技术领域
本发明属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
乳腺癌是影响妇女健康的最常见恶性肿瘤之一，已经成为女性疾病的第一杀手，发病率逐渐攀升，并逐渐呈现年轻化的趋势，预计到2030年，我国女性乳腺癌发病率将比2008年上升至31％。同时，乳腺癌有明显的家族遗传倾向，基因突变携带者的乳腺癌发病风险远高于一般人群。卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，发病隐匿，早期诊断困难，除遗传性卵巢癌外，没有一级防护措施。
易感基因是指和特定疾病具有一定关联的基因或等位基因。对乳腺癌/卵巢癌的易感基因及其突变位点进行测序，可得到具体的基因序列信息，进而评估乳腺癌/卵巢癌的遗传风险，可以做到早预防、早控制，降低疾病发生几率，提高广大女性健康水平。大量研究表明，遗传因素在疾病的易感性中发挥重要作用，复杂疾病的遗传因素通过微效基因作用的累加可以形成明显的表型综合效应。因此对乳腺癌卵巢癌的多个易感基因的遗传性突变，包括点突变、短片段插入、缺失等进行检测，并利用生物信息学方法对其进行分析注释，评估该测试个体是否为高风险人群至关重要。
目前，检测乳腺癌/卵巢癌易感基因常见方法有Sanger法、基因芯片法、荧光定量PCR法、高通量测序法等。Sanger测序法测序每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，检测效率低、成本高，且灵敏度低(20％)。基因芯片法、荧光定量PCR法检测乳腺癌/卵巢癌易感基因，该方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测探针形成检测芯片，因此无法用于检测未知突变位点，检测的结果也就不够全面、准确。高通量测序法主要是由测序仪器提供商提供的测序仪配套文库构建试剂盒，存在试剂盒货期长、规格固定、试验灵活性和准确性不够等不足。一些试剂厂商根据文献中分享报道的实验方法进行建库，但所完成的实验效果参差不齐，测序质量不高。
由此可见，现有技术还有待提高。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒和检测方法，能够同时检测多个样本多个乳腺癌/卵巢癌易感基因，且有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。
为达到本发明目的，采用以下技术方案：
一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物，包括100对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：200所示。
进一步的，所述特异性引物为经过修饰的引物。
进一步的，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。
进一步的，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。
一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的试剂盒，包括上述引物中的至少两对。
进一步的，所述试剂盒还包括通用引物、酶混合物、质控品、无核酸酶水；所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物等。
进一步的，所述质控品为人正常基因组DNA。
进一步的，所述特异性引物3’端和5’端分别标记Tag1和Tag2。
进一步的，所述特异性引物3’端Tag1序列与待测样本目标区域完全互补或部分互补；特异性引物5’端Tag2与通用引物完全互补或部分互补。
进一步的，所述通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样品的目标区域扩增产物进行连接和标记。
进一步的，所述通用引物3’端标记有Tag3；Tag3与特异引物Tag2完全互补或部分互补，长度为50-70bp。
进一步的所述特异性引物或所述试剂盒应用于乳腺癌/卵巢癌易感基因检测。
基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的方法，包括以下步骤：
S1：使用磁珠法对样本进行核酸提取，然后将所提取的样本核酸进行浓度及纯度的测定，测定合格后进行定量稀释，备用；
S2：用所述特异性引物或所述试剂盒对S1中所提取的核酸的目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物备用；
S3：使用磁珠法对S2中扩增产物进行核酸纯化，进行浓度及纯度的测定，然后混样，定量，上机测序。
进一步的，所述PCR扩增反应体系为：
所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP混合物等。
进一步的，所述PCR扩增反应程序为：
98℃，激活20min；循环1次；
72℃，延伸10min；循环1次。
进一步的，所述步骤S1中样本核酸包括乳腺癌/卵巢癌易感基因FGFR2、BRCA1、BRCA2、PALB2、GSTM1、MTHFR、GSTM1或TGF-β1中的至少一种。
进一步的，所述步骤S1中样本核酸包括乳腺癌/卵巢癌易感基因BRCA1(引物序列SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:86)、BRCA2(引物序列SEQ ID NO:87-SEQ ID NO:200)。
进一步的，步骤(2)中所述核酸的目标区域，它们可来源于同一个乳腺癌/卵巢癌易感基因，也可来源于不同的乳腺癌/卵巢癌易感基因；包括但不限于乳腺癌/卵巢癌易感基因上的内部序列、基因的外部调控序列；所述基因内部序列，包括但不限于基因的内含子区域、外显子区域、同时含有内含子与外显子的区域。
进一步的，所述检测方法的检测样本包括离体的全血样品、口腔脱落细胞样品、组织样品等；所述组织样品包括石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片等。
上述高通量测序平台包含但不限于Illumina HiSeq/MiSeq、Life Ion Torrent/Proton平台、华大基因BGISEQ-500/50等测序平台。
本发明有益效果：
本发明提供的特异性引物是针对乳腺癌/卵巢癌易感基因的全外显子设计的引物，结构稳定，覆盖范围广、检测位点多。每对特异性引物扩增目标区域大小为450-550bp，所有引物Tm值统一设计为58-62℃。
本发明提供的多重PCR引物设计时引进特异性修饰，比如硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰等修饰方法，修饰后的引物不易被核酸酶降解，确保PCR扩增特异性的同时保证其扩增效率；且具有相对均一的Tm值，在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，同时不存在非特异扩增，此方法省去多轮引物筛选的工作。具体的，硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶的降解，增强引物稳定性；脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替代，可以使双链溶解温度增长1.7℃，从而增加双链的稳定性；5’反向dT修饰后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，从而形成交联，形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。
本发明自主研发的基于高通量测序技术的针对乳腺癌/卵巢癌发病率较高的易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒和检测方法，能够用一次PCR扩增反应捕获和扩增多个样本多个乳腺癌/卵巢癌易感基因，包括点突变、短片段插入缺失等遗传性突变，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤、灵活提供试剂盒包装规格等。本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制，提高检测灵敏度；同时还能检测包括已知突变和未知突变位点的变异情况，得到全面准确的检测结果。通过对乳腺癌/卵巢癌的易感基因及其突变位点进行测序，可得到具体的基因序列信息，进而评估乳腺癌/卵巢癌的遗传风险，做到早预防、早控制，降低疾病发生几率，提高广大女性健康水平。
本发明采用磁珠纯化核酸的方式，省去了传统建库中的离心柱式纯化，操作简单；其次，本发明针对高通量测序技术设计的引物只需要一轮PCR，通过选取温度梯度、时间梯度、循环数经过大量正交实验，优化PCR反应程序，将样品传统建库的两次扩增融合在一个PCR反应体系进行，且本发明方法用引物直接在目标基因链中捕获目标区域并进行扩增，不需要对目标基因进行截断修饰等处理，节省了检测时间和成本。
附图说明
图1检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的方法流程图。
图2目标基因建库PCR扩增的原理图。
图3引物特异性验证结果图；其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：1-3号全血样品验证；4-6：4-6号口腔脱落细胞样品验证；7-9：7-9号石蜡组织样品验证。
图4引物灵敏度验证结果图；其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：1号全血样品三种模板浓度灵敏度验证；4-6：4号口腔脱落细胞样品三种模板浓度灵敏度验证；7-9：7号石蜡组织样品三种模板浓度灵敏度验证。
图5引物重复性验证结果；其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：实验员A检测2号全血样品、5号口腔脱落细胞样品、8号石蜡组织样品验证结果；4-6：实验员B检测2号全血样品、5号口腔脱落细胞样品、8号石蜡组织样品验证结果。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
实施例1一种基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法
1、引物的设计
所述对乳腺癌/卵巢癌易感基因序列选自于University of California Santa Cruz(UCSC)数据库，选用Primer3引物设计软件进行易感基因全外显子引物设计，设计范围包含了该基因中所有常见和不常见的突变热点。
本发明对乳腺癌/卵巢癌易感基因全外显子进行的引物设计共100对，每对特异性引物扩增目标区域大小为450-550bp，覆盖范围广、结构稳定、检测位点多；特异引物设计时引进特异性修饰，修饰后的引物不易被核酸酶降解，且具有相对均一的Tm值，统一设计为60℃左右(±2℃)；所述引物在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，同时不存在非特异扩增。具体的，所述引物特异修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。所述硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶的降解，增强引物稳定性；所述脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替代，可以增长双链溶解温度1.7℃，从而增加双链的稳定性；所述5’反向dT修饰后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，从而形成交联，形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。
本发明的测序引物在确保PCR扩增特异性的同时还能保证其扩增效率。
2、检测乳腺癌/卵巢癌易感基因试剂盒
本发明的检测乳腺癌/卵巢癌易感基因方法的试剂盒，包括：
特异性引物：用于扩增待测样品核酸中的多个目标区域，扩增范围至少覆盖目标基因的全外显子区域；
通用引物：用于在文库构建过程中，对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样品的测序文库进行标记，进而区分不同样品；
PCR反应液：包括酶混合物、无核酸酶水；所述酶混合物包括高保真DNA聚合酶(用量为1.25U/反应)、PCR Buffer(用量为1×)、dNTP混合物(用量为200μM/种/反应)；
质控品：人正常基因组DNA，来源于正常人全血样本；本发明质控品来源于市售。
3、基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的方法
包括以下步骤：
S1：利用纳米级超顺磁性羧基磁珠在不同盐浓度及疏水环境下与核酸分子可逆吸附的原理，特异吸附核酸分子，通过后续地洗涤及洗脱步骤，获得高纯度的核酸样本，使用Qubit或NanoDrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果，使用10mM Tris将核酸样本稀释至50-250ng/μL，优选的50-100ng/μL作为扩增建库的起始浓度。
使用1％琼脂糖凝胶电泳40min，对稀释后核酸的质量进行评估，根据琼脂糖凝胶电泳结果的均一性及完整性判断提取核酸的质量，核酸完整性好或发生轻微降解不影响建库效果。所提取的核酸浓度、纯度测定及1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后入组并分别进行标记。所述样本合格的标准为核酸浓度＞50ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一，无明显拖尾。
S2：用本发明的特异性引物或试剂盒对S1中待测样品核酸中的易感基因目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物，扩增产物片段长度为特异引物扩增片段与通用引物之和。
PCR扩增反应体系为：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；模板/质控品200ng；酶混合物12.5μL；无核酸酶水将体积补足至25μL。
PCR扩增反应程序为：
98℃，激活20min；循环1次；
72℃，延伸10min；循环1次。
当待测乳腺癌/卵巢癌易感基因有多个时，同一待测样品的不同乳腺癌/卵巢癌易感基因的扩增可同时进行或部分同时进行。在具体的实验过程中，可根据需要选用上述任一种方案进行。若分别进行扩增时，需要保证用于构建测序文库的扩增产物的量是一致的。当待测样品有多个时，不同样品的乳腺癌/卵巢癌易感基因的扩增必须分别进行。
S3：利用纯化磁珠分别对各样品的建库产物进行纯化。去除PCR产物中剩余的引物及dNTP等，回收扩增产物；进行浓度、纯度测定及1％琼脂糖凝胶电泳检测样品质量，所述样本合格的标准为核酸浓度＞2ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一，无明显拖尾。将所有合格核酸样品(不超过96个)浓度分别稀释至2nmol/L，并等体积混样，统一上机测序。
对照试验：
阳性对照反应体系包括：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；质控品200ng；无核酸酶水将体积补足至25μL。阳性对照用于检查反应体系的扩增能力是否正常和样本是否异常。
阴性对照反应体系包括：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；无核酸酶水将体积补足至25μL。阴性对照用于检查反应体系是否存在核酸物质污染。
阳性对照和阴性对照的反应程序同步骤S2的扩增反应程序。
实施例2引物特异性验证
利用实施例1中S1方法从全血样品(编号：1-3)、口腔脱落细胞样品(编号：4-6)、石蜡组织样品(编号：7-9)中提取核酸，进行浓度、纯度测定后，取合格样品使用10mMTris将每例样品稀释至100ng/μL，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测每例样品质量(合格标准同实施例1中S1步骤)，合格后入组并分别进行标记。利用实施例1中S2方法对上述9例合格样本进行扩增，上样量为各2μL，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中S3步骤)。9例样本使用乳腺癌/卵巢癌易感基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例一，检测方法与样本检测方法相同。检测结果见图3。
检测结果表示，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在600bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法能突破传统方法产生大量引物二聚体的限制，增强了引物特异性。
实施例3引物检测灵敏度验证
利用实施例1中S1方法从质检合格的全血样品(编号：1)、口腔脱落细胞样品(编号：4)、石蜡组织样品(编号：7)提取样品核酸进行引物检测灵敏度验证。每例样品起始浓度为100ng/μL，按照5倍、10倍、20倍浓度梯度稀释，稀释后每例样品浓度分别为20ng/μL、10ng/μL和5ng/μL，并分别进行样品名称及浓度标记。利用实施例1中S2方法对上述9例合格稀释样本进行扩增，上样量为各2μL，9例样本使用乳腺癌/卵巢癌易感基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例一，检测方法与样本检测方法相同。检测结果见图4。
检测结果表示，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在600bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显，易分辨。同时，即使模板含量低至10ng，依然能够成功扩增出目标条带，由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法能突破传统方法的限制，提高了检测灵敏度。
实施例4引物检测重复性验证
利用实施例1中S1方法从质检合格的全血样品(编号：2)、口腔脱落细胞样品(编号：5)、石蜡组织样品(编号：8)提取样品核酸进行引物检测重复性验证。由2名不同的操作员在2个不同的实验室平台按照实施例1中S2方法对上述3例样品分别进行扩增，上样量为各2μL，3例样本使用乳腺癌/卵巢癌易感基因特异引物由不同操作员在不同实验室得到的6个扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例一，检测方法与样本检测方法相同。检测结果见图5。
检测结果表示，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。3例样品共6个最终扩增产物主要集中在600bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。同时，不同的操作员及不同的实验平台检测结果无明显差异。由此可以看出，本发明的PCR扩增引物及检测方法重复性好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 广州奇辉生物科技有限公司
<120> 基于高通量测序技术检测乳腺癌/卵巢癌易感基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及
方法
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gcatgactac ttcccatagg c 21
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
cctggaagta attgtaagca tcc 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aacaagtgtt ggaagcaggg 20
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gcaaaagcgt ccagaaagg 19
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgtgaagaaa acaagctagc ag 22
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cttaaatgac tgcagtaacc agg 23
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tcacttctat aaatagactg gggc 24
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
cagcaagttg cagcgtttat ag 22
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gcaaaggaca ccacacacac 20
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
acttgtagtt ccatactagg tgatttc 27
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ttacccatgt gctgagcaag 20
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ttgtgtatca tagattgatg cttttg 26
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gcaataaaag tgtataaatg cctg 24
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gtcctttcac aattggtggc 20
<210> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
cagagtaaaa tcaaagtgtt tgttcc 26
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
tgtaattcaa cattcatcgt tgtg 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tccattgcat tatacccagc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
ctgaagacag agccccagag 20
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
tgacaatacc tacataaaac tctttcc 27
<210> 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
tctgagctgt gtgctagagg taac 24
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tttatgcagc agatgcaagg 20
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
cacttcctga ttttgttttc aac 23
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
aggtgttaaa gggaggaggg 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
atctccgtga aaagagcacg 20
<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
atgactgaat gaatatctct ggttag 26
<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
ctctttctct tatcctgatg gg 22
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tgcaaagggg agtggaatac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
tttccttctc tccattcccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
taagacaaag gctggtgctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ggtagagggc ctgggttaag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
gaatattgtg tcctccctct ctg 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
tcctactttg acactttgaa tgc 23
<210> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
aaacccatgc aaaaggacc 19
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
tccaggagaa tgaattgaca c 21
<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
agccagaagt ccttttcagg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
ggaccccaag aatgagctta c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
tctgtgcttc cagccctaag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
ttaaacgcca ccaattgagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
atgcccaggt ttcaagtttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
tgcttgggat cgattatgtg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cccgggctga agtgattc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
caaggtgggc agatcactg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gaatggatta tataccagag ctacaac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
agcctgggtg acagtgagac 20
<210> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
ccaacagcta taaacagtcc tgg 23
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
caccaggaag gaagctgttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
aaagtcggct ggcctaagtc 20
<210> 87
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
ctgacttccg ggtggtg 17
<210> 88
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
gactgggact gcggaagac 19
<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
caaattttcc agcgcttctg 20
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
agcaacactg tgacgtactg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
tgtctgtcac tggttaaaac taagg 25
<210> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
aacacaggtt tgcctaaatt cc 22
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
ttctcattcc cagtatagag gagac 25
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
aagatcttct accaggctct tagc 24
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
ccagcagctg aaatttgtga g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
tctcagggca aaggtataac g 21
<210> 97
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
tccttaatga tcagggcatt tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
tgacaattat caacctcatc tgc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
ttcactgtgt tgattgacct ttc 23
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
gacagcagag tttcacagga ag 22
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
tggacctagg ttgattgcag 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
aggcagaggt tgcggtaaac 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
caggagaagg ggtgactgac 20
<210> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
accattcaca ggccaaagac 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
tggaaagtca atgccaaatg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
ggctagaaat acgtggcaaa g 21
<210> 107
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
gttgtaccgt ctttggcctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
cttgcattga aagtctcttt agg 23
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
tgaagagcag catcttgaat c 21
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
aaacctgcat tcttcaaagc 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
tgtttgctca cagaaggagg 20
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
cagaaggaat cgtcatctat aaaac 25
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
gtgattgatg gtactttaat tttgtc 26
<210> 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
atgctgcagc caagacctc 19
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
cagttattta ttaccccaga agctg 25
<210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
gcacatacat cttgattctt ttcc 24
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
tcctacttcc aaggatgttc tg 22
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
aagcaagatt attcctttca ttagc 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
caattcaacc aaaacacaaa tc 22
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
ttggacctaa gagtcctgcc 20
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
ttggtttatg ttcttgcaga gg 22
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
aggcttgctc agtttctttt g 21
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
aacataacat taagaagagc aaaatg 26
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
catctggttt tcaggcactt c 21
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
aacacctagc caaaaggcag 20
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
tgcagagctt cagtagaaac attc 24
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
ttaaacggaa gtttgctggc 20
<210> 128
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
tttctactgg cagcagtata tttg 24
<210> 129
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
ttcaagtaaa tgtcatgatt ctgttg 26
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
cttgagcttt cgcaacttcc 20
<210> 131
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
ttcataaaga tgaaacggac ttg 23
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
tgtttcctca taacttagaa tgtcc 25
<210> 133
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
aaaatattag tgtcgccaaa gagtc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
tttagggtct ttgcccattg 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
aacccgaacg tgatgaaaag 20
<210> 136
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
gatttgtgta acaagttgca ggac 24
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
agctgcccca aagtgtaaag 20
<210> 138
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
tcagaatggt aggaatagct gttag 25
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
ttcagtcatt gaaaattcag cc 22
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
cagtttgtgg gtatgcattt g 21
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
cttgattctg gtattgagcc ag 22
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
aatgcctcgt aacaacctgc 20
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
tggtaaaatc gtttgtgttt cac 23
<210> 144
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
gactgactta tgaagcttcc ctatac 26
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
tgaatgtagc acgcattcac 20
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
aaacttgctt tccacttgct g 21
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
aagatagtac caagcaagtc ttttcc 26
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
ttttctgaag aaccaccttc aac 23
<210> 149
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
ttaagggagt gttagaggaa tttg 24
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
gcaatttcta ctgcttctgt ttc 23
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
ttgggaaaag aacaggcttc 20
<210> 152
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
tctgtatatc aaaccatact cccc 24
<210> 153
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
tgaagactga ctttactctt tcaaac 26
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
taggcacagt ggctcatgtc 20
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
tgctgatttc tgttgtatgc ttg 23
<210> 156
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
caatttcctt aattcctctc aacc 24
<210> 157
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
agggtctgca acaaaggc 18
<210> 158
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
cttttgtctg ttttcctcca ag 22
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
tttcaggaca tccattttat caag 24
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
catcaggaca ttatttaaca acgg 24
<210> 161
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
gtgagccact gtgcctgg 18
<210> 162
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
ccattcctgc actaatgtgt tc 22
<210> 163
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
tttggtaaat tcagttttgg tttg 24
<210> 164
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
gagaagaaag agggatgagg g 21
<210> 165
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
accatgctca gcaatgaag 19
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
cactgacaac tggcttgtgc 20
<210> 167
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<400> 168
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
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<213> 人工序列
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