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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610911946.2 (22)申请日 2016.10.19 (71)申请人 中国水产科学研究院淡水渔业研究 中心 地址 214081 江苏省无锡市滨湖区山水东 路9号 申请人 东海县水产技术推广站 (72)发明人 李建林俞菊华傅纯洁李红霞 唐永凯于凡 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 余俊杰 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) A01K 61/10(2017.01) (54)发明名称 一种保持建鲤遗传多样性。
2、的方法 (57)摘要 本发明公开了一种保持建鲤遗传多样性的 方法， 包括个体标记、 建立模板、 基因分型、 构建 家系、 建立育种档案和亲本更新过程。 与现有技 术相比： 本发明所述方法能够有效避免建鲤近亲 交配， 保持、 提高建鲤群体遗传多样性， 减缓建鲤 种质退化； 此外， 本发明通过利用分子标记辅助 育种， 建立育种档案， 结合档案内的各项参数分 析群体的亲缘远近， 从而利于选择性保留优势群 体， 交配出种质优良的后代。 权利要求书2页 说明书8页 序列表10页 CN 106480192 A 2017.03.08 CN 106480192 A 1.一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在。
3、于， 包含以下步骤： 第1步、 个体标记： 从建鲤繁殖群体中选取雌雄各300尾以上体质健壮的个体进行个体 标记； 第2步、 建立模板： 采样被标记建鲤的血液或鳍条， 提取全基因组DNA； 第3步、 基因分型： 选用1215个扩增稳定、 且在繁殖群体中含有3个以上等位基因的微 卫星位点， 设计微卫星引物， 以第2步提取的基因组DNA为模板， 进行PCR扩增、 判定基因型； 第4步、 构建家系： 将基因型判定结果进行数字化处理， 用遗传分析软件进行分析， 获得 每个个体之间的遗传距离和群体遗传多样性参数； 选择个体间遗传距离大于平均遗传距离 的个体进行配组繁殖， 构建30个以上家系； 第5步、 建。
4、立育种档案： 第4步构建的家系中每家系取100尾以上体质健壮的个体进行个 体标记， 作为后备亲本， 后备亲本经第2步第4步处理， 获得各家系之间和每个家系的个体 之间的遗传距离； 第6步、 亲本更新： 根据育种档案， 每4年从后备亲本中选择家系间和个体间遗传距离大 于平均遗传距离、 体质健壮的个体进行配组繁殖， 构建新家系， 更新亲本。 2.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第1步中采用 的标记为PIT电子标记。 3.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第3步中选用 15个扩增稳定、 且在繁殖群体中含有413个等位基因的微卫星位点，。
5、 设计微卫星引物， 以 第2步提取的基因组DNA为模板， 进行PCR扩增、 判定基因型。 4.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第4步构建家 系中， 建鲤群体个体之间遗传距离为0.09000.7546， 平均为0.4652； 平均观测杂合度为 0.671， 平均多态信息含量为0.506。 5.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第5步中， 所述 育种档案中包括繁殖群体来源， 个体标记号， 性别， 个体间遗传距离； 后备亲本的父、 母本个 体标记号， 个体间遗传距离， 繁殖时间； 后备亲本个体标记号， 性别， 后备亲本各家系间和个 体。
6、间遗传距离； 后备亲本体长、 体高、 体厚等数量性状参数； 后备亲本各家系畸型率， 病害情 况和生长状况。 6.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第5步中， 后备 亲本群体个体之间遗传距离为0.1180.967， 平均为0.6279； 家系之间的遗传距离在0.142 0.683之间， 平均0.4280； 平均观测杂合度为0.757， 平均多态信息含量为0.745。 7.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第3步中PCR扩 增的反应体系为10 L， 其中10反应缓冲液1.0 L， Mg2+ 2mmol/L， dNTP 200 mol/。
7、L,上下游 引物各0.2 mol/L， Taq酶0.3U， DNA 50ng80ng， 灭菌双蒸馏水补足至10 L。 8.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第3步中PCR扩 增的反应条件为： 94 3min； 94 20s， 5160退火20s， 72 20s， 2530个循环； 72 延伸5min。 9.根据权利要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第3步中PCR扩 增结束后， PCR产物用8.0的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离， 银染法染色后， 拍照记录电泳 结果。 权利要求书 1/2 页 2 CN 106480192 A 2 10.根据权利。
8、要求1所述的一种保持建鲤遗传多样性的方法， 其特征在于， 第4步中采用 的遗传分析软件为populations软件和Cervus3.0软件。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106480192 A 3 一种保持建鲤遗传多样性的方法 技术领域 0001 本发明属于鱼类育种领域， 涉及一种采用分子标记辅助育种的方法， 尤其涉及一 种避免建鲤近亲交配， 保持遗传多样性的育种方法。 背景技术 0002 建鲤(Cyprinus carplo vat.jian)具有生长快、 体型好、 青灰色、 肉质肉味好、 饲 料转化率高、 适应性抗逆能力强等优点， 它是通过家系选育， 多系杂交及雌核发育相结合的 综合。
9、育种技术所培育成功的遗传性状稳定的一个鲤鱼品种。 遗传多样性是生物多样性的核 心， 一般情况下， 物种遗传多样性越丰富， 对环境的适应性和生存能力就赿强， 反之， 遗传多 样性降低可导致其适应能力、 生存能力降低最终导致物种退化。 0003 建鲤虽然有较全面的优良性状， 但由于养殖面的扩大和繁育技术不规范， 很容易 出现建鲤近亲交配繁殖、 群体遗传多样性下降等种质退化现象， 如生长减慢、 抗病力降低、 性成熟个体变小等。 分子标记辅助选择， 是在分子遗传标记的辅助下， 综合利用遗传标记信 息、 遗传距离等来选配亲本组合， 可以有效避免或减少近亲交配， 保持群体遗传多样性， 减 缓种质退化， 保。
10、持或提高优良的生产性状。 0004 传统的建鲤育种方法只能通过表型如生长、 体型、 体质等方面来选择亲本， 不能了 解不同个体之间的遗传关系， 容易近亲交配， 造成种质退化。 发明内容 0005 解决的技术问题： 为了克服现有技术的缺陷， 获得一种能够防止建鲤近亲交配， 保 持或提高建鲤群体遗传多样性， 减缓建鲤种质退化的有效方法， 本发明提供了一种保持建 鲤遗传多样性的方法。 0006 技术方案： 一种保持建鲤遗传多样性的方法， 包含以下步骤： 0007 第1步、 个体标记： 从建鲤繁殖群体中选取雌雄各300尾以上体质健壮的个体进行 个体标记； 0008 第2步、 建立模板： 采样被标记建鲤。
11、的血液或鳍条， 提取全基因组DNA； 0009 第3步、 基因分型： 选用1215个扩增稳定、 且在繁殖群体中含有3个以上等位基因 的微卫星位点， 设计微卫星引物， 以第2步提取的基因组DNA为模板， 进行PCR扩增、 判定基因 型； 0010 第4步、 构建家系： 将基因型判定结果进行数字化处理， 用遗传分析软件进行分析， 获得每个个体之间的遗传距离和群体遗传多样性参数； 选择个体间遗传距离大于平均遗传 距离的个体进行配组繁殖， 构建30个以上家系； 0011 第5步、 建立育种档案： 第4步构建的家系中每家系取100尾以上体质健壮的个体进 行个体标记， 作为后备亲本， 后备亲本经第2步第4。
12、步处理， 获得各家系之间和每个家系的 个体之间的遗传距离； 0012 第6步、 亲本更新： 根据育种档案， 每4年从后备亲本中选择家系间和个体间遗传距 说明书 1/8 页 4 CN 106480192 A 4 离大于平均遗传距离、 体质健壮的个体进行配组繁殖， 构建新家系， 更新亲本。 0013 优选的， 第1步中采用的标记为PIT电子标记。 0014 优选的， 第3步中选用15个扩增稳定、 且在繁殖群体中含有413个等位基因的微 卫星位点， 设计微卫星引物， 以第2步提取的基因组DNA为模板， 进行PCR扩增、 判定基因型。 0015 优选的， 第4步构建家系中， 建鲤群体个体之间遗传距离为。
13、0.09000.7546， 平均 为0.4652； 平均观测杂合度为0.671， 平均多态信息含量为0.506。 0016 优选的， 第5步中， 所述育种档案中包括繁殖群体来源， 个体标记号， 性别， 个体间 遗传距离； 后备亲本的父、 母本个体标记号， 个体间遗传距离， 繁殖时间； 后备亲本个体标记 号， 性别， 后备亲本各家系间和个体间遗传距离； 后备亲本体长、 体高、 体厚等数量性状参 数； 后备亲本各家系畸型率， 病害情况和生长状况。 0017 优选的， 第5步中， 后备亲本群体个体之间遗传距离为0.1180.967， 平均为 0.6279； 家系之间的遗传距离在0.1420.683之。
14、间， 平均0.4280； 平均观测杂合度为0.757， 平均多态信息含量为0.745。 0018 优选的， 第3步中PCR扩增的反应体系为10 L， 其中10反应缓冲液1.0 L， Mg2+ 2mmol/L， dNTP 200 mol/L,上下游引物各0.2 mol/L， Taq酶0.3U， DNA 50ng80ng， 灭菌双 蒸馏水补足至10 L。 0019 优选的， 第3步中PCR扩增的反应条件为： 943min； 9420s， 5160退火20s， 7220s， 2530个循环； 72延伸5min。 0020 优选的， 第3步中PCR扩增结束后， PCR产物用8.0的聚丙烯酰胺凝胶进行电。
15、泳分 离， 银染法染色后， 拍照记录电泳结果。 0021 优选的， 第4步中采用的遗传分析软件为populations软件和Cervus3.0软件。 0022 有益效果： (1)本发明所述方法能够有效避免建鲤近亲交配， 保持、 提高建鲤群体 遗传多样性， 减缓建鲤种质退化； (2)本发明通过利用分子标记辅助育种， 建立育种档案， 结 合档案内的各项参数分析群体的亲缘远近， 从而利于选择性保留优势群体， 交配出种质优 良的后代。 具体实施方式 0023 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。 在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改和替。
16、换， 均属于本发明 的范围。 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0024 实施例1 0025 第1步、 个体标记： 从建鲤繁殖群体中选出900尾(雄450尾， 雌450尾)体质健壮的个 体做为亲鱼， 在每尾鱼腹腔打入PIT电子标记， 并测量体长、 体高、 体厚。 0026 第2步、 建立模板： 从每尾鱼的尾静脉采血0.5mL， 取30 L血细胞抽提基因组DNA。 0027 第3步、 基因分型： 筛选出等位基因在413个之间的15个微卫星位点， 用于进行遗 传距离和遗传多样性分析， 微卫星位点的引物序列如表1所示， 具体方法为用这15个微卫星 位点， 以所。
17、取基因组DNA为模板， 进行PCR扩增。 PCR反应总体积为10 L， 其中含10反应缓冲 液1.0 L， Mg2+2mmol/L， dNTP 200 mol/L,上下游引物各0.2 mol/L， Taq酶0.3U， DNA 50ng 80ng， 用灭菌双蒸馏水补足至10 L。 PCR反应条件为： 943min； 9430s， 5160退火 说明书 2/8 页 5 CN 106480192 A 5 30s， 7230s， 30个循环； 72延伸5min。 PCR反应结束后， 产物用8.0的非变性聚丙烯酰胺 凝胶进行电泳分离， 银染法染色后， 拍照记录电泳结果。 0028 表1 15对微卫星位点。
18、引物序列 0029 说明书 3/8 页 6 CN 106480192 A 6 0030 0031 第4步、 构建家系及育种档案： 将PCR的电泳检测结果进行数字化处理， 用 populations软件分析获得每个个体之间的遗传距离， 用Cervus3.0软件分析观测杂合度、 多态信息含量遗传多样性参数信息。 结果为所选建鲤群体个体之间遗传距离在0.0900 0.7546之间， 平均为0.4652； 平均观测杂合度为0.671， 平均多态信息含量为0.506， 表明所 选建鲤群体遗传多样性处于较为丰富水平。 建立育种档案包括： 繁殖群体来源， 个体标记 号， 性别， 个体间遗传距离； 体长、 体。
19、高、 体厚等数量性状参数， 病害情况， 生长状况等。 0032 从所选建鲤群体中选择个体之间遗传距离在0.46520.7546之间雌雄个体进行 配组繁殖， 构建了40个家系， 这种配组方法最大程度避免了建鲤近亲交配。 每个家系后代隔 离养到30g以上时， 每个家系选取100尾体质健壮的个体在腹腔打入PIT电子标记， 测量体 长、 体高、 体厚， 作为后备亲本饲养。 剪取后备亲本尾鳍13g抽提基因组DNA。 选出40个家系 中17个生长较好的家系的基因组DNA为模板， 按上述方法进行遗传距离和遗传多样性分析， 结果为： 这17个家系后代群体个体之间遗传距离为0.1180.967,具体结果如表2所。
20、示， 平 说明书 4/8 页 7 CN 106480192 A 7 均为0.6279； 家系之间的遗传距离在0.1420.683之间具体结果如表3所示， 平均为 0.4280； 平均观测杂合度为0.7567， 平均多态信息含量为0.7453,具体结果如表4所示。 结果 表明这17个家系后代群体个体之间遗传距离和遗传多样性水平都有所提高。 建立育种档案 包括： 后备亲本的父、 母本个体标记号， 个体间遗传距离， 繁殖时间； 后备亲本个体标记号， 性别； 后备亲本各家系间和个体间遗传距离； 后备亲本体长、 体高、 体厚等数量性状参数； 后 备亲本各家系畸型率， 病害情况， 生长状况等。 0033 。
21、第5步、 亲本更新： 将后备亲本饲养4年后， 以该群体为做为亲鱼， 以上述方法构建 家系， 并进行遗传距离和遗传多样性分析， 作为下一代的后备亲本。 这样亲本就可以有效避 免近亲交配， 保持群体遗传多样性， 减缓种质退化。 商品鱼养殖的苗种则可以在上述后备亲 本饲养2年性成熟后， 选择家系之间的遗传距离在平均值以上的家系进行搭配繁殖苗种， 如 上述后备亲本16#家系与28#家系间遗传距离为0.6830， 比平均遗传距离大， 可将这些家系 雌、 雄鱼群体搭配繁殖苗种： 将16#家系雄鱼和28#家系的雌鱼搭配， 或28#家系雄鱼和16#家 系的雌鱼搭配进行大批量苗种生产， 这样商品鱼养殖苗种繁殖也。
22、有效地避免了近亲交配， 保持优良的生产性状。 说明书 5/8 页 8 CN 106480192 A 8 0034 说明书 6/8 页 9 CN 106480192 A 9 0035 0036 表4各位点遗传多样性参数 说明书 7/8 页 10 CN 106480192 A 10 0037 位点等位基因数观测杂合度多态信息含量 HLJ392120.9330.831 HLJ52690.5830.826 HLJ586100.8010.816 HLJ72350.6480.58 HLJ109790.8840.827 HLJ111390.5610.753 HLJ1115100.9020.835 HLJ11。
23、6340.5560.46 HLJ121150.6610.605 HLJ1301130.8670.874 HLJ1316110.8330.792 HLJ1331100.7460.778 HLJ142360.6190.571 HLJ143880.8510.779 HLJ1458120.9060.853 平均值8.90.75670.7453 说明书 8/8 页 11 CN 106480192 A 11 0001 序列表 1/10 页 12 CN 106480192 A 12 0002 序列表 2/10 页 13 CN 106480192 A 13 0003 序列表 3/10 页 14 CN 106480192 A 14 0004 序列表 4/10 页 15 CN 106480192 A 15 0005 序列表 5/10 页 16 CN 106480192 A 16 0006 序列表 6/10 页 17 CN 106480192 A 17 0007 序列表 7/10 页 18 CN 106480192 A 18 0008 序列表 8/10 页 19 CN 106480192 A 19 0009 序列表 9/10 页 20 CN 106480192 A 20 0010 序列表 10/10 页 21 CN 106480192 A 21 。