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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710553712.X (22)申请日 2017.07.08 (71)申请人 桂林理工大学 地址 541004 广西壮族自治区桂林市七星 区建干路12号桂林理工大学 (72)发明人 温心遥郝再彬李霞张杰 宋福平 (51)Int.Cl. C07C 51/42(2006.01) C07C 51/44(2006.01) C07C 51/47(2006.01) C07C 51/48(2006.01) C07C 55/10(2006.01) (54)发明名称 一种从Bt发酵液中分离纯。
2、化琥珀酸的方法 (57)摘要 本专利公开了一种从Bt发酵液中分离纯化 琥珀酸的方法。 该方法包括八个步骤： (1)加入 Al2O3絮凝法去除沉淀杂质； (2)加入乙醇去除沉 淀杂质； (3)加入石油醚萃取除去上清杂质； (4) 使用大孔树脂柱吸附粗制， 解吸附； (5)无水乙醇 萃取， 加水浓缩去乙醇， 冷冻干燥； (6)乙醚萃取， 加水浓缩去乙醚 ， 冷冻干燥 ； ( 7 )使用使用 AgilentZorbaxSB-C18(9.4250mm5m)色 谱柱； (8)使用AgelaVenusilASB-C18(4.6 150mm5m)色谱柱。 两次高效液相半制备， 获 得较高纯度琥珀酸， 纯度在。
3、95以上。 权利要求书2页 说明书4页 附图2页 CN 107245032 A 2017.10.13 CN 107245032 A 1.一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法， 其特征在于整套方法由八个串联步骤组 成， 这八个步骤有先后次序， 且缺一不可； 包括(1)Al2O3去絮凝沉淀物； (2)无水乙醇去醇不 溶性沉淀物； (3)石油醚去除醚溶性上清物； (4)非极性大孔树脂对琥珀酸吸附； (5)无水乙 醇萃取， 加水浓缩去乙醇， 冷冻干燥； (6)乙醚萃取， 加水浓缩去乙醚， 冷冻干燥； (7)使用 Agilent Zorbax SB-C18(9.4250mm5 m)高效液相色谱柱半制备。
4、； (8)使用Agela Venusil ASB-C18(4.6150mm5 m)高效液相色谱柱半制备， 琥珀酸纯度在95以上； 具体步骤为： (一)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质 (1)去除絮凝沉淀物； 取10L初始发酵液， 按照1的浓度加入Al2O3， 充分搅拌后置于4 冰箱静止12小时， 取出后8000r/min离心10min， 收集上清， 用1mol/L的HCl调至pH4.0， 50 真空浓缩， 真空度-0.095至-0.088Mpa范围， 浓缩至200mL备用； (2)去除醇不溶性沉淀物； 取步骤(1)所制得的备用液体200ml， 加入200mL无水乙醇， 静 置1小时后再次离。
5、心， 8000r/min离心10min， 取上清备用； (3)去除醚溶性上清物； 取步骤(2)所制得的备用液体， 用等体积的石油醚萃取， 反复3 次， 收集下层相， 即得抗生素粗提液， 保存于4冰箱备用； (二)样品的粗制 (4)取非极性大孔树脂， 按树脂重量与步骤(3)所制得的备用粗提液体积1:2的比例混 合上样， 湿法装柱， 装入量的高度40cm， 室温静态吸附2-3小时， 先用去离子水洗脱4-6BV， 1BV为1倍柱体积， 洗脱液为未吸附相， 洗脱流速约0.5mL/min， 收集洗脱液， 减压浓缩后用去 离子水定容至原体积； (三)样品的精制 (5)取步骤(4)所制得的液体200ml， 。
6、使用冷冻干燥机， 将样品冻干， 加入400ml无水乙醇 萃取， 取上清液使用0.45 m有机系滤膜过滤后， 加水并减压蒸馏除去乙醇， 体积浓缩至 50ml， 再次使用冻干机冻干样品； (6)使用步骤(5)同样的方法， 加入乙醚萃取， 上清液过滤后减压蒸馏， 并加水除去乙 醚， 得到精制品； (四)高效液相半制备琥珀酸 (7)第一次半制备； 取步骤(6)所制得的液体， 使用Agilent Zorbax SB-C18(9.4 250mm5 m)色谱柱， 流动相为甲醇、 超纯水， 柱温35， 紫外波长为210nm， 流速为2ml/min； 洗脱方法为： 0-10min： 甲醇:超纯水5:95； 10。
7、-15min： 甲醇:超纯水5:95梯度变为甲醇:超纯水80:20； 15-25min： 甲醇:超纯水80:20； 25-30min： 甲醇:超纯水80:20梯度变为甲醇:超纯水5:95； 30-35min： 甲醇:超纯水5:95； 多次收集6.5-7.5min组分， 减压蒸馏除去甲醇， 样品冷藏备用； (8)第二次半制备； 取步骤(7)所制得的备用液体， 使用Agela Venusil ASB-C18(4.6 150mm5 m)色谱柱， 流动相为甲醇、 超纯水， 柱温35， 紫外波长为210nm， 流速为1ml/min， 洗脱方法为: 权利要求书 1/2 页 2 CN 107245032 A。
8、 2 0-10min： 甲醇:超纯水0.2:99.8； 多次收集4-5min时间段组分， 减压蒸馏除去甲醇， 即得到了高纯度琥珀酸； 依据上述方法， 能够将琥珀酸从Bt发酵液中分离纯化出来， 且纯度高。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107245032 A 3 一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法 技术领域 0001 本发明属于分析化学、 有机化学、 生物化学领域。 具体涉及的是从Bt发酵液中分离 纯化琥珀酸的方法。 背景技术 0002 琥珀酸， 琥珀酸学名为丁二酸。 分子量为118.09， 无色结晶体， 味酸， 可燃。 有二种 晶形， 相对密度1.572(25/4)。 溶解特性： 1g。
9、溶于13ml冷水、 1ml沸水、 18.5ml乙醇、 6.3ml甲 醇、 36ml丙酮、 20ml甘油和11ml乙醚， 几乎不溶于苯、 二硫化碳、 四氯化碳和石油醚。 分子结 构如下所示： 0003 0004 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis， Bt)发酵液的上清对草生欧文氏杆菌 有明显的抑菌作用， 经过分离纯化、 核磁和质谱分析确定该抑菌物质为琥珀酸。 发酵液的上 清对草生欧文氏杆菌抑菌特性表明， 与某些Bt菌株发酵所生物合成的Zwittermicin A(简 写ZwA)特性相似。 0005 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis， Bt)晶。
10、体蛋白对害虫具有毒杀性、 同 时对人类健康不构成危害， 这一点已经被世界认可。 一方面， Bt菌剂在外源上防治虫害； 另 一方面， 该杀虫蛋白基因已经被广泛地用于转基因植物， 从内源上控制虫害。 无论哪种形 式， 由于害虫不断地进化， 导致某些害虫对某特定基因型的杀虫蛋白逐渐表现出抗性， 杀虫 效果逐渐失去意义。 解决该问题最好的方法是找到某种物质， 提高杀虫蛋白的毒力活性。 Bt 中的Zwittermicin A(简写ZwA)拥有这个特性。 张小朋等(2006)以相同的草生欧文氏杆菌 为指示菌， 利用来自于蜡状芽胞杆菌(B.cereus Bc)编号UW85的菌株发酵， 获得了ZwA， 并建 。
11、立了对ZwA的检测方法和标准曲线。 在其随后的研究中发现， ZwA协同晶体蛋白提高了对棉 铃虫害虫和甜菜夜蛾害虫的药效。 0006 参考文献： 张小朋.2006.对甜菜夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌Dl-23菌株的选育 及其发酵优化D.武汉:华中农业大学博士学位毕业论文. 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种从Bt发酵液中分离纯化琥珀酸的方法。 0008 为了实现上述的目的， 本发明的发明人进行了辛勤的研究， 将琥珀酸从Bt发酵液 中分离纯化出来， 整套方法由八个串联步骤组成。 这八个步骤有先后次序， 且缺一不可。 包 括(1)Al2O3去絮凝沉淀物； (2)无水乙醇去醇不溶性沉淀物； (3。
12、)石油醚去除醚溶性上清物； (4)非极性大孔树脂对琥珀酸吸附； (5)无水乙醇萃取， 加水浓缩去乙醇， 冷冻干燥； (6)乙醚 萃取， 加水浓缩去乙醚， 冷冻干燥； (7)使用Agilent Zorbax SB-C18(9.4250mm5 m)高 效液相色谱柱半制备； (8)使用Agela Venusil ASB-C18(4.6150mm5 m)高效液相色谱 说明书 1/4 页 4 CN 107245032 A 4 柱半制备， 琥珀酸纯度在95以上。 0009 具体步骤为： 0010 (一)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质 0011 (1)去除絮凝沉淀物； 取10L初始发酵液， 按照1的浓。
13、度加入Al2O3， 充分搅拌后置 于4冰箱静止12小时， 取出后8000r/min离心10min， 收集上清。 用1mol/L的HCl调至pH4.0， 50真空浓缩， 真空度-0.095至-0.088Mpa范围， 浓缩至200mL备用； 0012 (2)去除醇不溶性沉淀物； 取步骤(1)所制得的备用液体200ml， 加入200mL无水乙 醇， 静置1小时后再次离心， 8000r/min离心10min， 取上清备用； 0013 (3)去除醚溶性上清物； 取步骤(2)所制得的备用液体， 用等体积的石油醚萃取， 反 复3次， 收集下层相， 即得抗生素粗提液， 保存于4冰箱备用； 0014 (二)样品。
14、的粗制 0015 (4)取非极性大孔树脂， 按树脂重量与步骤(3)所制得的备用粗提液体积1:2的比 例混合上样， 湿法装柱， 装入量的高度40cm， 室温静态吸附2-3小时， 先用去离子水洗脱4- 6BV， 1BV为1倍柱体积， 洗脱液为未吸附相， 洗脱流速约0.5mL/min， 收集洗脱液， 减压浓缩后 用去离子水定容至原体积； 0016 (三)样品的精制 0017 (5)取步骤(4)所制得的液体200ml， 使用冷冻干燥机， 将样品冻干， 加入400ml无水 乙醇萃取， 取上清液使用0.45 m有机系滤膜过滤后， 加水并减压蒸馏除去乙醇， 体积浓缩至 50ml， 再次使用冻干机冻干样品； 。
15、0018 (6)使用步骤(5)同样的方法， 加入乙醚萃取， 上清液过滤后减压蒸馏， 并加水除去 乙醚， 得到精制品； 0019 (四)高效液相半制备琥珀酸 0020 (7)第一次半制备； 取步骤(6)所制得的液体， 使用Agilent Zorbax SB-C18(9.4 250mm5 m)色谱柱， 流动相为甲醇、 超纯水， 柱温35， 紫外波长为210nm， 流速为2ml/min； 洗脱方法为： 0021 0-10min： 甲醇:超纯水5:95； 0022 10-15min： 甲醇:超纯水5:95梯度变为甲醇:超纯水80:20； 0023 15-25min： 甲醇:超纯水80:20； 0024。
16、 25-30min： 甲醇:超纯水80:20梯度变为甲醇:超纯水5:95； 0025 30-35min： 甲醇:超纯水5:95； 0026 多次收集6.5-7.5min组分， 减压蒸馏除去甲醇， 样品冷藏备用； 0027 (8)第二次半制备； 取步骤(7)所制得的备用液体， 使用Agela Venusil ASB-C18 (4.6150mm5 m)色谱柱， 流动相为甲醇、 超纯水， 柱温35， 紫外波长为210nm， 流速为 1ml/min， 洗脱方法为: 0028 0-10min： 甲醇:超纯水0.2:99.8； 0029 多次收集4-5min时间段组分， 减压蒸馏除去甲醇， 即得到了高纯度。
17、琥珀酸； 0030 依据上述方法， 能够将琥珀酸从Bt发酵液中分离纯化出来， 且纯度高。 附图说明 说明书 2/4 页 5 CN 107245032 A 5 0031 图1为本发明的样品质谱图。 0032 图2为本发明的红外图谱。 0033 图3为本发明的核磁共振碳谱。 0034 图4为本发明的核磁共振氢谱。 具体实施方式 0035 实施例： 0036 本发明实施例为首次从芽胞Bt中分离纯化琥珀酸。 0037 所述方法包括以下步骤： 0038 (1)大孔树脂柱的制备。 0039 制备方法为湿法装柱。 一定量的非极性大孔树脂， 分别先后用弱酸及弱碱浸泡、 清 洗， 最后用去离子水反复清洗至中性。。
18、 树脂经过离心脱水， 之后在80恒温干燥48小时， 取 出称重备用。 取长60cm、 直径5cm的玻璃层析柱备用。 0040 (2)制备发酵液 0041 2.1初始发酵培养基： 葡萄糖20.0g； 蛋白胨20.0g； CaCl2 0.08g； K2HPO4 1.3g； MgSO4 0.2g； MnSO4 0.08g； pH 7.0-7.2， 定容至1L， 121灭菌30min备用。 0042 2.2扩大生产发酵培养基： 牛肉膏5.0g， 大豆分离蛋白4.0g； 葡萄糖3.0g； 氯化钠 2.0g； MgSO47H2O 0.3g； K2HPO4 0.3g； MnSO4 0.05g； pH7.5，。
19、 定容至1L， 121灭菌30min备 用。 0043 2.3种子培养基： 酵母膏5.0g； 蛋白胨10.0g； 氯化钠10.0g； pH 7.0-7.2； 定容至1L， 121灭菌30min备用。 0044 2.4苏云金芽胞杆菌： 编号Bt菌株。 0045 2.5菌株在种子培养中的扩增： 将保存在-20冰箱的菌种Bt取出， 放到室温复苏， 至完全解冻， 将其接种到含有种子培养基的斜面上， 30过夜培养， 取出后保存于4冰箱 备用。 0046 2.6菌株在种子培养中的活化： 从保存好的Bt斜面培养基上取0.51.0大小 的培养物接种于300mL摇瓶内， 含有种子培养基100mL， 30、 22。
20、0r/min摇床培养16-18小时。 0047 2.7初始发酵： 将活化好的菌液以2的接种量接种初始发酵培养基中， 培养基不 超过容器体积的2/3， 30摇瓶培养32-36小时， 4冰箱保存备用。 0048 (3)去除苏云金芽胞杆菌Bt发酵液中的杂质 0049 3.1去除絮凝沉淀物： 取10L初始发酵液， 按照1的浓度加入Al2O3， 充分搅拌后置 于4冰箱静止12小时。 取出后， 8000r/min离心10min、 收集上清。 用1mol/L的HCl调至 pH4.0。 50真空浓缩， 真空度-0.095至-0.088Mpa范围， 浓缩至200mL备用。 0050 3.2去除醇不溶性沉淀物： 。
21、取3.1所制得的备用液体200ml， 加入200mL无水乙醇， 静 置1小时后再次离心， 8000r/min离心10min， 取上清备用。 0051 3.3去除醚溶性上清物： 取3.2所制得的备用液体， 用等体积的石油醚萃取， 反复3 次。 收集下层相， 即得粗提液， 保存于4冰箱备用。 0052 (4)样品的粗制 0053 取非极性大孔树脂， 按树脂重量与3.3所制得的备用粗提液体积1:2的比例混合上 说明书 3/4 页 6 CN 107245032 A 6 样， 湿法装柱， 装入量的高度40cm。 室温静态吸附2-3小时， 先用去离子水洗脱4-6BV。 1BV为1 倍柱体积。 洗脱液为未吸。
22、附相， 洗脱流速0.5mL/min， 收集洗脱液， 减压浓缩后用去离子水定 容至原体积。 0054 (5)样品的精制 0055 取200ml上述液体， 使用冷冻干燥机， 将样品冻干， 加入400ml无水乙醇萃取， 取上 清液使用0.45 m有机系滤膜过滤后， 加水并减压蒸馏除去乙醇， 体积浓缩至50ml。 再次使用 冻干机冻干样品， 使用同样的方法， 加入乙醚萃取， 上清液过滤后减压蒸馏， 并加水除去乙 醚， 得到精制品。 0056 (6)高效液相半制备琥珀酸 0057 6.1第一次半制备： 取步骤(5)所制得的液体， 使用Agilent 1260Infinity， Agilent Zorba。
23、xSB-C18(9.4250mm5 m)色谱柱， 流动相为甲醇、 超纯水， 柱温35， 紫外 波长210nm， 流速2ml/min。 洗脱方法为: 0058 0-10min:甲醇:超纯水5:95； 0059 10-15min:甲醇:超纯水5:95梯度变为甲醇:超纯水80:20； 0060 15-25min:甲醇:超纯水80:20； 0061 25-30min:甲醇:超纯水80:20梯度变为甲醇:超纯水5:95； 0062 30-35min:甲醇:超纯水5:95； 0063 多次收集6.5-7.5min组分， 减压蒸馏除去甲醇， 样品冷藏备用。 0064 6.2第二次半制备： 取6.1所制得的备。
24、用液体， 使用Agilent 1260Infinity， Agela VenusilASB-C18(4.6150mm5 m)色谱柱， 流动相为甲醇、 超纯水， 柱温35， 紫外波长 210nm， 流速1ml/min。 洗脱方法为： 0065 0-10min： 甲醇:超纯水0.2:99.8； 0066 多次收集4-5min时间段组分， 减压蒸馏除去甲醇， 即得到了高纯度样品。 0067 质谱、 红外线、 核磁共振分析如下： 0068 (7)质谱检测 0069 使用Thermo公司的Q-Exactive超高分辨质谱， 样品质谱分析， 将样品溶于超纯水 中， 质量体积浓度为万分之一。 0070 使用。
25、C18色谱柱， 流动相50水+50乙腈， 进样后得到的谱图数据。 质谱为阴离子 模式。 如图1。 从图1可见， 该物质的相对分子量为118。 0071 (8)红外检测 0072 使用Nicolet iz10傅里叶变换显微红外成像光谱仪， 进行红外分析。 方法为压片 法， 如图2。 从图2可见， 在吸收频率1470cm-1处和1680-1700cm-1处均有明显峰， 该样品具有 烷基或烯基或炔基和羧基。 0073 (9)核磁检测 0074 使用Bruker 500M， 分别进行氢谱和碳谱分析， 溶剂为氘代二甲基亚砜。 碳谱(图3) 和氢谱(图4)。 从图3碳谱可见， 该物质含有甲基或烯基或炔基和羰基； 图4氢谱可见， 为- CH2-和-OH。 质谱和红外及核磁分析表明， 确定样品中C归属为CH2和CO， 存在对称结构， 结 构式为HOOC-CH2-CH2-COOH， 该物质为琥珀酸， 学名丁二酸。 说明书 4/4 页 7 CN 107245032 A 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 107245032 A 8 图3 图4 说明书附图 2/2 页 9 CN 107245032 A 9 。