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1、(10)授权公告号 CN 101402627 B (45)授权公告日 2011.08.31 CN 101402627 B *CN101402627B* (21)申请号 200810107271.1 (22)申请日 2008.10.15 C07D 311/30(2006.01) C07H 17/07(2006.01) C07G 5/00(2006.01) C08B 37/00(2006.01) A61K 36/62(2006.01) (73)专利权人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府 大道 999 号 (72)发明人 邓泽元 单斌 范亚苇 (74)专利代理机构 南昌新天下。
2、专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 CN 101139320 A,2008.03.12, 说明书全文 . CN 1923829 A,2007.03.07, 说明书全文 . (54) 发明名称 同步分离提取与纯化荷叶中黄酮、 生物碱和 多糖的方法 (57) 摘要 一种同步分离提取与纯化荷叶中黄酮、 生物 碱和多糖的方法， 其特征是将荷叶经预处理后， 加 入不同的有机溶剂连续浸提三次， 分别得到黄酮、 生物碱和多糖三种浸提液， 经浓缩、 脱色、 干燥处 理得黄酮、 生物碱、 多糖三种产品， 该方法克服了 目前仅只能提取单一成分或在提取单一成分过程 中对其他成分的破坏或对其他成分提取。
3、率低、 或 提取物杂质高等的缺点， 兼顾了黄酮、 生物碱和多 糖的化学性质， 充分考虑了各种成分提取过程中 的相互影响、 活性和提取率， 具有提取率高， 纯度 高， 荷叶资源利用率高的特点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 施捷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 101402627 B1/1 页 2 1. 一种同步分离提取与纯化荷叶中黄酮、 生物碱和多糖的方法， 其特征是工艺步骤如 下 ： (1) 将新鲜荷叶用含 0.1 NaCl、 pH 3.0-4.0 的磷酸水溶液， 常温浸泡 3min， 淋洗沥 干后干燥， 。
4、粉碎至 18 目 -30 目， 微波预处理 ； (2) 将经微波处理后的荷叶干粉， 加入 25-30 倍 40 -70的碱性有机溶液， 调 pH 9.0-14.0， 加入抗氧化剂 0.1g/Kg-0.3g/Kg 干荷叶， 在 65 -85下浸提 1-2 小时， 提取 1 次， 以提取荷叶黄酮 ； (3) 将 (2) 中所得荷叶粉残渣， 加入 25-30 倍 60 -95的酸性有机溶液， 调 pH 1.0-6.0， 加入抗氧化剂0.3g/Kg-0.5g/Kg干荷叶， 在65-85下浸提1h-2h， 提取2次， 以 提取荷叶生物碱 ； (4)将(3)中所得荷叶粉残渣， 加入25-30倍的中性水， 。
5、调pH6.0-8.0， 在65-85 下浸提 1h-2h， 提取 1 次， 以提取荷叶多糖 ； (5) 将 (2) 中所提取的荷叶黄酮粗提物， 经离心、 过滤后的上清液， 减压蒸馏回收乙醇 后， 用 10盐酸调溶液至 pH 6.5-7.0， 再经离心、 过滤， 取上清液配制成 1mg/mL-5mg/mL 上样液， 经弱极性大孔树脂吸附后用纯水、 10 -30乙醇分别冲洗除去杂质， 50-90有机 溶液洗脱， 收集洗脱液， 在真空度 0.06Mpa-0.09Mpa、 65 -85下蒸发浓缩， 回收浸提液中 的有机溶剂， 得到浓缩液， 经真空干燥制得荷叶黄酮成品 ； (6) 将 (3) 中所提取的。
6、荷叶生物碱粗提物， 经离心、 过滤后的上清液， 减压蒸馏回收乙 醇后， 经酸性溶液复溶， 酸性条件下有机溶剂脱色， 调节pH7.0后离心、 过滤除去鞣质 ； 取 上清液， 调节 pH 12.0， 并配制成 0.1mg/mL-2mg/mL 上样液， 经弱极性大孔树脂吸附后， 用 纯水、 10 -30乙醇分别冲洗除去杂质， 50 -90有机溶液洗脱， 收集洗脱液， 在真空度 0.06Mpa-0.09Mpa、 65 -85下蒸发浓缩， 回收浸提液中的有机溶剂， 得到浓缩液， 经真空 干燥制得荷叶生物碱成品 ； (7) 将 (4) 中所提取的荷叶多糖粗提物， 经离心、 过滤后的上清液浓缩至糖浓度为 2。
7、 -6， 调节 pH 6.0-7.0， 保持溶液温度为 40 -60下条件下， 经弱极性大孔树脂动 态吸附脱色后， 水洗出滞留于柱中的荷叶多糖， 并浓缩至糖浓度 4 -6， 用 saveg 除蛋白 后， 在真空度 0.06Mpa-0.09Mpa、 65 -85下蒸发浓缩， 得到浓缩液， 经真空或冷冻干燥制 得荷叶多糖成品。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征是步骤(2)所述的有机溶液为甲醇、 乙醇或者正 丁醇 ； 抗氧化剂为特丁基对苯二酚、 丁基羟基茴香醚或者二丁基羟基甲苯。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征是步骤(3)所述的有机溶液为甲醇、 乙醇或者正 丁醇 ； 抗氧化剂为 D- 。
8、异抗坏血酸或者 D- 异抗坏血酸钠。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征是步骤(5)所述的有机溶液为甲醇、 乙醇或者正 丁醇 ； 弱极性大孔树脂为 AB-8、 D101B、 H-30 或者 H-60。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是步骤 (6) 所述的有机溶液为正已烷、 氯仿、 石 油醚、 甲醇、 乙醇或者正丁醇 ； 弱极性大孔树脂为 D101、 H-20、 H-60、 C004 或者 C008。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征是步骤 (7) 所述的弱极性大孔树脂为 AB-8、 D208、 LSA-5B、 D4020、 D201、 S-8、 NKA 或者 MG。
9、-1 ； saveg 试剂配制用有机溶剂为氯仿、 正丁醇 或者戊醇。 权 利 要 求 书 CN 101402627 B1/3 页 3 同步分离提取与纯化荷叶中黄酮、 生物碱和多糖的方法 技术领域 0001 本发明属农、 林产品深加工领域， 涉及以荷叶为原料提取黄酮、 荷叶生物碱和荷叶 多糖的方法。 背景技术 0002 我国荷叶资源相当丰富， 被列入了第 2 批 “既是食品又是药品” 的名单， 可以作为 生产保健食品的原料。长期以来， 荷叶在食用及药用两方面均有广泛的应用。荷叶分布我 国大部地区， 主产于江西、 湖南、 湖北、 浙江、 江苏等地。荷叶具有解暑清热、 生发清阳、 散瘀 止血等功效，。
10、 临床亦将其广泛用于肥胖症及高脂血症， 并取得了较好疗效， 综合利用价值很 高。 0003 荷叶中具有生理活性的物质主要为黄酮类物质、 生物碱和荷叶多糖。目前获得这 些有效成分的提取方法主要为水或有机溶剂直接浸提或者回流浸提。国内外对荷叶中功 能成分的应用研究主要集中于单一地提取黄酮或生物碱成分， 在提取这些成分的同时舍弃 了其他两种功能成分， 或者只是简单的生产醇提物或水提物， 技术含量不高， 难以实现高附 加值的产业升级要求。未见有综合分离提取利用荷叶三种功能成分黄酮、 生物碱及荷叶多 糖的研究报道。这主要是在提取单一成分时， 提取条件会破坏其他成分或对其他成分提取 率低， 并使得到的提取。
11、物杂质高， 增加后续纯化的难度和要求。 如用水或有机溶剂提取黄酮 时， 部分生物碱也能提取出来， 得到的粗黄酮杂质高， 增加了后续纯化的难度， 同时也影响 生物碱的再提取。 同样在提取生物碱时， 提取条件影响黄酮的稳定性， 大大影响黄酮的再提 取， 得到的粗生物碱杂质高， 增加了后续纯化的难度。 在用水提取多糖时， 前处理复杂， 提取 的粗多糖杂质高、 色泽深、 很难纯化。因此必须找到一种兼顾了黄酮、 生物碱和多糖的化学 性质， 充分考虑了各种成分提取过程中的相互影响、 活性和提取率的同步提取方法， 使三种 活性成分提取率高， 纯度高， 提取效率高， 荷叶资源利用率高。 发明内容 0004 本。
12、发明的目的是提供一种高效、 综合提取荷叶中黄酮、 生物碱和多糖三种主要功 能成分的提取方法。 0005 本发明的具体工艺步骤如下 ： 0006 (1) 将新鲜荷叶用含 0.05-0.15 NaCl 的磷酸水溶液 (pH 3.0-4.0) 常温浸泡 3min， 淋洗沥干后干燥， 粉碎至 18 目 -30 目， 微波预处理 1min-3min ； 0007 (2) 将经微波处理后的荷叶干粉， 加入 25-30 倍 40-70的碱性有机溶液， 调 pH 9.0-14.0， 加入抗氧化剂 0.1g/Kg-0.3g/Kg 干荷叶， 在 65 -85下浸提 1-2 小时， 提取 1 次， 以提取荷叶黄酮 。
13、； 0008 (3)将(2)中所得荷叶粉残渣， 加入25-30倍60-95的酸性有机溶液， 调pH 1.0-6.0， 加入抗氧化剂0.3g/Kg-0.5g/Kg干荷叶， 在65-85下浸提1-2小时， 提取2次， 以 提取荷叶生物碱 ； 说 明 书 CN 101402627 B2/3 页 4 0009 (4) 将 (3) 中所得荷叶粉残渣， 加入 25-30 倍的中性水， 调 pH 6.0-8.0， 在 65 -85下浸提 1-2 小时， 提取 1 次， 以提取荷叶多糖 ； 0010 (5) 将 (2) 中所提取的荷叶黄酮粗提物， 经离心、 过滤后的上清液， 减压蒸馏回收 乙醇后， 用 10盐。
14、酸调溶液至 pH 6.5-7.0， 再经离心、 过滤， 取上清液配制成 1-5mg/mL 上 样液， 经弱极性大孔树脂吸附后用纯水、 10 -30乙醇分别冲洗除去杂质， 50-90有机溶 液洗脱， 收集洗脱液， 在真空度 0.06Mpa-0.09Mpa、 65-85下蒸发浓缩， 回收浸提液中的有 机溶剂， 得到浓缩液， 经真空干燥制得荷叶黄酮成品 ； 0011 (6) 将 (3) 中所提取的荷叶生物碱粗提物， 经离心、 过滤后的上清液， 减压蒸馏回 收乙醇后， 经酸性溶液复溶， 酸性条件下有机溶剂脱色， 调节 pH 7.0 后离心、 过滤除去鞣 质 ； 取上清液， 调节 pH 12.0， 并配。
15、制成 0.1mg/mL-2mg/mL 上样液， 经弱极性大孔树脂吸附 后， 用纯水、 10 -30乙醇分别冲洗除去杂质， 50-90有机溶液洗脱， 收集洗脱液， 在真空 度 0.06Mpa-0.09Mpa、 65 -85下蒸发浓缩， 回收浸提液中的有机溶剂， 得到浓缩液， 经真 空干燥制得荷叶生物碱成品 ； 0012 (7) 将 (4) 中所提取的荷叶多糖粗提物， 经离心、 过滤后的上清液浓缩至糖浓度为 2-6， 调节pH6.0-7.0， 保持溶液温度为40-60下条件下， 经弱极性大孔树脂动态吸 附脱色后， 水洗出滞留于柱中的荷叶多糖， 并浓缩至糖浓度4-6， 用saveg除蛋白后， 在 真。
16、空度 0.06Mpa-0.09Mpa、 65 -85下蒸发浓缩， 得到浓缩液， 经真空或冷冻干燥制得荷 叶多糖成品。 0013 本发明所述的步骤 (2) 黄酮提取过程中的有机溶剂为甲醇、 乙醇或者正丁醇， 抗 氧化剂可以是特丁基对苯二酚、 丁基羟基茴香醚 (BHA) 或者二丁基羟基甲苯 (BHT) 等。 0014 本发明所述的步骤 (3) 生物碱提取过程中的有机溶剂为甲醇、 乙醇或者正丁醇， 抗氧化剂可以是 D- 异抗坏血酸或者 D- 异抗坏血酸钠等。 0015 本发明所述的步骤 (5) 黄酮纯化过程中的有机溶剂是甲醇、 乙醇或者正丁醇， 所 述的弱极性大孔树脂为 AB-8、 D101B、 H。
17、-30、 H-60 等。 0016 本发明所述的步骤 (6) 生物碱纯化过程中的有机溶剂是正已烷、 氯仿、 石油醚、 甲 醇、 乙醇或者正丁醇， 所述的弱极性大孔树脂为 D101D101、 H-20、 H-60、 C004、 C008 等。 。 0017 本发明所述的步骤 (7) 多糖纯化过程中所述的弱极性大孔树脂如 AB-8、 D208、 LSA-5B、 D4020、 D201、 S-8、 NKA、 MG-1 等， saveg 试剂配制用有机溶剂为氯仿、 正丁醇或者戊 醇。 0018 该方法克服了目前仅只能提取单一成分或在提取单一成分过程中对其他成分的 破坏或对其他成分提取率低、 或提取物杂。
18、质高等的缺点， 兼顾了黄酮、 生物碱和多糖的化学 性质， 充分考虑了各种成分提取过程中的相互影响、 活性和提取率。该方法同步提取的黄 酮、 生物碱和多糖， 具有提取率高， 纯度高， 提取效率高， 荷叶资源利用率高的特点。 具体实施方式 0019 本发明将通过以下实施例作进一步地说明。 0020 实施实例 1。 0021 取新鲜荷叶， 经含 0.1 NaCl 的磷酸溶液 (pH 3.0) 清洗以后， 烘干至水含量为 8时， 粉碎， 过 18 目筛， 称取粉碎后的荷叶干粉 100g， 微波处理， 输出功率为 300W， 总处理 说 明 书 CN 101402627 B3/3 页 5 时间为 2mi。
19、n， 然后加入由氨水调节 ph 13.0 的 50的乙醇溶液 2.5L， 同时加入特丁基对 苯二酚 (TBHQ)0.02g， 加热， 搅拌浸提 2h， 过滤得浸提液 1 ； 向滤渣中加入经盐酸调节 pH 2.0 的 90乙醇溶液 2.5L， 同时加入 D- 异抗坏血酸 0.05g， 加热， 搅拌浸提 2h， 过滤得浸提 液， 再向残渣中加入此种提取液按同样方法浸提， 过滤得浸提液， 合并两次浸提液， 是为浸 提液 2 ； 向残渣中加入纯水 3L， 加热， 搅拌浸提 2h， 过滤得浸提液 3。 0022 取浸提液1， 调节pH7.0， 浓缩至荷叶黄酮含量为3mg/mL， 泵入AB-8大孔树脂柱 。
20、中吸附， 上样量为 4BV， 以不同乙醇浓度的有机溶液各 2BV 梯度洗脱， 收集 70乙醇洗脱部 分， 减压回收乙醇， 再进一步浓缩后真空干燥， 得到棕黄色粉末产品 3.254g， 其中含荷叶黄 酮 2.747g， 纯度为 84.43。 0023 取浸提液 2， 减压回收乙醇， 再加入 2盐酸溶液 2L， 经超声溶解 1h 后， 用 2L 正已 烷分三次萃取色素， 调节溶液 pH 7.0， 离心， 过滤， 调节上清液 pH 13.0， 泵入 D101 大孔 树脂柱中吸附， 上样量为 2BV， 以不同甲醇浓度的有机溶液各 2BV 梯度除杂， 最后用 4BV 体 积 50甲醇溶液洗脱， 收集 5。
21、0甲醇洗脱部分， 减压回收甲醇， 再进一步浓缩后真空干燥， 得到黄绿色粉末产品 0.514g， 其中含荷叶生物碱 0.425g， 纯度为 82.76。 0024 取浸提液 3， 浓缩至糖度为 5， 调节 pH 6.0， 泵入柱温控制在 55下的 AB-8 大孔树脂柱中吸附脱色， 上样量为 5.5BV， 再以 1BV 的纯水冲洗滞留在柱中的荷叶多糖， 合 并漏出液， 减压浓缩后冷冻干燥， 得到略带黄色的白色粉末产品 10.085g， 其中含荷叶多糖 8.647g， 纯度为 85.74。 0025 实施实例 2。 0026 取新鲜荷叶， 经含 0.1 NaCl 的磷酸溶液 (pH 4.0) 清洗以。
22、后， 烘干至水含量为 8时， 粉碎， 过 18 目筛， 称取粉碎后的荷叶干粉 100g， 微波处理， 输出功率为 300W， 总处理 时间为 2min， 然后加入由氨水调节 pH 14.0 的 50的乙醇溶液 2.5L， 同时加入二丁基羟 基甲苯 (BHT)0.02g， 加热， 搅拌浸提 2h， 过滤得浸提液 1 ； 向滤渣中加入经盐酸调节 pH 3.0 的 90乙醇溶液 2.5L， 同时加入 D- 异抗坏血酸 0.05g， 加热， 搅拌浸提 2h， 过滤得浸提 液， 再向残渣中加入此种提取液按同样方法浸提， 过滤得浸提液， 合并两次浸提液， 是为浸 提液 2 ； 向残渣中加入纯水 3L， 加。
23、热， 搅拌浸提 2h， 过滤得浸提液 3。 0027 取浸提液1， 调节pH6.5， 浓缩至荷叶黄酮含量为3mg/mL， 泵入AB-8大孔树脂柱 中吸附， 上样量为4BV， 以不同乙醇浓度的有机溶液各2BV梯度洗脱， 收集60乙醇洗脱部 分， 减压回收乙醇， 再进一步浓缩后真空干燥， 得到棕黄色粉末产品 3.456g， 其中含荷叶黄 酮 2.833g， 纯度为 84.20。 0028 取浸提液 2， 减压回收乙醇， 再加入 2盐酸溶液 2L， 经超声溶解 1h 后， 用 2L 正已 烷分三次萃取色素， 调节溶液 pH 7.0， 离心， 过滤， 调节上清液 pH 14.0， 泵入 D101 大孔。
24、 树脂柱中吸附， 上样量为 2BV， 以不同甲醇浓度的有机溶液各 2BV 梯度除杂， 最后用 4BV 体 积 60甲醇溶液洗脱， 收集 60甲醇洗脱部分， 减压回收甲醇， 再进一步浓缩后真空干燥， 得到黄绿色粉末产品 0.502g， 其中含荷叶生物碱 0.420g， 纯度为 83.50。 0029 取浸提液 3， 浓缩至糖度为 6， 调节 pH 6.0， 保持溶液温度 55， 泵入 AB-8 大 孔树脂柱中吸附脱色， 上样量为 5.5BV， 再以 1BV 的纯水冲洗滞留在柱中的荷叶多糖， 合并 滤出液， 减压浓缩后冷冻干燥， 得到略带黄色的白色粉末产品 10.125g， 其中含荷叶多糖 8.726g， 纯度为 86.183。 说 明 书 。