技术领域
本发明属于药物及日化领域，具体涉及一种新多肽PAP1及其应用。
背景技术
组织创伤后的愈合过程是各种修复细胞增殖、分化、迁移和凋亡的过程。炎症、溃疡、烫伤、创伤、手术以及先天性畸形等多种急慢性损伤可引起大面积皮肤缺损、难愈性溃疡和疤痕，并引发许多局部与全身系统的反应，其危害十分严重。多肽药物在促进创面愈合、预防疤痕及治疗慢性溃疡方面具有独特的优势。其中表皮生长因子(hEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等多肽具有明显的修复创伤、护肤、抗皱和防衰老作用，但它们的制备成本高、稳定性较差，限制了其应用。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种新多肽PAP1。
本发明的另一目的在于提供上述新多肽PAP1的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种新多肽PAP1，其结构如式I所示：
H-Ser-Ser-Pro-Tyr-Thr-Ser-Gly-Pro-His-Pro-Gly-Val-Val-Tyr-OH 式I；
所述的新多肽PAP1的制备，可采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪按常规固相合成方法进行化学合成，也可以通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到表达载体中进行生物合成；
所述的新多肽PAP1在制备促进组织修复或改善皮肤美感的产品中的应用；
优选的，所述的新多肽PAP1在制备治疗创伤、烫伤、溃疡或改善皮肤美感的产品中的应用；
所述的产品优选为药品、化妆品或日化用品；
所述的药品、化妆品或日化用品中含有有效剂量的多肽PAP1，余量为辅料或其它可配伍的药物；
所述的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂等；
所述的其它可配伍的药物，是指其它天然药物、化学药物或生物药物；
所述的药品、化妆品或日化用品可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、脂质体纳米粒、控释剂、凝胶膏剂、软膏剂、外用搽剂、贴剂(例如面膜)、霜剂(例如面霜)、洗涤剂(例如香波、香皂、泡沫浴或浴盐)、乳液、凝胶、爽肤水等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明合成了一种新多肽PAP1，其结构如式I所示。
(2)本发明提供的新多肽PAP1在较低浓度(1.56～3.13μg/mL)下即可促进小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和人永生化表皮细胞的迁移，具有促进组织修复作用。
(3)本发明提供的新多肽PAP1结构稳定，可用于治疗消化道溃疡、口腔溃疡，并具有美白，去除皱纹、疤痕和色斑作用。
(4)本发明提供的新多肽PAP1的毒性较低，在口服200mg/kg剂量下未观察到明显的毒副作用。
(5)本发明提供的新多肽PAP1容易合成，易于大量制备。
附图说明
图1是新多肽PAP1的1H NMR谱图。
图2是新多肽PAP1的13C NMR谱图。
图3是新多肽PAP1的高分辨率质谱图。
图4是新多肽PAP1对Balb/c 3T3细胞增殖影响的结果分析图。
图5是新多肽PAP1对Hacat细胞水平迁移影响的结果分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 新多肽PAP1的合成
采用全自动多肽合成仪常规固相合成方法，经过树脂溶胀、脱保护、洗涤、氨基酸溶解、氨基酸活化、缩合过程，完成新多肽PAP1的合成(委托合肥国肽生物科技有限公司合成)。
实施例2 多肽PAP1的结构鉴定
实施例1制得的新多肽PAP1为白色粉末；UV(MeOH)λmax(logε)205(3.85),224(1.61),279(0.12)nm；IR(KBr)νmax 3300,2968,2889,1664,1537,1447,1205,1132,801,722cm-1；HR-ESI-MS m/z 1447.6919[M+H]+(C66H94N16O21,计算值1447.6852)。氢谱(1H NMR)和碳谱(13C NMR)数据见表1(由2D-NMR归属)。氨基酸测序结果为：H-Ser-Ser-Pro-Tyr-Thr-Ser-Gly-Pro-H is-Pro-Gly-Val-Val-Tyr-OH。其1H,13C NMR图谱见图1～2；高分辨率质谱见图3。根据以上理化和光谱数据，鉴定出PAP1的化学结构，如式I所示。
表1 PAP1的1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR数据
a)Measured at 500MHz.b)Measured at 125MHz.c)Overlapped signals were reported without designating multiplicity.
实施例3 新多肽PAP1对Balb/c 3T3细胞增殖的促进作用
将处于对数生长期的细胞(Balb/c 3T3细胞株，购自美国模式培养物集存库American Type Culture Collection，ATCC)用胰酶消化、离心、重悬后进行细胞计数，按3000个细胞/孔接种于96孔板中，轻拍至细胞分散均匀，PBS封闭。37℃、5％CO2培养过夜。弃培养基，加入含体积分数0.5％FBS的饥饿培养基处理24h，使细胞同步化；弃饥饿培养基，加入完全培养基配置不同浓度的多肽PAP1(实施例1制得)，37℃、5％CO2培养箱孵育48h。按10μL/孔加入CCK8试剂，37℃孵育3h，酶标仪450nm、630nm双波长检测。计算细胞存活率，重复实验至少3次以上；
试验结果如图4所示，PAP1在较低浓度(1.56～3.13μg/mL)下对Balb/c 3T3细胞具有显著的促增殖作用，且其活性强于市售药物康复新液。
实施例4 新多肽PAP1对Hacat细胞迁移的促进作用
将对数生长期的HaCAT细胞(购自美国模式培养物集存库American Type Culture Collection,ATCC)，胰酶消化，重悬，按1×106个/孔接种到12孔板，置37℃，5％CO2培养箱内培养至细胞长满培养孔。吸弃培养液，PBS洗涤，用无菌枪头在每个试验孔中央垂直于培养孔自上而下划线。用PBS洗去划痕产生的细胞团，使划痕边缘整齐。加入新鲜培养基以及PAP1(0.80μg/mL)(实施例1制得)，显微镜下拍照，继续置于细胞培养箱中培养。每隔12个小时观察记录，所得图像数据用Image Pro Plus 6.0处理。在划痕每侧边缘均匀选取30个点，取其中线代表划痕边缘，测量划痕间距，并用以下公式计算划痕修复率：划痕修复率＝(0h划痕宽度-不同时间点划痕宽度)/0h划痕宽度。
试验结果显示，PAP1组HaCAT细胞的迁移率高达93％(72小时)，明显高于对照组59％(72小时)(图5)，说明新多肽PAP1能够明显促进HaCAT细胞的水平迁移。
实施例5 新多肽PAP1对小鼠皮肤创伤的修复作用
选取40只8～10周雄性昆明小鼠(购自广东省动物中心)分笼饲养，自由取食，实验前一天停止进食。用质量分数1％戊巴比妥钠0.2mL腹腔注射麻醉小鼠，背部剪毛，脊柱表皮皮肤上下对称开0.5cm×0.5cm正方形伤口，剪去全层皮肤，勿伤及肌肉层，伤口止血备用。次日，乙醚麻醉小鼠，伤口滴加不同溶度的PAP1(0.1mg/mL或0.2mg/mL)、生理盐水和康复新液各0.1mL，每日换药一次。于3、5、10天观察创面愈合情况。先将创面面积描绘在透明薄膜上，再以此为模板，将质地均匀的硬纸片剪成同样大小，然后用分析天平称质量。以硬纸片质量间接地表示创面面积大小。按公式计算创面愈合率：创面愈合率(％)＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积。结果见表2。
表2 小鼠创伤愈合率统计结果
注：与模型组相比，**P＜0.01有显著性差异
试验结果表明，新多肽PAP1能够明显促进小鼠皮肤创伤的愈合，与对照组比较具有显著性差异，且优于康复新液。
实施例6 新多肽PAP1对小鼠皮肤烫伤的修复作用
选取40只8～10周雄性昆明小鼠(购自广东省动物中心)分笼饲养，自由取食，实验前一天停止进食。用质量分数13％Na2S溶液涂抹脱毛，将20g的砝码置于水浴锅内一同加热至沸，维持10min，然后用钳子夹住砝码上端，迅速放在小鼠皮肤上5s，稍加压力，形成烫伤面积为2cm×2cm的浅Ⅱ度烫伤模型。次日，伤口滴加不同溶度的PAP1(0.1mg/mL或0.2mg/mL)、生理盐水和康复新液各0.1mL，每日换药一次。于3、5、10天观察创面愈合情况。按实施例5的方法计算创面愈合率。结果见表3。
表3 小鼠烫伤愈合率统计结果
注：与模型组相比，**P＜0.01有显著性差异
试验结果表明，新多肽PAP1能够明显促进小鼠皮肤烫伤的愈合，与对照组比较具有显著性差异，且优于康复新液。
实施例7 新多肽PAP1对大鼠应激性胃溃疡的保护作用
试验方法：取体重180～210g雄性SD大鼠50只(购自广东省动物中心)，随机分为空白组、模型组、硫糖铝组(1g/kg，阳性药组)、低剂量组(PAP1 1mg/kg)和高剂量组(PAP1 2mg/kg)。给药组灌胃给药，连续7天。造模前24h禁食不禁水，除对照组外，采用束缚水浸法造模，将各组大鼠固定于鼠板，头向上垂直浸泡在恒温(20℃)水槽中8h，水面与大鼠剑突齐平。应激造模结束后，将大鼠颈椎脱臼处死，剖腹，结扎幽门。向胃内灌注体积分数10％甲醛溶液2mL，结扎贲门，取出胃体置于甲醛溶液中固定15min。沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗后展开，观察胃黏膜损伤并计算胃溃疡指数。按Guth标准计算溃疡指数(UI)：点状出血计为1分，线状出血长度<1mm为2分，1～2mm为3分，2～4mm为4分，>4mm为5分，宽度>1mm时分值×2。结果见表4。
表4 大鼠溃疡指数统计结果
注：与模型组相比，**P＜0.01有显著性差异
试验结果表明，新多肽PAP1对大鼠应激性胃溃疡具有明显保护作用，与模型组比较具有显著性差异，其保护效果优于阳性药硫糖铝。
实施例8 新多肽PAP1对大鼠口腔溃疡的保护作用
试验方法：取体重180～210g健康SD大鼠40只(购自广东省动物中心)，随机分为模型组、阳性药组(康复新液)、低剂量组和高剂量组，采用化学灼烧法造模。向内径0.4cm、长3cm的玻璃管中注满体积分数80％冰醋酸，一端塞入棉花，将棉花端于大鼠下唇黏膜表面垂直固定5秒，使局部有红晕和水肿，24小时后观察，出现溃疡并重度充血、水肿，溃疡面直径＞3mm者即造模成功。实验组、模型组和阳性药组的溃疡面分别滴加不同溶度的PAP1、生理盐水和康复新液各0.1mL，每日给药一次。于1、2、3天后观察溃疡面愈合情况。溃疡积分标准如下：无充血、水肿溃疡面直径＜1mm记1分；轻度充血、水肿，溃疡面直径1～2mm记2分；中度充血、水肿，溃疡面直径2～3mm记3分；重度充血、水肿溃疡面直径＞3mm记4分。结果见表5。
表5 大鼠口腔溃疡愈合积分
注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01
试验结果表明，新多肽PAP1能够明显促进大鼠口腔溃疡的愈合，与模型组比较具有显著性差异，且优于康复新液。
实施例9 新多肽PAP1的急性毒性实验
试验方法：取体重18～22g的昆明种小鼠(购自广东省动物中心)，随机分组，每组10只，灌胃不同剂量的多肽PAP1，根据小鼠存活情况，计算半数致死剂量LD50。半数致死量按如下公式计算：半数致死剂量(mg/kg)＝(小鼠一半死亡时的剂量/对应小鼠的体重)。
试验结果：多肽PAP1在200mg/kg的给药剂量下，未观察到小鼠死亡，说明它的毒性较低，LD50大于200mg/kg(表6)。
表6 PAP1对小鼠的急性毒性作用
实施例10 新多肽PAP1的皮肤安全性评价
受试人群：年龄18～50岁之间，女性18人，男性12人，总计30人。受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准。
试验方法：选用合格的斑贴器，以封闭式斑贴试验方法，将多肽PAP1约0.020～0.025mL(2mg/mL)滴于斑贴器内，外用专用胶带贴覆于受试者背部，24小时后去除试验品，分别于去除后0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。
试验结果：本试验30名受试者通过斑贴试验，在0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，均未观察到皮肤不良反应，说明本发明的新多肽PAP1对皮肤使用安全。
实施例11 片剂的制备
多肽PAP1 0.1g，乳糖40g，淀粉浆60g，硬脂酸镁0.2g，混合，过筛，干燥后压片。每片含PAP1 0.001g。
实施例12 注射剂的制备
多肽PAP1 0.1g，丙二醇50g，研磨，再加100mL注射用水稀释，混匀，然后加入氯化钠9g，溶解后再加入注射用水至1000mL，调pH值5.5～6.5，滤过，灌封，灭菌，即得1000支注射用针剂。
实施例13 固体脂质纳米颗粒的制备
多肽PAP1 0.1g，大豆卵磷脂500mg，溶于25mL乙醇中，另取硬脂酸200mg和大豆卵磷脂500mg溶于25mL环己烷中，混合搅拌均匀；于37℃恒温水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，使药物及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽有机溶剂；另取聚乙二醇单硬脂酸酯3750mg，搅拌溶解在175mL水中，加入上述薄膜中，超声10min，定容至250mL，得淡黄色透明溶液；将此溶液冷冻干燥可得冻干粉。用球磨机研磨24小时，制得粒径均匀的纳米粒，混匀并分装。每袋含PAP1 0.001g。
实施例14 控释胶囊的制备
多肽PAP1 0.1g，乳糖40g和淀粉浆10g，直接装到旋转制粒机/包衣器制备颗粒，将稀释到质量分数为15％固体的塑化乙基纤维素包衣剂悬浮液喷雾到多肽颗粒的旋转床上。在喷雾期间，用泊洛沙姆188制成的分散体载体膜包衣颗粒，形成平均颗粒度大约为450μm的持续释放的颗粒。混匀装入胶囊，每个胶囊含PAP1 0.001g。
实施例15 外用凝胶膏剂的制备
称取甘油2g，依次加入聚丙烯酸0.75g和氢氧化铝0.1g，充分混合，加入PAP1 0.01g，在真空条件下充分搅拌混合得①；另外称取纯化水5g，将乳酸0.06g、羧甲基纤维素钠0.1g溶解在水得②；将②加入到①中，在真空条件下充分搅拌，经交联反应得到含药膏体，将含药膏体涂布(控制含药膏体层厚度在1.0mm左右)，裁剪成常规贴膏剂的规格，每贴含药物的量为0.001g，晾干，包装。
实施例16 软膏剂的制备
硬脂醇20g与白凡士林21g在水浴中熔化，加热至75℃，备用。十二烷基硫酸钠1.46g，羟苯甲酯0.025g，羟苯丙酯0.015g，丙二醇10g，PAP1 0.05g依次溶于水中，加热至75℃，将75℃硬脂醇与白凡士林加入，搅拌至冷，制成含PAP1 0.05％的软膏剂。
实施例17 外用搽剂的制备
取PAP1 0.025g，溶解于45mL蒸馏水中，过滤，滤液加入甘油5mL，氮酮1mL，蒸馏水补足体积至50mL，制成含PAP1 0.05％的外用搽剂。
实施例18 面霜的制备
将26号白油1g，十六十八醇1g，硬脂酸1g，单甘脂0.5g，350硅油0.05g，GTCC 0.5g，尼泊金甲酯0.03g混合，加热到90℃，制成第一半成品；在第一半成品中加入去离子水4g、PAP1 0.005g、平平加-20 0.3g、甘油0.5g，并加热到80℃，形成第二半成品；将第二半成品在80℃下进行2次均质(转速3000转/分钟，时间10分钟)后继续搅拌30分钟，冷却到45℃形成膏霜状后加入0.005g卡松，混匀，得到含0.05％PAP1的面霜。
实施例19 面膜的制备
将PAP1 0.01g溶解于10mL去离子水中，过滤，滤液与甘油润湿的卡波姆0.3g混合，加入三乙醇胺，调节pH值为6～7，均匀涂布于面膜纸，制成每张含有PAP1 0.001g的面膜。
实施例20 爽肤水的制备
将0.01g PAP1配置为0.02mg/mL的水溶液；将甘油5g加入透明质酸1g中分散，加水溶解，搅拌均匀，得透明质酸溶液；将海藻糖1g和尿囊素1g用水溶解后与上述透明质酸溶液混合，搅拌均匀，得混合溶液；将多肽溶液、D-泛醇1g、燕麦β-葡聚糖10g、1,2-戊二醇10g和防腐剂0.05g依次加入上述混合溶液，加水搅拌均匀，即得爽肤水。
实施例21 乳液的制备
(1)将0.01g PAP1配置为0.02mg/mL的水溶液；
(2)将0.05g透明质酸钠加水溶解分散，搅拌均匀，得透明质酸溶液；
(3)将甘油5g、丁二醇3g、海藻糖2g、尿囊素0.2g、增稠剂0.1g，用水溶解，加热至75℃；
(4)将霍霍巴籽油2g、氢化聚癸烯3g、聚二甲基硅氧烷2g、辛酸/癸酸三甘油酯3g、乳化剂3g加热至75℃，搅拌均匀；
(5)将步骤(3)制得的产物快速倒入步骤(4)制得的产物中，恒温均质3～5min，冷却；
(6)冷却至60℃以下，加入(1)、(2)，均质；冷却至40℃以下，加入防腐剂和香精，即得乳液。
实施例22 洁面啫喱的制备
将0.01g PAP1配置为0.02mg/mL的水溶液；将上述多肽溶液、甘油2.5g、癸基葡糖苷3g、椰油酰苹果氨基酸钠3g、月桂醇聚醚硫酸酯钠1.5g、增溶剂0.1g、香精0.05g依次加入水中搅拌，再加入增稠剂0.5g，搅拌至完全溶胀即可得洁面啫喱。
实施例23 多肽PAP1乳液的美容效果评价
1.1试验品：本发明实施例21制备的多肽乳液
1.2受试人群：年龄18～55岁之间，女性20人，男性10人，总计30人。受试者皮肤有皱纹，色斑，色泽暗哑，以及皮肤上留有微创、手术后疤痕等不美观因素。
1.3测试方法：受试者皮肤清洁后，将实施例21制备的乳液涂覆到皮肤上，观察和感受使用效果。
1.4测试评估结果如表7：
表7 多肽PAP1乳液的试用(8周)反馈总结表
受试者表示，使用多肽PAP1乳液产品，可提高肌肤含水量，增强肌肤保湿力和皮肤弹性，提高肌肤水嫩润泽感。该产品具有美白，去皱纹、疤痕和色斑的效果。受试者未出现过敏现象。
实施例24 多肽PAP1面膜的美容效果评价
1.1试验品：本发明实施例19制备的PAP1多肽面膜
1.2受试人群：年龄18～55岁之间，女性22人，男性8人，总计30人。受试者脸部皮肤有皱纹，色斑，色泽暗哑，以及皮肤上留有微创、手术后疤痕等不美观因素。
1.3测试方法：受试者脸部清洁后，将实施例19制备的PAP1面膜涂覆于面部，每日一次，观察和感受使用效果。
1.4测试评估结果如表8：
表8 PAP1多肽面膜的试用(8周)反馈总结表
受试者表示，使用PAP1多肽面膜产品，可提高肌肤含水量，增强肌肤保湿力和皮肤弹性，提高肌肤水嫩润泽感。产品具有美白，去皱纹、疤痕和色斑的效果。受试者未出现过敏现象。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。