技术领域
本发明涉及一种疫苗，具体涉及一种包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由汉坦病毒引起的急性病毒性传染病，该病危害严重，病死率高，中国是世界上肾综合征出血热疫情最严重的国家，目前，对于该病尚无特异有效的治疗药物，主要靠疫苗进行预防。国内虽已研制出肾综合征出血热灭活病毒疫苗，但是该类疫苗刺激机体产生中和抗体滴度较低，不能有效刺激机体产生细胞免疫应答，此外，原代细胞和脑组织灭活疫苗的材料多来源于动物，而动物饲养的质量控制问题，尤其是潜在的动物病毒对人体的可能危害是需要解决的关键问题。随着生物技术的发展，现已涌现出有多种疫苗研制的方法。
病毒样颗粒（Virus-like particle, VLP）是病毒复制过程中自然产生或通过基因工程表达病毒结构蛋白并自行组装出的不含病毒核酸的颗粒样物质，除核酸外其结构与来源病毒基本一致，并具有与病毒最接近的抗原结构和免疫学特性。VLP的这种特点使其在疫苗的研究中倍受青睐。现在常用昆虫细胞表达系统制备VLP，但是对于多个蛋白组成的VLP，需要制备表达各个蛋白的杆状病毒，再将这些杆状病毒以不同的比例共同感染昆虫细胞，包装出所需要的VLP， 由于重组杆状病毒在表达中必不可少，产品中混合的杆状病毒为后期纯化带来一定的困难。另外，昆虫细胞表达系统糖基化与哺乳动物细胞仍有差别，这可能会影响后期的免疫效果。而哺乳动物细胞表达系统由于翻译后修饰、蛋白折叠等过程的高保真性，成为最广泛应用于VLP研究和工业生产的表达系统。哺乳动物细胞适用于各类复杂的包膜VLP的表达，并且其表面的蛋白组成与原病毒最为接近。此外，哺乳动物细胞可通过筛选构建稳定表达VLP的细胞系，有利于疫苗的研究和工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒及其制备方法与应用，作为肾综合征出血热的预防疫苗。
本发明所采用的技术方案是：
包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：
基于哺乳动物细胞表达系统能够正确折叠、组装和翻译后修饰蛋白的特点，通过构建真核表达载体，共转染dhfr- CHO细胞，组装含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒。
所述制备方法由以下步骤实现：
步骤一：载体构建：
将汉坦病毒76-118株核衣壳蛋白S基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，构建S基因表达载体；
将汉坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，GM-CSF基因克隆入SV40启动子下，构建M基因和GM-CSF基因的共表达载体；
步骤二：含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备：
将步骤一得到的两种载体各10μg共转染dhfr- CHO细胞，于培养基培养24 h后弃去维持培养基，PBS洗涤三次后加入无血清筛选培养基，48 h后收集含有VLP的培养上清；经蔗糖密度梯度离心纯化后，低温保存。
步骤二中，培养基为含10%FBS、100nM MTX、0.1mM次黄嘌呤、0.016mM胸腺嘧啶的IMDM培养基。
步骤二中，无血清筛选培养基为含500 nM MTX、800μg/ml G418的Hycell培养基。
如所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法制得的病毒样颗粒。
如所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒在制备肾综合征出血热预防疫苗方面的应用。
本发明具有以下优点：
1、通过构建真核表达载体，使嵌合VLP的各个组分均能表达，在细胞内能组装出结构正确的含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒并释放至培养上清中，GM-CSF分子锚定在病毒样颗粒的包膜上，从而可以有效发挥免疫增强作用。
2、构建的真核表达载体上含有多个筛选标记，通过筛选可以建立稳定表达病毒样颗粒的细胞株，便于大规模生产和制备。
3、本发明制备的含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒，免疫小鼠后可以有效刺激产生体液免疫和细胞免疫应答，并且对病毒感染的小鼠有保护作用，可用于汉坦病毒感染的预防。
附图说明
图1为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒载体构建示意图。
图2为间接免疫荧光检测糖蛋白GP和GM-CSF的表达。
图3为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的透射电镜检查结果（A.转染细胞样品；B.细胞培养上清）。
图4为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的Western-blot检测结果。
图5为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠血清中特异性抗体的检测。
图6为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠血清中中和抗体的检测。
图7为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠脾细胞细胞因子分泌水平检测。
图8为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫后小鼠脾细胞CTL杀伤活性检测。
图9为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫小鼠经汉坦病毒（HTNV 76-118）攻击后脏器组织中病毒抗原的ELISA检测结果。
图10为含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒免疫小鼠经汉坦病毒（HTNV 76-118）攻击后脏器组织中汉坦病毒核酸的qRT-PCR检测结果（A.心脏 B.肝脏 C.脾脏 D.肺脏 E.肾脏 F.脑）。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
汉坦病毒是单负链RNA病毒，其基因组包括L、M、S三个片段，分别编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn和Gc以及核衣壳蛋白。包膜糖蛋白和核衣壳蛋白都是诱导机体免疫应答的主要结构蛋白，糖蛋白可刺激机体产生中和抗体，在机体的保护性体液免疫应答中起主要作用，但其免疫原性弱，刺激机体细胞免疫应答的能力较弱；核衣壳蛋白的免疫原性较强，但不能有效刺激机体产生中和抗体。本发明中利用真核表达系统，在哺乳动物细胞表达一种含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒，其组成正确，在小鼠体内能够有效地刺激产生体液免疫和细胞免疫应答，且对病毒感染的小鼠具有一定的保护作用。
本发明涉及的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，基于哺乳动物细胞表达系统能够正确折叠、组装和翻译后修饰蛋白的特点，通过构建真核表达载体，组装含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒，具体由以下步骤实现：
步骤一：载体构建：
将汉坦病毒76-118株核蛋白S基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，构建S基因表达载体（图1中A载体）；
将汉坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，GM-CSF基因克隆入SV40启动子下，构建M基因和GM-CSF-GPI基因的共表达载体（图1中B载体）；
上述两个载体具有如下特征：
1、在启动子区使用了增强转录的调控序列EASE2.1，该序列可使转录活性提高70%，从而提高目的蛋白的表达量。
2、由于GM-CSF是可溶性蛋白，不在膜表面表达，故在其3’端添加CD59的膜锚定区基因片段，使GM-CSF表达在细胞膜表面。
3、表达M基因的载体切除了G418抗性筛选基因，将GM-CSF-GPI基因构建在该位置上，GM-CSF和糖蛋白M基因同时表达，使GM-CSF锚定在包装出的VLP包膜上，有利于GM-CSF发挥免疫佐剂的作用，增强VLP所诱导的免疫应答；表达S基因的载体对G418抗性基因进行了E182D突变，以利于筛选高表达细胞株。
4、在载体中使用了内核糖体进入位点（IRES）, 利用IRES分段表达二氢叶酸还原酶（DHFR）。表达S基因的载体只表达DHFR1-105氨基酸，表达M基因的载体只表达DHFR105-187氨基酸，这样可高效迅速地筛选稳定表达汉坦病毒嵌合VLP的细胞株，而且在MTX加压扩增过程中，有利于目的基因以等摩尔比例扩增，有利于进一步提高表达量，组装出结构完整的VLP。
5、针对DHFR进行了L22R的突变，和野生型DHFR相比，降低了与MTX的亲和力也降低了活性，在达到筛选高效表达目的蛋白细胞株的同时使该表达系统可以在含有野生型DHFR的细胞中进行MTX筛选，适用于更多的细胞类型。
步骤二：汉坦病毒样颗粒的制备：
将步骤一得到的两种载体各10μg共转染dhfr- CHO细胞，于培养基培养24 h后弃去维持培养基，PBS洗涤三次后加入无血清筛选培养基，48 h后收集含有VLP的培养上清；离心去除细胞碎片及大的蛋白聚集体后，经蔗糖密度梯度离心纯化后，低温保存。
上述培养基为含10%FBS、100nM MTX、0.1mM次黄嘌呤、0.016mM胸腺嘧啶的IMDM培养基。
上述无血清筛选培养基为含500 nM MTX、800μg/ml G418的Hycell培养基。
所制得的病毒样颗粒可应用于制备肾综合征出血热的预防疫苗。
、电镜观察VLP：
细胞转染后48 h将细胞用胰蛋白酶消化后，装入1.5 ml离心管，1000 rpm离心5 min，弃上清，在细胞沉淀中加入戊二醛固定液。70%、80%、90%丙酮及纯丙酮梯度脱水处理，并制成包埋样品，超薄切片后苯胺黑染色。在电镜下观察细胞样品中的VLP的大小及形态。另取纯化后的VLP分别滴一小滴于铜网上，室温放置90s，再滴一小滴磷钨酸染色液于VLP液体中，小心吸去多余液体，室温静置待其固定后在进行电镜下观察，以观察上清中的VLP。
、Western-blot检测：
在经纯化的各组VLP样本中加入10×SDS-PAGE loading buffer和β-巯基乙醇，混匀后沸水浴5 min处理样品和预染蛋白marker。取处理过的样品40 μl加入蛋白凝胶进行SDS-PAGE分析，160 V电泳50 min。电泳结束后取与凝胶相应大小的PVDF膜用电转仪进行转膜，100 V电转45 min。电转完毕后将印迹有蛋白的PVDF膜放入含5% BSA的PBST封闭液中，室温封闭2 h。加入稀释好的抗病毒包膜糖蛋白和核衣壳蛋白的抗体以及GM-CSF多抗（Gn mAb和Gc mAb分别检测Gn和Gc，1A8 mAb检测NP，GM-CSF pAb检测GM-CSF）。4 °C孵育8h，用PBST洗涤3次后，加入红外标记的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG，4 °C孵育4 h，用PBST洗涤3次后，红外成像仪采集图像分析。
含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的免疫学特性研究：
将48只C57BL/6小鼠随机分为4组，每组12只。按下表1所示的分组及剂量，采用皮下注射方式进行免疫，14 d后加强免疫一次，28 d后再加强免疫一次，共免疫3次，各组的免疫剂量如表1所示。GM-CSF+VLP表示以重组鼠GM-CSF与汉坦病毒VLP联合免疫。
1、体液免疫反应检测：
（1）小鼠血清中特异性抗体的检测：将经纯化的HTNV GP和NP全长肽稀释至0.15 μg/ml，分别包被96孔聚苯乙烯微板，4 oC过夜，PBST洗涤三次后加入含1% BSA的PBS缓冲液，37 oC孵育1 h。PBST洗涤三次，加入倍比稀释的各组小鼠血清和正常小鼠血清，37 oC孵育1 h。PBST洗涤三次，加入1:1000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG，37 oC孵育1 h。PBST洗涤三次，拍干后加入TMB显示液，室温避光静置20 min后加入2 M H2SO4终止反应，多功能酶标仪读取450 nm吸光度值。以正常小鼠血清检测结果为阴性，实验组小鼠血清检测数值与阴性比值大于2.1判定结果为阳性。
（2）小鼠血清中中和抗体检测：前一日将Vero E6细胞以胰蛋白酶消化，1000 rpm离心5 min，用含10% FBS的RPMI-1640培养液重悬，调整浓度至1×105个/ml，加入96孔细胞培养板，每孔100 μl。将各组小鼠血清用0.22μm滤器过滤除菌，加RPMI-1640按1:80、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，与100 TCID50的HTNV病毒1:1体积混合，37 oC，CO2培养箱中孵育1 h。将96孔板中培养液弃去，PBS洗2次，将病毒与血清混合液依次加入孔板，每个样品加4个复孔，每孔200 μl，同时设置不加病毒的孔。将3G1 mAb按相同方法稀释后与100 TCID50的HTNV病毒1:1混合，孵育后加入孔板作为对照。37 oC，CO2培养箱孵育12 d后将孔板室温/-80 oC反复冻融3次，1000 rpm离心10 min后吸出孔板中上清待用。
1A8 mAb包被96孔聚苯乙烯微板，4 oC过夜。PBST洗涤三次，加入上述上清， 37oC孵育1 h。PBST洗涤三次，加入1:400稀释的HRP-1A8，37oC孵育1 h。PBST洗涤三次，拍干后加入TMB显色液，室温避光静置20 min，多功能酶标仪读取450 nm吸光度值，以正常细胞孔检测值为阴性，实验孔读值与阴性比值小于2.1认为病毒被中和，4个复孔中有三个或全部四个孔比值小于2.1则认为该稀释比例的血清有中和作用。
2、细胞免疫反应检测：
（1）小鼠脾细胞细胞因子分泌水平的检测：处死小鼠，75%酒精浸泡3 min后，置于超净工作台内剪开小鼠腹部皮肤和腹膜，取出脾脏，200目筛网研磨后加2 ml红细胞裂解液，室温静置2 min，加含2% FBS的RPMI-1640并轻柔混匀，室温静置5 min终止裂解，1000 rpm离心5 min，弃去上清并加入含10% FBS的RPMI-1640培养液将细胞重悬，置37oC，CO2细胞培养箱中培养。前一日将ELISPOT孔板按照说明书要求预处理并包被IL-2、IL-4、IL-10抗体（IFN-γ检测试剂盒提供预包被板），4 oC过夜。弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，加入含10% FBS的RPMI-1640培养液4 oC封闭6 h。将各组小鼠脾细胞分为三部分，用含5% FBS的RPMI-1640培养液调整浓度至2×107 个/ml，分别加入ELISPOT孔板中，每孔50 μl，再分别加入20μg/ml的Gn肽池、Gc肽池及NP肽池，每孔50 μl。同时设置加入相同浓度ConA、只加入脾细胞、只加入培养液的孔作为对照，孔板置于37 oC CO2培养箱孵育24 h。弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，分别加入试剂盒提供的生物素标记抗IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4单克隆抗体，4 oC孵育过夜。弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，加入试剂盒提供的HRP标记抗生物素抗体，室温静置4 h。弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，加入TMB显色液，置于37 oC恒温箱，待孔板底部有斑点形成后，去离子水冲洗以终止反应。避光待孔板干燥后，ELISPOT检测仪读取每孔斑点数，计算斑点形成细胞数（Spot-forming cells，SFC）。
（2）免疫小鼠脾细胞CTL杀伤活性的检测：将各组小鼠脾细胞分为三部分，分别加入10 μg/ml的GP肽池及NP肽池，并同时与25 U/ml的IL-2混合。37 oC CO2细胞培养箱中培养24 h，将各肽池刺激的小鼠脾细胞均稀释成2×107个/ml、1×107个/ml、0.5×107个/ml、0.25×107个/ml的浓度，作为杀伤实验的效应细胞。将HTNV感染的小鼠腹腔巨噬细胞胰蛋白酶消化，1000 rpm离心5 min，加含10% FBS的RPMI-1640重悬细胞，并调整浓度至2×105个/ml，作为杀伤实验的靶细胞。将各浓度的效应细胞和靶细胞1:1混合，形成100:1、50:1、25:1、12.5:1的效靶比。将效应细胞-靶细胞混合液加入到U底96孔细胞培养板中，每孔100 μl。同时设置乳酸脱氢酶（LDH）孔作为阳性对照，靶细胞与裂解液混合（靶细胞LDH最大释放）、只加入效应细胞（效应细胞自发释放LDH）、只加入靶细胞（靶细胞自发释放LDH）和只加入培养液的孔（阴性对照），37 oC CO2培养箱中孵育24 h。1000 rpm离心孔板10 min，将上清转移至新96孔微板中，加入试剂盒提供的底物，每孔50μl，加入1 M H2SO4终止反应。室温避光静置20 min，多功能酶标仪读取490 nm吸光度值，按以下公式计算杀伤效率：
3、疫苗对病毒感染动物的保护作用：
在第二次加强免疫后第14 d，以100LD50的汉坦病毒（HTNV 76-118）感染各组小鼠，每组感染4只，腹腔注射，100 μl/只。注射后第3 d，颈脱臼处死小鼠，取各组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑进行检测。
（1）小鼠脏器组织中病毒抗原的检测：
将小鼠各脏器组织加入RPMI-1640并充分研磨，室温/-80oC反复冻融三次，10,000 rpm 4 oC离心30 min，0.45 μm滤器过滤彻底去除组织碎块后BCA法测定各组总蛋白浓度，加RPMI-1640统一稀释成1 mg/ml。采用2.1.5中ELISA方法检测HTNV抗原。
（2）小鼠脏器中病毒核酸的检测：
HTNV S基因及小鼠GAPDH引物序列如下：
取各组小鼠脏器加入液氮后研碎，加入组织总RNA提取试剂盒提供的裂解液，重复研磨后按照试剂盒要求提取组织总RNA。以提取的总RNA为模板，使用RT-PCR试剂盒将其反转录为cDNA。将获得的cDNA分为两部分，以HTNV Forward/Reverse为引物进行实时定量PCR检测HTNV特异性核酸，同时使用小鼠GAPDH Forward/Reverse为引物进行实时定量PCR检测作为对照。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。