技术领域
本发明涉及一种测定非同源末端连接修复活性的方法，属于分子生物学领 域。
背景技术
非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)是一种细胞修复DNA 双链断裂的通路，该修复过程不需要模版染色体的参与，能够直接重新连接两 个断裂的DNA末端。然而与另外一种同源重组(Homologous recombination,HR) 修复不同，NHEJ修复往往伴随着核苷酸的插入或缺失，从而使基因发生突变， 失去基因的功能。
DNA作为遗传信息的保存者，其完整性对细胞来说至关重要。多种内源或 外源因素都能造成细胞基因组DNA损伤,细胞内具有应对不同形式损伤的复杂 的修复系统。其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)作为最严重最 致命的损伤形式，如果没有被及时修复，将导致细胞死亡。在肿瘤的临床治疗 中，放疗和多数化疗药物可以导致肿瘤细胞DNA双链断裂，肿瘤细胞主要通过 NHEJ和HR修复来对断裂的DNA双链进行修复，其中NHEJ不存在细胞周期 依赖性，是细胞中修复DNA双链断裂的主要方式，其活性在一定程度上决定了 肿瘤细胞对电离辐射和化疗药物的敏感性，当肿瘤细胞中的NHEJ修复活性被 抑制后，放疗和化疗的效果能得到明显的改善。
目前可以用来测定NHEJ活性的方法主要有DNA双链断裂特异性蛋白 γH2AX和53BP1染色，DNA断裂片段的中性彗星电泳，以及采用比较复杂的 分子生物学手段来研究NHEJ的活性，如在大范围核酸酶I-SceI基础上设计的针 对NHEJ修复活性的报告质粒，转染细胞后筛选稳定表达细胞株，再引入I-SceI 核酸酶进行DNA双链断裂的诱导，最后通过观察报告质粒的荧光表达来反应 NHEJ修复的能力(Identification of Novel Radiosensitizers in a High-Throughput, Cell-Based Screen for DSB Repair Inhibitors，Alexander G，《Molecular Cancer Therapeutics》第14卷，第326-342页，2015年2月)。但是上述这些方法比较 复杂且步骤繁多，而且需要一些特异性的染色以及对特定细胞株的筛选。
基因组定点编辑技术目前发展迅速，现在主要有三种类型，锌指核酸内切 酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，规律性重复短序列丛集及其系统 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/CRISPR associated system,Cas9)，这些技术可以对基因组中特定的DNA位点进行切断， 通过诱导NHEJ或HR修复来达到对基因定点编辑的目的，而且突变效率高、制 作简单、成本较低。因此如何利用基因组定点编辑技术来简明的测定非同源末 端连接修复活性成为当前亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种测定非同源末端连接修复 活性的方法。
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine-guanine phosphoriboSyltrans ferase,HPRT)参与细胞内嘌呤核苷酸生物合成的补救途径，6-硫代鸟嘌呤 (6-Thioguanine，6-TG)能在该酶的作用下掺入DNA中，从而抑制DNA合成， 使细胞无法存活。如果用上述基因定点编辑技术在HPRT基因上造成DNA双链 断裂，当HPRT基因通过NHEJ修复发生突变后，可使细胞在含有6-TG的培养 基中存活，而没有发生NHEJ修复而突变的细胞则不能在含有6-TG的培养基中 存活，这样存活细胞的数量及活力就反映了NHEJ修复水平的高低。
本发明的原理是采用基因定点突变技术(ZFN，TALEN或CRISPR/Cas9) 在HPRT基因上诱导DNA双链断裂，当HPRT基因的断裂点发生NHEJ修复时， 会发生基因突变，导致细胞内HPRT功能失活。正常细胞在HRPT失活后并不 会影响细胞的功能，但是在含有6-TG的培养基中，6-TG可以在HPRT的作用 下掺入DNA引起细胞死亡，而发生NHEJ后突变的细胞由于HPRT基因功能失 活，可以抵抗6-TG的毒性而存活下来，最终可以通过检测细胞的活力来了解细 胞的NHEJ修复活性。
本发明的技术方案是：
一种测定非同源末端连接修复活性的方法，包括下述步骤：
一种测定非同源末端连接修复活性的方法，包括下述步骤：
(1)采用TALEN技术或CRISPR/Cas9技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶基因的质粒；
(2)对(1)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端连接修 复分子抑制剂进行处理，得到经抑制处理的哺乳动物细胞；
(3)将(2)中所得的哺乳动物细胞用含有6-硫代鸟嘌呤的DMEM培养基 进行培养；
(4)在经(3)处理好的哺乳动物细胞中加入MTT溶液，待蓝色甲臜颗粒 形成后用DMSO溶解，然后采用酶标仪测定其在OD570nm的吸光值。
其进一步的技术方案是：
步骤(1)中采用TALEN技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基 因的质粒时，所设计打靶基因的左臂识别序列为SEQ ID NO:1，设计打靶基因的 右臂识别序列为SEQ ID NO:2。
步骤(1)中采用CRISPR/Cas9技术构建针对次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶基因的质粒时，所设计的靶点引物的正向引物序列为SEQ ID NO:3，所设计的 靶点引物的反向引物序列为SEQ ID NO:4。
步骤(2)中所述哺乳动物细胞为293T细胞，所述非同源末端连接修复分 子抑制剂为非同源末端连接修复分子DNA-PK的抑制剂NU7441和DNA-PKcs siRNA中的一种，且所述DNA-PKcs siRNA的基因序列为SEQ ID NO:5。
步骤(2)中对(1)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端 连接修复分子抑制剂进行处理是指：将步骤(1)中构建所得的质粒转染293T 细胞并对转染后的293T细胞采用非同源末端连接修复分子DNA-PK抑制剂 NU7441处理。
步骤(2)中进行质粒转染的过程包括：将293T细胞接种在培养皿中，当 该细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000作为转染试剂将(1)中构建 所得的质粒转染293T细胞。
步骤(2)中对(1)中构建所得的质粒结合哺乳动物细胞采用非同源末端 连接修复分子抑制剂进行处理是指：将步骤(1)中构建所得的质粒和DNA-PKcs siRNA共转染293T细胞。
步骤(2)中进行质粒转染的过程包括：将293T细胞接种在培养皿中，当该 细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000作为转染试剂将(1)中构建所得 的质粒和DNA-PKcs siRNA共转染293T细胞。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明所述方法采用基因定点 突变技术来对HPRT基因进行突变，之后需要质粒转染、药物处理、6-TG处理步 骤，最后通过简单的细胞活力检测来观察NHEJ修复的活性，这种方法可以通过 检测细胞活力来观察细胞NHEJ修复的活性水平，可用于筛选不同药物、不同基 因对NHEJ修复的作用，测定不同细胞系对NHEJ活性抑制药物和基因的反应，从 而可以发现具有化疗和放疗增敏效果的药物和基因。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术 手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附 图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明测定NHEJ活性的方法的技术方案图；
图2为本发明中不同浓度NU7441对NHEJ修复活性的影响；
图3为本发明中2.0μmol/L NU7441处理不同时间对NHEJ修复活性的影响；
图4为本发明中DNA-PKcs siRNA转染对NHEJ修复活性的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以 下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述具体实施例中TALEN构建试剂盒购自斯丹赛生物技术有限公司， CRISPR/Cas9构建试剂盒购自唯尚立德生物技术有限公司，NHEJ修复分子 DNA-PK抑制剂NU7441购自Selleck公司，DNA-PKcs siRNA由吉玛基因公司 合成，引物由invitrogen上海公司合成，用蒸馏水配置成10μmol/L，转染试剂 Lipofectamine 3000购自invitrogen上海公司，MTT购自上海生工生物工程公司。
具体实施例一：
采用TALEN技术测定不同浓度NU7441对NHEJ的抑制作用，其具体步骤 为：
(1)构建针对HPRT基因的TALEN质粒。具体步骤为：按照TALEN设计 原则设计打靶HPRT基因的左臂和右臂识别序列，左臂识别序列： ATGACCTTGATTTA(SEQ ID NO:1)，右臂识别序列：CCAAATCCTCAGCA (SEQ ID NO:1)，按照TALEN构建试剂盒的方法，将两个识别序列插入相应的 骨架载体，转化感受态大肠杆菌，均匀涂布于卡那霉素抗性(20μg/ml)的平板 中，置于37℃培养箱中培养12～16h后挑选3～5个单克隆接种于5ml LB培养液 (含卡那霉素20μg/ml)，置于37℃250rpm的摇床中培养16h，抽提质粒测序， 并与设计的识别序列比对，获取测序正确的左臂和右臂TALEN质粒。
(2)将左臂和右臂TALEN质粒转染293T细胞。具体步骤为：将293T细 胞接种在6cm培养皿中，当细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000将4 μg左臂质粒和4μg右臂质粒转染293T细胞。
(3)不同浓度的抑制剂NU7441处理293T细胞。具体步骤为：将TALEN 质粒转染24h后的细胞接种至96孔板，待细胞贴壁后分别用0，0.1，0.5，1.0， 2.0μmol/L的NU7441处理4h。
(4)6-TG处理细胞。具体步骤为：在NU7441处理结束后，用含有30μmol/L 6-TG的DMEM培养基培养293T细胞72h。
(5)MTT法测定细胞活力。具体步骤为：处理结束后加入MTT溶液，2h 后蓝色甲臜颗粒形成，用DMSO溶解后用酶标仪测定各孔在OD570nm处的吸 光值。细胞活力反映了NHEJ修复的活力，空白对照组设为NHEJ活力为100％。
实验结果如图2所示，在293T细胞中，NU7441浓度在0.5，1.0μmol/L时 处理4h，对NHEJ修复活性的抑制效果最佳，抑制率在50％左右，当浓度提高 到2.0μmol/L时，抑制效果反而减弱。
具体实施例二：
采用CRISPR/Cas9技术测定2.0μmol/L NU7441对NHEJ抑制作用的时间依 赖性，其具体步骤为：
(1)构建针对HPRT基因的Cas9/gRNA质粒。具体步骤为：按照gRNA 设计原则设计HPRT靶点引物，正向引物：AAACACCGAAAGGGTGTTTATTC CTCA(SEQ ID NO:3)，反向引物：CTCTAAAACTGAGGAATAAACACCCTTT (SEQ ID NO:4)，将引物退火形成二聚体，按照CRISPR/Cas9构建试剂盒的方 法，将gRNA序列引物二聚体插入Cas9/gRNA质粒，转化感受态大肠杆菌，涂 于氨苄抗性的平板，挑选3～5个单克隆摇菌，提取质粒进行测序并与设计的识 别序列比对，获得测序正确的Cas9/gRNA质粒。
(2)将Cas9/gRNA质粒转染293T细胞。具体步骤为：将293T细胞接种 在6cm培养皿中，当细胞密度达到70％时，采用Lipofectamine 3000将5μg Cas9/gRNA质粒转染293T细胞。
(3)2.0μmol/L NU7441处理293T细胞。具体步骤为：将Cas9/gRNA质粒 转染24h后的细胞接种至96孔板，待细胞贴壁后分别用2.0μmol/L的NU7441 分别处理0，0.5，1，2，4h。
(4)6-TG处理细胞。具体步骤为：在NU7441处理结束后，用含有30μmol/L 6-TG的DMEM培养基培养293T细胞72h。
(5)MTT法测定细胞活力。具体步骤为：处理结束后加入MTT溶液，2h 后蓝色甲臜颗粒形成，用DMSO溶解后用酶标仪测定各孔在OD570nm处的吸 光值。细胞活力反应了NHEJ修复的活力，空白对照组设为NHEJ活力为100％。
实验结果如图3所示，在293T细胞中，2.0μmol/L NU7441处理1h对NHEJ 修复活性的抑制效果最佳，抑制率在50％左右，随着处理时间的进一步延长， 对NHEJ活性的抑制作用减弱。
具体实施例三：
采用CRISPR/Cas9技术测定DNA-PKcs siRNA对NHEJ的抑制作用，其具 体步骤为：
(1)构建针对HPRT基因的Cas9/gRNA质粒，其具体步骤参见具体实施例 二中(1)所述。
(2)将Cas9/gRNA质粒和DNA-PKcs siRNA共转染293T细胞。其具体步 骤为：将293T细胞接种在6cm培养皿中，当细胞密度达到70％时，采用 Lipofectamine 3000将3μg Cas9/gRNA质粒和3μg DNA-PKcs siRNA共转染 293T细胞，对照组转染阴性对照siRNA。其中DNA-PKcs siRNA的基因序列为 UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO:5)。
(3)6-TG处理细胞。其具体步骤为：转染24h后细胞接种至96孔板，当 细胞贴壁后将培养基换成含有30μmol/L 6-TG的DMEM培养基，继续培养72h。
(4)MTT法测定细胞活力。其具体步骤为：处理结束后加入MTT溶液， 2h后蓝色甲臜颗粒形成，用DMSO溶解后用酶标仪测定各孔在OD570nm的吸 光值。细胞活力反应了NHEJ修复的活力，对照组设为NHEJ活力为100％。
实验结果如图4所示，用siRNA转染降低NHEJ修复关键分子DNA-PKcs 的表达后，293T细胞中NHEJ修复活性受到了明显的抑制。
综上，本发明所述方法可以通过检测细胞活力来观察细胞NHEJ修复的活 性水平。这种方法需要基因定点突变技术来对HPRT基因进行突变，之后需要 质粒转染、药物处理、6-TG处理步骤，最后通过简单的细胞活力检测来观察NHEJ 修复的活性，这种方法可以用来筛选不同药物、不同基因对NHEJ修复的作用， 可以测定不同细胞系对NHEJ活性抑制药物和基因的反应，从而可以发现具有 化疗和放疗增敏效果的药物和基因。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还 可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。