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1、(10)授权公告号 CN 101402679 B (45)授权公告日 2012.01.25 CN 101402679 B *CN101402679B* (21)申请号 200810226515.8 (22)申请日 2008.11.13 C07K 14/435(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 1/00(2006.01) A01K 67/00(2006.01) (73)专利。
2、权人 中国科学院遗传与发育生物学研 究所 地址 100101 北京市朝阳区大屯路中科院遗 传所 (72)发明人 陈良标 王道文 胡鹏 冯波 许广会 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 抗寒蛋白及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种抗寒蛋白及其编码基因与 应用。 该蛋白， 是具有下述氨基酸残基序列之一的 蛋白质 ： 1) 序列表中的 SEQ ID ： 2 ； 2) 将序列 表中 SEQ ID ： 2 的氨基酸残基序列经过一个或 几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且 具有抗寒活性的蛋白质。本发明的抗寒基因具。
3、有 抗寒功能， 可转入植物中提高植物的抗寒性， 对改 善植物， 特别是粮食和经济作物的耐寒品质， 提高 其抵抗自然低温灾害的能力对我们经济发展有着 重要的现实意义。 (51)Int.Cl. 审查员 曲凯 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 CN 101402679 B1/1 页 2 1. 一种抗寒蛋白， 是由序列表中 SEQ ID .2 的氨基酸残基序列组成的蛋白质。 2. 权利要求 1 所述的抗寒蛋白的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的编码基因， 其特征在于 ： 所述抗寒蛋白的 cDNA 基因为序列表 中 SEQ 。
4、ID ： 1 的核苷酸序列。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述的抗寒蛋白的编码基因的重组表达载体。 5. 含有权利要求 2 或 3 所述的抗寒蛋白的编码基因的转基因细胞系。 6. 含有权利要求 2 或 3 所述的抗寒蛋白的编码基因的宿主菌。 7. 权利要求 1 所述的抗寒蛋白在提高植物抗寒性中的应用， 所述植物为烟草。 8. 权利要求 2 或 3 所述的抗寒蛋白的编码基因在提高植物抗寒性中的应用， 所述植物 为烟草。 权 利 要 求 书 CN 101402679 B1/8 页 3 抗寒蛋白及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种抗寒蛋白及其编码基因与应用， 特别涉及一种来源于。
5、南极鱼的耐 寒蛋白及其编码基因， 与它们在提高植物抗寒性中的应用。 背景技术 0002 南极鱼是已知的最耐寒的鱼类， 其细胞可以在 -1 -2的低温中完成包括 个体发育在内的所有生命活动， 寒冷环境下进化形成的基因组编码了低温下生存所需 的所有功能分子， 是重要的基因资源 (Gordon， A.L.2003.Oceanography ： Thebrawniest retroflection.Nature 421 ： 904-905)。因此， 对生活在不同温度环境下的南极鱼类 基因组的比较分析， 以及相关基因的克隆鉴定、 功能分析及其作用机制研究， 有助于我 们理解南极鱼类在 0以下这样极端的低。
6、温环境下生存的机制。生活在南极的鱼类表 现出了一系列与抗寒相关的生理和生化性状， 如抗冻蛋白的进化 (DeVries， A.L.1971. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes.Science 172 ： 1152-1155 ； Cheng， A.L.D.a.C.-H.C.2005.Antifreeze Proteins andOrganismal Freezing Avoidance in Polar Fishes.Fish Physiology 22 ： 155-201 ； De Vries， A。
7、.L.C.， C.-H.C.2005.Antifreeze proteins and organismal freezing avoidance in polarfishes.fish physiology seriesThe physiology of polar fishes(eds.Farrell， A.P.&Steffenson， J.F.).San Diego， CA ： Elsevier Academic Press 22 ： 155-201)、 热 休 克 应 答 (the heat-shock response， HSR) 的 缺 失 (Hofmann， G.E.， Buckl。
8、ey， B.A.， Airaksinen， S.， Keen， J.E.， Somero， G.N.， 2000.2000.Heat-shock protein expression is absent in theAntarctic fish Trematomus bernacchii(Family Nototheniidae). J.Exp.Biol.203 ： 2331-2339)， 血液中红血球大量减少甚至消失 (Verde， C.， E.Parisi， and G.diPrisco.2006.The evolution of thermal adaptation in polar f。
9、ish.Gene 385 ： 137-145)， 肌纤维的数目减少， 直径却增大等等。 那么这些低温适应的分子基础是什么？在 几千万年的寒冷筛选后， 鱼类产生了哪些功能上特异抗寒的基因？ 0003 冷暖空气的活动是天气变化的基本原因之一。在特定的天气形势下， 聚积在高纬 度地区的强冷空气迅速南下， 入侵我国， 造成大范围的剧烈降温， 并伴有大风、 雨雪、 冻害等 现象， 这类天气过程称为寒潮或强冷空气， 由此所造成的损失称为寒潮与冷冻灾害。 寒冷的 气候会造成农作物的大量减产， 在美国， 每年由于寒冷而导致农业经济损失达几十亿美元， 例如 1998 年 12 月份， 加利福尼亚州由于冰冻灾害而。
10、柑橘大面积死亡， 直接经济损失达 5 亿 9 千万美元。在中国每年平均有 67 亿亩农田蒙受寒冷的气候的危害， 粮食减收 200 亿公 斤 ( 中国可持续发展信息网 2003.10.13)。若能利用已发现的抗寒基因培育出新型的具有 抗寒的转基因植物， 能够使转基因农作物具有更强的耐寒能力， 在室外温度突然下降的情 况下保持其生理活性， 从而使农作物免受寒冷的灾害。 发明内容 说 明 书 CN 101402679 B2/8 页 4 0004 本发明的目的是提供一种抗寒蛋白及其编码基因与应用。 0005 本发明所提供的抗寒蛋白， 名称为SOD， 来源于南极鳕鱼(Dissostichusmawson。
11、i)， 是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质 ： 0006 1) 自序列表中的 SEQ ID .2 的氨基端残基序列 ； 0007 2) 将自序列表中的 SEQ ID .2 的氨基端残基序列经过一个或几个氨基酸残基 的取代和 / 或缺失和 / 或添加且具有抗寒活性的蛋白质。 0008 其中， 序列表中的序列 2 由 154 个氨基酸残基组成。 0009 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸 残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加。 0010 为了使 1) 中的 SOD 便于纯化， 可在由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋 白质的 N 端或 C 端连接上。
12、如表 1 所示的标签。 0011 表 1. 标签的序列 0012 标签残基序列 Poly-Arg5-6( 通常为 5 个 )RRRRR Poly-His2-10( 通常为 6 个 )HHHHHH FLAG8DYKDDDDK Strep-tag 错误！ 未找到引用源。 8WSHPQFEK c-myc10EQKLISEEDL 0013 上述 2) 中的 SOD 可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。上 述 2) 中的 SOD 的编码基因可通过将序列表中 SEQ ID ： 1 的 DNA 序列中缺失一个或几个 编码氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 。
13、和 / 或在其 5 端和 / 或 3 端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0014 为了便于蛋白的分泌表达， 还可在所述 SOD 的氨基末端添加上信号肽序列。 0015 上述抗寒蛋白的编码基因 (Gene2_SOD) 也属于本发明的保护范围。 0016 上述抗寒蛋白的 cDNA 基因， 可具有下述核苷酸序列之一 ： 0017 1) 序列表中 SEQ ID ： 1 的核苷酸序列 ； 0018 2) 编码序列表中 SEQ ID ： 2 蛋白质序列的多核苷酸 ； 0019 3) 在高严谨条件下可与序列表中 SEQ ID ： 1 限定的 DNA 序列杂交的核苷酸序 列。 0020 上述高严谨条件。
14、可为在 0.1SSPE( 或 0.1SSC)， 0.1 SDS 的溶液中， 在 65下 杂交并洗膜。 0021 其中， 序列表中的SEQ ID ： 1由465个脱氧核苷酸组成。 自序列表中SEQ ID ： 1 的 5 端的第 1 至 465 位核苷酸为 Gene2_SOD 的开放阅读框 (Open Reading Frame， ORF)， 序列表中序列 1 编码序列表中序列 2 的核苷酸序列。 0022 含有本发明基因的重组表达载体、 转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范 围。 0023 本发明的抗寒基因以南极鳕鱼 (Dissostichus mawsoni) 这个特殊的物种为研究 材料，。
15、 利用 cDNA 文库的构建和测序的技术发现并利用 RT-PCR 的方法获得全长序列。将本 发明的抗寒基因转入烟草中， 获得了可稳定表达本发明的抗寒基因的转基因烟草， 经过低 说 明 书 CN 101402679 B3/8 页 5 温实验表明， 转入本发明抗寒基因的烟草在低温 (4 ) 下生长 20 天仍保持旺盛的生长状 态， 没有萎蔫， 证实本发明的抗寒基因具有抗寒功能， 可转入植物中提高植物的抗寒性。对 改善植物， 特别是粮食和经济作物的耐寒品质， 提高其抵抗自然低温灾害的能力对我们经 济发展有着重要的现实意义。 附图说明 0024 图 1 为 pCAPE3 的结构示意图。 0025 图 。
16、2 为野生型植株荧光鉴定照片。 0026 图 3 为转 pCAPE3 烟草植株荧光鉴定。 0027 图 4 为转基因烟草 RT-PCR 鉴定电泳图。 0028 图 5 为 4处理 20 天的转 pCAPE-SOD 烟草和对照的表型。 0029 图 6 为 23恢复生长 15 天表型的转 pCAPE-SOD 烟草和对照的表型。 0030 图 7 为图 7 为正常培养 30 天和在 4 度处理 20 天转 pCAPE-SOD 烟草和对照的 Fv/ Fm 值。 具体实施方式 0031 下述实施例中的实验方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0032 下述实施例中的百分含量， 如无特别说明， 均为质。
17、量百分含量。 0033 实施例 1、 抗寒基因及其编码蛋白的获得及其抗寒应用 0034 一、 本发明的抗寒基因及其编码蛋白的获得 0035 本发明的发明人通过构建了南极鳕鱼 (Dissostichus mawsoni) 的 cDNA 文库， 并 对该文库的 EST 序列进行了大规模测序， 最后通过序列拼接和 BLAST 分析得到了一系列感 兴趣的基因， 并对其中一个可能具有抗寒功能的基因进行分析研究， 并按照下述方法获得 该基因的序列。 0036 设计扩增引物， 引物序列如下所示 ： 0037 上游引物 SOD_F ： 5 -CGCGAGCTCATGGTTATGAAAGCTGTGTG-3 ( 。
18、下划线标注的是 SacI 酶识别位点 ) ； 0038 下游引物 SOD_R ： 5 -CGCGAATTCTTACTGGGCGATGCCGATG-3 ( 下划线标注的是 EcoRI 酶识别位点 )。 0039 利用 TRIZOL 试剂提取南极鳕鱼 (Dissostichus mawsoni)(Karl-HermannKockl， Keith Reid， John Croxall and Stephen Nicol 2007 Fisheries in the Southern Ocean ： an ecosystem approach Phil.Trans.R.Soc.B 362， 2333-2。
19、349， 中国科学院遗传与发育生 物学研究所 ) 的肝脏 RNA， 以此 RNA 为模板， 反转录得到第一链 cDNA， 反转录具体方法如下 所述 ： 0040 在 EP 管中加入 Random Primers 1.0l(100ng)， 南极鳕鱼 (Dissostichusmawsoni) 的肝脏 RNA 2.0l(5g)， dNTP mix(10mM)1.0l， 水 (RNA-free)8.0l ； 在 65温育 5min， 至于冰上 5min， 然后加入 5first-strand Buffer 4.0l， DTT(0.1M) 2.0l， Rnaseout(40U/l) 1.0l， 混匀后。
20、， 25放置 2min ； 加入 1.0l SuperSeripteII RT 轻轻混匀， 25下放置 10min。将混合物置于 42反应 50min， 说 明 书 CN 101402679 B4/8 页 6 置于 70下加热 15min 终止反应， 即得第一链 cDNA。 0041 以此 cDNA 为模板， 在引物 SOD_F 和引物 SOD_R 的引导下， 用常规 PCR 法扩增抗寒 基因的 cDNA 序列。 0042 其中， 反应体系 (50l 体系 ) 为上述获得的含第一链 cDNA 的反应液 2l， 10buffer5l， dNTP混合液(25mM)2l， SOD_F(10M)2l，。
21、 SOD_R(10M)2l， Taq DNA 聚合酶 (2.5U/l)0.5l， 灭菌水 36.5l。 0043 反应程序为 ： 95预变性 5min ； 然后 95变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 1min 进行 35 个循环 ； 最后 72延伸 10min， 4下保存。 0044 反应结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳检测， 回收并纯化得到 465bp 的 DNA 片段， 将该片段进行测序， 结果表明， PCR 扩增得到的片段具有序列表中序列 1 的核苷酸序列， 将其命名为Gene2_SOD。 序列表中序列1的核苷酸序列是由465个脱氧核苷 酸组成， 自序列表。
22、中序列 1 的 5 端第 1-465 位核苷酸序列为编码序列 (ORF)， 编码具有序 列表中序列 2 的氨基酸残基序列的蛋白质。将该蛋白命名为 SOD。 0045 二、 利用本发明的抗寒基因及其编码蛋白提高植物抗寒性的应用 0046 1、 可在植物中表达本发明的抗寒基因的重组表达载体的构建 0047 将 pCAPE2 来自 PEBV-VIGS 载体系统 ( 由两个 T-DNA 质粒 (pCAPE1， pCAPE2) 组 成 )， Constantin， G.D.， B.N.Krath， S.A.MacFarlane， M.Nicolaisen， I.E.Johansen， and O.S.L。
23、und.2004.Virus-induced gene silencing as a tool for functional genomics in alegume species.Plant J 40 ： 622-631 ； 中国科学院遗传与发育生物学研究所 ) 进行了改 造， 增加了 MluI、 EcoRI、 SalI、 SacI、 NcoI 酶识别位点。具体的改造方法为 ： 合成含有上述 酶切位点的核苷酸片段 CACCATGGCTAGCACGCGTCCTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCGA， 将该片段插 入到 pCAPE2 的 NcoI 和 EcoRI 酶切位点之间， 得到重组。
24、质粒。将鉴定正确的增加了 MluI、 EcoRI、 SalI、 SacI、 NcoI 酶识别位点的重组质粒命名为 pCAPE3( 其结构示意图如图 1 所 示 )。 0048 按照步骤一的方法扩增 Gene2_SOD 基因， 然后用 SacI 和 EcoRI 双酶切后， 将酶切 得到 Gene2_SOD 基因片段插入到 pCAPE3 的 SacI 和 EcoRI 酶切位点之间得到重组载体， 将 该重组载体进行酶切和测序鉴定， 将鉴定正确的含有 Gene2_SOD 基因片段的重组载体命名 为 pCAPE-SOD。 0049 2、 利用本发明的抗寒基因及其编码蛋白提高烟草抗寒性 0050 1) 转。
25、 pCAPE-SOD 烟草的获得 0051 分别 pCAPE1、 pCAPE3， 及 pCAPE-SOD 转农杆菌 GV3101( 购自 promega 公司 ) 后， 鉴 别， 挑取转化成功的克隆， 划线 28培养过夜， 提取质粒进行酶切和测序鉴定， 将鉴定表明 正确的含有pCAPE1的工程菌株命名为GV-pCAPE1， 将鉴定表明正确的含有Pcape3的工程菌 株命名为 GV-pCAPE3， 将鉴定正确的含有 pCAPE-SOD 的工程菌株命名为 GV-pCAPE-SOD ； 0052 挑取上述 GV-pCAPE1、 GV-pCAPE3 或 GV-pCAPE-SOD 分别接种到 5ml 添。
26、加 50mg/L 利 福平 (Rif) 和 50mg/L 卡那霉素 (Kana) 的 LB 培养基中 28培养过夜 ； 然后将培养过夜的 菌液分别转接到 50ml 添加 50mg/L 利福平 (Rif)、 50mg/L 卡那霉素 (Kana)、 20M 乙酰丁香 酮 (Acetosyringone) 和 10mM2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸 (MES) 的 LB 培养基中， 28培养过夜 ； 0053 离心收集上述 GV-pCAPE1、 GV-pCAPE3 或 GV-pCAPE-SOD 菌液， 然后重悬在添加了 说 明 书 CN 101402679 B5/8 页 7 10mM MgCl2、 1。
27、0mM2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸 (MES)+200M 乙酰丁香酮 (Acetosyringone) 的 LB 培养基中， 调 OD600 2.0， 在室温下静置 3 小时得到 OD600为 2.0 的 GV-pCAPE1、 GV-pCAPE3 或 GV-pCAPE-SOD 菌液。 0054 将 上 述 获 得 的 OD600为 2.0 的 GV-pCAPE1 菌 液 分 别 与 GV-pCAPE3 菌 液 或 GV-pCAPE-SOD 菌液按照 1 ： 1 的体积比混合， 得到 GV-pCAPE1 与 GV-pCAPE3 的混合菌液和 GV-pCAPE1 与 GV-pCAPE-SOD 的混。
28、合菌液。 0055 将本氏烟 (Nicotiana benthamiana， 购自中国农业科学院烟草研究所 ) 播种于蛭 石中， 在 25培养间内， 16 小时光照， 8 小时黑暗培养， 长到 5-6 片展开叶时用于农杆菌注 射。将上述得到的 GV-pCAPE1 与 GV-pCAPE3 的混合菌液或者 GV-pCAPE1 与 GV-pCAPE-SOD 的混合菌液分别注射上述 5-6 片展开叶的烟草， 注射时要注射近轴端的嫩叶。将注射后的 烟草于 23 度， 40湿度， 16 小时光照 /8 小时黑暗温室下培养 25 天得到转 pCAPE-SOD 烟草 或转 pCAPE3 烟草。 0056 2)。
29、 转 pCAPE-SOD 烟草的鉴定 0057 A、 转 pCAPE3 烟草的鉴定 0058 将步骤1)得到的转pCAPE3烟草进行表达情况荧光鉴定， 具体方法为 ： 取1平方厘 米转pCAPE3烟草和野生型烟草本氏烟(Nicotiana benthamiana)(作为野生型对照， WT)叶 片， 的烟草叶片， 置于盖玻片上， 滴蒸馏水一滴， 压片， 置于激光共聚焦显微镜下观察， 转入 pCAPE3 和 pCAPE1 的阳性植株在激光共聚焦显微镜的 470nm 激发下显示绿色荧光 ； 同时用 激光共聚焦显微镜观察转 pCAPE3 烟草和野生型烟草本氏烟 (Nicotiana benthamia。
30、na) 的 叶绿体荧光作为对照。结果如图 2 和图 3 所示， 结果表明有 6 株转 pCAPE3 烟草全部为成功 转入 pCAPE3 和 pCAPE1 并且可在烟草中正常表达的转基因烟草。图 2 中， A 为野生型烟草的 GFP 荧光照片， B 为野生型烟草的叶绿体荧光照片， C 为 A 和 B 所示荧光的重叠。图 3 中， A 为转 pCAPE3 烟草的 GFP 荧光照片， B 为转 pCAPE3 烟草的叶绿体荧光照片， C 为 A 和 B 所示 荧光的重叠。 0059 B、 转 pCAPE-SOD 烟草的鉴定 0060 将上述步骤 1) 得到的转 pCAPE-SOD 烟草通过 RT-PC。
31、R 的鉴定， RT-PCR 的引物为 ： 0061 上游引物 SOD-up ： TGTTGAAAGGAGCTGGAGAGGC ； 0062 下游引物 SOD-down ： TACTGGGCGATGCCGATGACT。 0063 以步骤1)获得的转pCAPE-SOD烟草的第一链cDNA模板为模板进行PCR扩增反应。 同时以 26S rRNA 作为对照， PCR 扩增引物为 5 端上游引物为 ： GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC ； 3 端下游引物为 ： TCTCCCTTTAACACCAACGG。 0064 其 中， 反 应 体 系 (50l 体 系 ) 为 含 转 pCAPE-SOD 烟。
32、 草 的 第 一 链 cDNA 的 反 应 液 2l， 10buffer 5l， dNTP 混 合 液 (25mM)2l， SOD-up(10g/L)2l， SOD_ down(10g/L)2l， Taq DNA 聚合酶 (2.5U/l)0.5l， 灭菌水 36.5l。 0065 反应程序为 ： 95预变性 5min ； 然后 95变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 1min 进行 35 个循环 ； 最后 72延伸 10min， 4下保存。 0066 反应结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳检测， 440bp 的 DNA 片段即 是目标片段。 0067 结果如图 4 。
33、所示， 结果表明 6 株转 pCAPE-SOD 烟草中 Gene2_SOD 基因已全部成功 说 明 书 CN 101402679 B6/8 页 8 通过 pCAPE-SOD 转入烟草中并在转 pCAPE-SOD 烟草中正常表达。 0068 3、 转 pCAPE-SOD 烟草的抗寒性鉴定 0069 将步骤 2 鉴定阳性的转 pCAPE3 烟草 ( 对照 )、 转 pCAPE-SOD 烟草和烟草本氏烟 (Nicotiana benthamiana， 购自中国农业科学院烟草研究所 ) 的种子萌发后生长 25 天， 然 后分别置于 4， 16h 光照 /8h 黑暗， 生长 20 天， 然后再 23， 。
34、16h 光照 /8h 黑暗， 恢复生长 15 天， 同时设置在 23， 16h 光照 /8h 黑暗的条件下生长， 其余条件于上述相同的转 pCAPE3 烟草 ( 对照 )、 转 pCAPE-SOD 烟草和野生型烟草作为阳性对照。在培养的过程中对植株进 行表型观察。如图 5 所示， 转基因烟草在 4， 16h 光照 /8h 黑暗， 生长 20 天后， 对照组植 株 ( 转 pCAPE3 烟草， 图 5 中对照 ) 有明显的冷伤害的表型， 植株精干弯曲， 叶片萎靡， 而转 pCAPE-SOD 烟草 ( 图 5 中 Gene2_SOD) 则在 4低温处理后生长依旧良好， 低温处理并没有 导致其有不良。
35、反应。在植株 4冷处理 20 天后， 置于 23， 16h 光照 /8h 黑暗， 恢复生长 15 天后其表型如图 6 所示， 可以看到， 对照组植物 ( 图 6 中对照 ) 在冷处理受到低温伤害后再 置于正常温度下培养， 依旧不能恢复到正常的生长状态， 说明 4的低温处理对烟草的伤害 是永久性的， 不可恢复的， 而转pCAPE-SOD烟草(图6中Gene2_SOD)， 4冷处理20天后， 置 于 23恢复生长 15 天后， 植株能够继续正常生长发育， 没有表现出任何低温所造成的伤害 性状。 0070 为了进一步证实转基因植株的抗寒能力， 我们进一步测定了上述转 pCAPE-SOD 烟 草在正常。
36、培养 30 天和在 4 度处理 20 天的光合作用系统 II 光化学效率 (Fv/Fm) 这一生理 指标 (Tarantino， D.， Vianelli， A.， Carraro， L.and Soave， C.(1999)A nuclear mutantof Arabidropsis thaliana selected for enhanced sensitivity to light-chill stress is altered inPS II electron transport activity.Physiol.Plant.107， 361-371.)， 以 转 pCAPE3 烟草。
37、为对照。结果如图 7 所示， 实验数据表明对照组植株的 FV/Fm 下降明显， 而 转 pCAPE-SOD 烟草植株 FV/Fm 下降很小， 说明实验组转 Gene2_SOD 烟草植株对低温有明显 的抗性。表明 Gene2_SOD 具有抗寒的功能。 0071 序列表 0072 160)2 0073 1 0074 465 0075 DNA 0076 南极鳕鱼 (Dissostichus mawsoni) 0077 1 0078 说 明 书 CN 101402679 B7/8 页 9 0079 2 0080 154 0081 PRT 0082 南极鳕鱼 (Dissostichus mawsoni) 0083 2 0084 0085 说 明 书 CN 101402679 B8/8 页 10 说 明 书 CN 101402679 B1/3 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101402679 B2/3 页 12 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101402679 B3/3 页 13 图 6 图 7 说 明 书 附 图 。