技术领域
本发明属于环境检测技术领域，涉及一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法。
背景技术
夏秋时节旅游旺季海滨浴场承受着超负荷的压力，给浴场水质带来了严重的影响，同时也增加了病原微生物的传播机会。细菌是引发感染性疾病的主要病原体，在抗生素滥用的选择压力下，海洋环境中出现了大量的耐药细菌，给人类健康带来了潜在且无法估计的新威胁，因此，多种致病性细菌的同时、快速、灵敏、特异的诊断是有效预防感染性疾病发生，控制其暴发性传播的前提和关键。虽然PCR及其衍生技术能够实现致病性细菌的快速、灵敏诊断，但是一次只能同时检测一种致病性细菌，与之相比，基因芯片技术具有高通量、平行性、微型化、自动化等显著优点，该技术的出现为致病性细菌的分子诊断提供了有力的技术支撑。
目前国内外许多学者都已经将基因芯片技术应用到临床以及食品安全等多个研究领域。我国自1997年开始了解生物芯片技术，1998年正式进入芯片研究，现全国已有20多家科研机构和公司从事生物芯片的研发。目前与致病性细菌检测相关的基因芯片研究获得长足进展，已申请的专利包括“食源性致病菌快速检测基因芯片及其应用”、“炭疽菌诊断基因芯片的制备及应用”、“泌尿生殖道炎症病原体和耐药性集成诊断基因芯片及方法”等上百种。然而由于海水中杂质较多、致病性细菌种类繁多，且检测靶位易突变，给该方法的应用带来一系列困难，造成该方法尚未在海洋环境检测领域得以应用。
目前，基因芯片对应的探针靶定区域通常选择致病性细菌的16S rDNA序列、23S rRNA序列和16S rRNA-23S rRNA基因。16S rDNA序列因具有高度保守性，已成为细菌种属鉴定最常用的序列，但由于其高度保守性，因而不能很好的鉴别相近种或同一种内的不同菌株；而23S rRNA序列目前被报道的比较少，我们常常无法获取需要的序列；16Sr RNA-23Sr RNA基因区间由于其可用于鉴别相近种，或同一种内的差异，而被广泛应用，但对于只有一个或两个操纵子拷贝的细菌而言，不能利用16S rRNA-23S rRNA的基因区间序列进行探针的设计，因此，为保证其特异性，需要选择合适的特异性的靶基因进行引物设计。
目前基因芯片对应的探针种类主要有两种，一种是进行氨基修饰的长度在20-40mer的探针，另一种是不进行氨基修饰的60-70mer的探针。以往的研究多采用的是短探针。短探针可用来检测单个碱基的不同，提高检测的特异性，需点制在醛基基片上；而长探针不需要检测到单个碱基的差异，当考虑到不同个体之间的核酸碱基多态性时，可选择设计此类探针，该类探针需点制在氨基基片上。与短探针相比，长探针具有更好的特异性和均一的退火温度(Tm值)，被证明在灵敏度和特异度两方面表现更佳，此外还能兼顾信号强度，但是以往的 研究多采用短探针。
发明内容
本发明以浴场海水中对人类危害较大的6种致病性细菌为研究对象，旨在建立浴场海水致病性细菌的基因芯片检测方法，科学合理的确定其反应条件的最优化，并克服海水环境复杂的缺点，保证检测的特异性。建立其基因芯片的检测方法。本发明所采用的技术方案是：
一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法，该检测方法的步骤为：
第一步：致病性细菌及其靶基因的确定。根据国内外大量的文献报道以及本研究前期大量的调查研究为基础，确立了浴场海水中常见的、对人类危害较大的6种致病性细菌，分别为嗜水气单胞菌、大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌。
根据国内外文献确定上述各菌株的特异性靶基因。其特异性靶基因分别为：嗜水气单胞菌(A.hydrophila)的AhaI基因、大肠杆菌O157：H7(E.coliO157:H7)的hlyA、fliC、rfbE基因、肠炎沙门氏菌(Salmonella)的invA和hilA基因、单增李斯特菌(L.monocytogenes)的plc和hlyA基因、溶藻弧菌(V.alginolyticus)的hsp60基因、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的tuf基因。
第二步：6种浴场致病性细菌70-mer寡核苷酸探针及引物的设计。应用AlleleID 6.0软件设计特异基因的引物及寡核苷酸探针，并应用DNASTAR软件对其进行评价。引物和探针信息如表1和表2所示。
表1各致病性细菌的引物序列及其Tm值
表2各致病性细菌的探针序列及其Tm值
第三步：荧光标记PCR产物。PCR扩增采用20μL反应体系，
1)取5μL PCR产物至无菌洁净的0.2mL离心管中，作为模板；
2)向每个样品管加入一定浓度的带有荧光素Cy3标记的随机引物(9N)溶液3μL，并补水至19μL，震荡混匀，瞬时离心。在最佳探针浓度和最佳基因组浓度条件下，进行Cy3-随机引物浓度的确定，当Cy3-随机引物浓度为0.375μM时，能产生肉眼可见的荧光。而当Cy3-随机引物浓度为0.190μM时，荧光度值＜1000，产生的荧光极弱，说明Cy3-随机引物的最低浓度至少可达到0.375μM，为确保能产生稳定的荧光信号，本实验过程中采用的Cy3-随机引物浓度为0.75μM；
3)将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3min，立即放置冰上3min；
4)在冰上制备荧光标记反应体系Mix：5×Klenow Buffer 2.5μL，klenow酶1μL，dNTP(2.5mM)2.5μL；
5)将步骤3)样品管瞬时离心，并向各管中加入6μL荧光标记反应体系Mix，震荡混匀，瞬时离心；
6)将离心管放入PCR仪，进行荧光标记扩增，荧光标记反应程序为：37℃ 1.5h，70℃ 10min。
7)程序结束后，将样品置于冰上，然后进行芯片杂交。为确定最佳的紫 外交联时间，在紫外照射能量为2400mJ条件下，分别照射0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h，紫外交联1h时，即可产生肉眼可见的荧光信号，荧光信号值为5808，而交联0.5h时，荧光值为＜1000。因此确定当紫外照射能量为2400mJ时，最低紫外交联时间为1h，为确保实验的能产生稳定荧光信号，本实验采用的紫外交联时间为2h；
第四步：制备基因芯片。采用喷点式芯片点样系统点样仪，以及Nano-tip A070-401点样针进行点样。将一定浓度的探针与点样液等体积混合，然后用移液枪将其混合物加入384孔板，按照设定好的参数将探针点到氨基化玻片上，每个点重复三次。点样时要注意保持湿度为70％，点样时除放芯片之外，还要放一张感应试纸(用于观察点样效果)。点样完毕后，将点好的芯片取出，关闭仪器。将点制好的芯片放入紫外灯下交联一定的时间，然后用0.5％的SDS冲洗2min，用离心机甩干后，放入4℃冰箱避光保存备用。通过设置探针浓度梯度，发现探针浓度为1μM到16μM都可以检测到荧光信号，而探针浓度为0.5μM时，荧光度值＜500，荧光信号很微弱，因此我们确定探针的最小终浓度为1μM，为确保实验的经济合理且顺利进行，实验过程中我们采用能产生较强稳定荧光信号的探针浓度2μM；
第五步：杂交。将杂交buffer放到50℃水浴锅中预热，然后配置20μL的杂交液：
4×杂交缓冲液 5μL
荧光标记产物 15μL
杂交液配好后，95℃变性3min，立即放置冰上，然后放入沸水中煮沸2min后，立即放入预冷的无水乙醇中1min，用低速离心机将芯片甩干。然后将该芯片对应的感应试纸放于芯片下面，按照感应试纸上矩阵的排列方式。避光条件下，用移液枪取15μL的荧光标记产物和5μL的阳控混合均匀后加入芯片点样区，然后盖上盖玻片，然后将此芯片放入65℃水浴锅中水浴2h或过夜；
第六步：芯片清洗及扫描。取出上一步的芯片，用自来水冲洗半分钟，再用蒸馏水冲洗一次，然后分别用42℃预热过的洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别洗脱2min，洗液Ⅰ是用10mL 20×SSC(175.3g氯化钠，88.2g柠檬酸钠，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0)和4mL 10×SDS(10g二十烷基磺酸钠加入双蒸水100mL制成)加入186mL蒸馏水混匀制成；洗液Ⅱ是用2mL 20×SSC加入198mL蒸馏水混匀制成；洗液Ⅲ是用1mL 20×SSC加入199mL蒸馏水混匀制成，然后将芯片离心甩干。用生物芯片扫描仪扫描芯片，并输出荧光值，然后用软件分析所得数据。
本发明的探针分别根据嗜水气单胞菌的AhaI基因、大肠杆菌O157：H7的hlyA、fliC、rfbE基因、肠炎沙门氏菌的invA、hilA基因、单增李斯特菌的plc、hlyA基因、溶藻弧菌的hsp60基因和金黄色葡萄球菌tuf基因而设计的特异性的探针，每种致病性细菌设计了1-3条 探针，其长度约为70-mer。
鉴于现有探针技术存在的问题，在探针设计时采取了两种措施：一、为保证物种的特异性，每种致病性根据其特异性的靶基因设计引物，为保证检测的准确性，每种致病性细菌设计了1-3条探针；二、为明显提高芯片的稳定性和可重复性，设计了70-mer的长探针。
本发明的有益效果是：本发明提出一种高通量、灵敏、特异浴场海水致病性细菌的快速检测方法。本发明针对浴场这一复杂的海洋环境，采取了以下措施提高了基因芯片技术检测的特性：首先，本发明采用了特异性高的特异靶基因设计引物；其次，为提高检测的特异性，每种致病性细菌设计了1-3条特异性探针；再次，为了增加检测的重复性和稳定性，设计了70-mer的长探针。本发明建立基因芯片的方法可以同时在一个芯片上反映6种浴场海水中主要致病性细菌的污染信息，大大减少了工作量，可在短时间内全面掌握海水浴场的环境现状与变化趋势，为指导公众用海、保障公众健康、科学管理浴场的服务功能、促进海滨浴场经济的可持续发展提供了重要的科学依据。
附图说明
图1为本发明的探针最佳浓度确定的扫描结果，其中，第一列、第二列(除第一行外)、第三列(除第一行外)分别代表的阳控、阴性对照和空白对照；
图2为本发明的Cy3-随机引物浓度的确定实验的结果；
图3为本发明的紫外交联时间确定的结果；
图4为大连星海浴场表层海水中嗜水气单胞菌检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
结合附图1至图4及具体实施案例进一步阐明本发明。需理解，以下实施方式仅用于解释本发明，而不限制本发明的适用范围。下列实施方式中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作。
以大连星海浴场为例，将上述建立的方法进行应用。在距岸100m处采集浴场表层海水1000mL，设置4个平行点，分别标记为星1、星2、星3和星4，用0.22μm孔径的硝酸纤维素滤膜过滤，然后用传统的TCAB法提取核酸，然后进行基因芯片检测：
荧光标记PCR产物
采用20μL反应体系，即10×PCR缓冲液(含MgCl2)2.0μL；dNTPs(10mmol/L)0.4μL；上下游引物(10pmol/μL)各0.5μL；TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL；DNA模板1μL；ddH2O补足至20μL。
1)取5μL PCR产物至无菌洁净的0.2mL离心管中，作为模板；
2)向每个样品管加入终浓度为0.75μM带有荧光素Cy3标记的随机引物(9N)溶液3μL，并补水至19μL，震荡混匀，瞬时离心；
3)将离心后的样品管放入PCR仪，95℃变性3min，立即冰浴3min；
4)在冰上制备荧光标记反应体系Mix：5×Klenow Buffer 2.5μL，klenow酶1μL，dNTP(2.5mM)2.5μL；
5)将步骤3)样品管瞬时离心，并向各管中加入6μL荧光标记反应体系Mix，震荡混匀，瞬时离心；
6)将离心管放入PCR仪，进行荧光标记扩增，荧光标记反应程序为：37℃ 1.5h，70℃10min。
7)程序结束后，将样品置于冰上，然后进行下一步：芯片杂交。
基因芯片的制备：将2μM的探针与点样液等体积混合，然后用移液枪将其混合物加入384孔板，按照设定好的参数将探针点到氨基化玻片上，每个点重复三次。点样时要注意保持湿度为70％。点样时除放芯片之外，还要放一张感应试纸(用于观察点样效果)。将点制好的芯片放入紫外灯下交联2h，然后用0.5％的SDS冲洗2min，用离心机甩干后，放入4℃冰箱避光保存备用。
杂交：将杂交buffer放到50℃水浴锅中预热，杂交体系为20μL：4×杂交缓冲液5μL，荧光标记产物15μL，95℃变性3min，立即冰浴，然后将制备好的芯片，放入沸水中煮沸2min后，立即放入预冷的无水乙醇中1min，用低速离心机将芯片甩干。然后将该芯片对应的感应试纸放于芯片下面，按照感应试纸上矩阵的排列方式，在芯片上贴上胶条。然后避光条件下，用移液枪取15μL的荧光标记产物和5μL的阳控混合均匀后加入芯片点样区，然后盖上盖玻片。然后将此芯片放入65℃水浴锅中水浴2h。取出芯片，用自来水冲洗半分钟，再用蒸馏水冲洗一次，然后分别用42℃预热过的洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别洗脱2min，洗液Ⅰ是用10mL 20×SSC(175.3g氯化钠，88.2g柠檬酸钠，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0)和4mL 10×SDS(10g二十烷基磺酸钠加入双蒸水100mL制成)加入186mL蒸馏水混匀制成；洗液Ⅱ是用2mL 20×SSC加入198mL蒸馏水混匀制成；洗液Ⅲ是用1mL20×SSC加入199mL蒸馏水混匀制成，然后离心甩干。用GenePix 4000B生物芯片扫描仪，扫描芯片，并输出荧光值，然后用软件分析所得数据。
结果判定：经基因芯片检测，在大连星海浴场的2号站位，嗜水气单胞菌为阳性，该站位的其他5种致病性细菌与其他站位6种致病性细菌检测结果均为阴性，该检测结果与普通PCR检测结果完全一致。