见图7至图9：
根据说明书判读标准进行结果判读：毛细管电泳图中，上图为癌旁正常对照组织峰图，下图为肿瘤组织峰图，横坐标代表扩增产物片段大小，纵坐标代表扩增产物量(荧光强度)。无核酸酶纯化水(NTC)无产物扩增出，MSI质控品的7个生物标志物均有产物扩增出，且片段大小与表1对应的大小一致。肿瘤组织与正常组织的两个五核苷酸标志物Penta D与Penta E扩增片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，肿瘤组织5个单核苷酸标志物BAT-25发生5bp片段大小改变，MONO-27发生8bp片段大小改变，CAT-25发生5bp片段大小改变，BAT-26发生7bp片段大小改变，NR-24发生6bp片段大小改变，因此样本2的微卫星不稳定性MSI状态为微卫星高不稳定性(MSI-H)。
Promega MSI Analysis system，version1.2操作步骤：取出Gold ST
R 10×Buffer、MSI 10×Primer Pair Mix和Nuclease-Free Water，解冻后每人份PCR反应体系根据表5配制。PCR反应Mix配制完成后振荡约5～10s混匀后瞬时离心，分装PCR八联管每孔8μL，依次加入2μL无核酸酶纯化水，2ng/μL肿瘤组织DNA、2ng/μL癌旁组织DNA及K562阳性质控品，盖上八联管管盖后瞬时离心，置于GeneAmp PCR System 9700上(注：仅适用于GeneAmp PCR System 9700)，设置PCR程序运行。运行结束后取1μL PCR产物于ABI3500Dx基因分析仪进行毛细管电泳分离，导出数据用GeneMapper软件分析。结果见图10至图12：
判读标准一致：毛细管电泳图中，上图为癌旁正常对照组织峰图，下图为肿瘤组织峰图，横坐标代表扩增产物片段大小，纵坐标代表扩增产物量(荧光强度)。无核酸酶纯化水(NTC)无产物扩增出，K562质控品的7个生物标志物均有产物扩增出，且片段大小在合理的范围内。肿瘤组织与正常组织的两个五核苷酸标志物Penta C与Penta D扩增片段大小均一致，表明肿瘤组织与癌旁对照均来源于同一患者。以正常组织峰图作对照，肿瘤组织5个单核苷酸标志物BAT-26发生7bp片段大小改变，NR-21发生6bp片段大小改变，BAT-25发生5bp片段大小改变，MONO-27发生6bp、11bp片段大小改变，NR-24发生7bp片段大小改变，样本2的微卫星不稳定性MSI状态为微卫星高不稳定性(MSI-H)。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门艾德生物医药科技股份有限公司
<120> 一种人类微卫星不稳定性MSI检测扩增引物组合物及试剂盒
<160> 14
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gctgaatttt acctcctgac t 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cggagattgt gccattgca 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgcctccaag aatgtaagtg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ttctgcattt taactatggc tct 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ttattgtttt caacctagaa acc 23
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cagtgagctg agatcgtg 18
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
cttatcagat gattccaact ttg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gcttcttcag tatatgtcaa tga 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gagacagagc aagactct 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
gttctgtctc ctttcttaag g 21
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gagcctggaa ggtcgaa 17
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gaaatatttg cctaacctat ggtc 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gactgagcaa gactcagtct 20
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gattacataa catacatgtg tgtaaa 26