一种构建哺乳动物克隆胚的方法及人类克隆胚的构建 本发明是一种构建哺乳动物克隆胚的方法，涉及动物细胞核移植、动物细胞的融合及动物细胞的遗传改造等，适用于包括人类在内的哺乳动物核移植胚、也就是克隆胚的构建以及涉及核移植技术的动物克隆和人类治疗性克隆等方面的研究和应用。
20世纪80年代以来，哺乳动物核移植技术发展迅速，先后有多种动物的胚胎细胞、胎儿细胞克隆后代出生，1996年以后，绵羊、小鼠和牛等动物的成体细胞也先后被成功克隆。克隆动物的出生不但具有重大的理论意义，在优良动物的繁殖、濒危动物的保存及人类治疗性克隆等方面的应用价值也十分巨大。
利用显微注射的方法或细胞融合的方法将供体细胞的细胞核移植到去掉细胞核的受体细胞内，再对移植了供体细胞核地受体细胞进行适当处理和培养，发育而成的胚胎即为克隆胚。将克隆胚移植到代孕母体子宫内发育而出生的动物即为克隆动物。因此，构建克隆胚时，需先对受体细胞进行去核，去核前一般需用细胞松弛素对受体细胞进行处理。
目前克隆哺乳动物所用的受体细胞，一般是处于第二次减数分裂中期的卵母细胞(MII)，MII卵母细胞的特性存在种属差异。由于处于第二次减数分裂中期的卵母细胞(MII)的细胞核没有核膜，细胞核以纺锤体的形式存在，大多数动物MII卵母细胞的细胞核都无法在普通光学显微镜下观察到。卵母细胞在成熟过程中进行第一次减数分裂，排出第一极体，MII卵母细胞的细胞核一般位于细胞的周边部位，并与第一极体邻近。针对MII卵母细胞的特点，目前对MII卵母细胞进行去核一般采用下列方法：
1、小鼠的MII卵母细胞胞质较为透明，其细胞核在相差显微镜下清晰可见，因而可在相差显微镜下将其细胞核连同少量细胞质一同去掉。大多数动物的卵母细胞细胞不适合用该方法去核。
2、对于大多数动物的MII卵母细胞，由于观察不到细胞核，考虑到其细胞核一般与第一极体邻近，对其去核时可将极体连同极体附近的细胞质一同去掉，去掉的细胞质通常约1/3。由于实际上极体的位置不一定与MII卵母细胞的细胞核邻近，这一方法并不能保证去核成功。即使去核成功，由于去核时去掉的细胞质较多(1/3或更多)，一些重要的细胞因子也可能去掉，这可能影响克隆胚的发育。
3、为克服方法2的缺点，在对MII卵母细胞进行去核之前，可用DNA荧光染料对卵母细胞进行染色，然后在荧光显微镜的紫外线照射下进行去核操作。荧光染料受紫外线的激发可发出可见的荧光，与DNA结合可以指示细胞核的位置。该方法也需去掉较多的细胞质，所用的荧光染料和荧光显微镜的紫外线对MII卵母细胞有一定损害(如对线粒体DNA的损伤)，这些损害有可能影响克隆胚的发育。
上述方法的缺点是：①去核发生在移核之前，经过去核处理的卵母细胞为非正常状态细胞，也就是在供体核进入受体细胞之前，受体细胞已处于非正常状态。②不能保证去核成功。③去核时去掉了较多的细胞质，因而去掉了一些可能对克隆胚发育必需的细胞因子。④去核时所用的荧光染料和紫外线对卵母细胞有损伤，克隆胚的发育可能因此而受到影响。目前克隆技术的成功率不到5％，克隆胚、克隆动物胎儿和新生克隆动物的死亡率均较高，这些缺点可能是原因之一。
本发明的目的在于克服以上缺点，建立一种在几乎不去掉细胞质的情况下，既能保证去核，又可避免DNA荧光染料和紫外线对卵母细胞损伤的克隆方法。
本发明的技术方案和内容包括：
1、细胞核移植：即将供体细胞核移植到成熟卵母细胞(MII)内，移植了供体核的卵母细胞内存在供体细胞核和卵母细胞核两个核。移核时，应将供体细胞核移植到离卵母细胞核较远的位置(与极体相对的位置)。核移植的方法有显微注射法和细胞融合法，可根据动物种属不同和实验需要而定。
2、卵母细胞培养：对移植了供体细胞核的卵母细胞进行一定时间的培养，使供体细胞核与卵母细胞质相互作用，培养时间的长短可根据动物种属不同和实验需要而定。
3、卵母细胞激活：卵母细胞培养一段时间后，即可对卵母细胞进行激活处理，并对激活或处于激活处理过程中的卵母细胞进行培养。在激活处理和培养过程中，供体细胞核和卵母细胞核将分别发生原核样变化，形成原核样核，此过程与正常受精过程中雌原核和雄原核的形成相似。培养过程中应定期观察卵母细胞是否有原核样核形成。激活的方法有物理方法和化学方法，可根据动物种属不同和实验需要而定。
4、去除雌原核：原核样核形成后，在两个原核样核相互靠近和融合之前，用内径与原核样核大小相近的玻璃微管将离极体较近的原核样核吸掉，该原核样核为雌原核(由卵母细胞核形成)的可能性较大，而另一原核样核为供体细胞核形成的可能性较大。如果只形成一个原核样核，而该原核样核与极体极为接近，则其为雌原核的可能性很大，可将其去掉，而不必等另一原核样核形成。去掉雌原核的卵母细胞内只剩下供体细胞核。
5、胚胎培养：对去掉雌原核而只剩下供体细胞核的卵母细胞在适当条件下进行培养，经培养发育而成的胚胎即为克隆胚。
本发明区别于其他克隆技术的特征及优点在于：①由于在卵母细胞去核前将供核移入卵母细胞内，因而保持了正常的卵母细胞质环境，这对供核的重编程序可能有利，从而有利于克隆胚的发育。②由于在出现原核样核时对卵母细胞去核，细胞核清晰可见，且有核膜存与在，因而去核干净彻底，避免了因卵母细胞去核不彻底而造成克隆胚的染色体异常。③去核时去掉的细胞质极少，避免了因去掉过多细胞质及细胞质内的因子而影响克隆胚的发育。④避免了DNA荧光染料和紫外线对卵母细胞的损伤。
现结合附图(图1为显微注射法核移植过程中的一种状态。图2和图3分别为细胞融合法核移植过程中的一种状态。图4为去核过程中的一种状态。)，以人类克隆胚的构建为例，对本发明的实施进行介绍：
1、卵母细胞的准备：用含160IU/ml透明质酸酶的HTF培养基去掉包裹于卵母细胞外的颗粒细胞和放射冠细胞。
2、核移植：①显微注射法：如图1所示，在显微镜下，利用显微操作器通过负压用固定针(1)吸住卵母细胞的透明带(2)，固定卵母细胞，使极体(3)处于固定针的相对面，偏离卵母细胞的水平轴约45度(以卵母细胞的中心为圆心)，然后用毛细玻璃管(4)将供核(5)注射到卵母细胞质内靠近固定针的位置。因卵母细胞细胞核(在光学显微镜下一般观察不到卵母细胞核)一般在极体附近，使极体偏离约45度既可使卵母细胞核(6)远离供核，又可避免注射时毛细玻璃管对卵母细胞核的损伤。 ②细胞融合法：如图2所示，将供核细胞(1)注射到卵母细胞的透明带(2)下，其所处位置与极体(3)相对。如图3所示，用电场或化学试剂处理卵母细胞，使供核细胞与卵母细胞融合，供核(1)进入卵母细胞。因供核所处位置与极体(2)相对，因而供核离卵母细胞细胞核(3)较远。
3、卵母细胞培养：用含20％血清的B2培养基将移植了供核的卵母细胞在37.5℃，含5％CO2的培养箱内培养3——5小时。
4、卵母细胞的激活：将卵母细胞转移到含10μM钙离子载体(A23187)的HTF培养基内，37.5℃保持8至10分钟，然后用不含A23187的HTF培养基洗涤三次，再用含4mM 6-DMAP(6-Dimethylaminopurine)的HTF培养基在37.5℃，含5％CO2的培养箱内培养5——7小时。6-DMAP培养到5小时时，每小时观察一次卵母细胞，注意有无原核样核出现。6-DMAP培养7小时后，如没出现原核样核，则将卵母细胞转移到含20％血清的B2培养基继续培养，并继续每小时观察一次。
5、去除雌原核：如发现出现原核样核，即将卵母细胞转移到含7.5μg/ml细胞松弛素B(CB)的HTF培养基内培养45—60分钟，然后如图4所示，用固定针(1)在与雌原核(2)[与极体(3)较近的原核]相对的位置将卵母细胞固定，并用酸性Tyrode液在靠近雌原核的透明带(4)上溶解一个小孔(5)，用内径约30μm的平头玻璃管(6)将雌原核吸掉，剩下的原核样核(7)即为供体细胞核。
6、胚胎培养：用常规体外受精(IVF)的胚胎培养方法对去掉雌原核而只剩下供体细胞核的卵母细胞进行培养，发育而成的胚胎即为人类克隆胚。